Pathologie moléculaire (2)

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1 Pathologie moléculaire (2) DES d anatomie pathologique Jean-François Emile, Service de pathologie & EA4340 Hôp. Ambroise Paré, APHP & Université de Versailles SQY Analyse de l ADN tumoral Circuit d un prélèvement Sélection des blocs, contrôle histologique Extraction de l ADN Amplification de l ADN Organisation d un laboratoire de pathologie moléculaire Analyses sur l ADN

2 Pathologie : le nouveau monde Prélèvement (Pièce op./biopsie/cyto) Réception (Labo de pathologie) Diagnostic (morphologie +/- phénotype) Stockage (FFPE +/- Congélation) Relecture RCP décision thérapeutique Biologiste Moléculaire Pathologiste Désarchivage Contrôle histo +/- macrodissection Hybridation in situ et/ou Extraction ADN (ou ARN) Caractérisation des altérations Bases de données Recherche translationnelle Le point de départ Prescription (indications cliniques) Désarchivage, choix du ou des blocs Envoie à une plateforme de génétique des tumeurs

3 L analyse de pathologie moléculaire : exemple de la plate-forme OncoMolPath (AP HP) Analyse de l ADN tumoral Coupes Contrôle histologique % de cellules tumorales Macrodissection

4 Le contrôle morphologique Macroscopie : insuffisant Microscopie Le mieux : Coupes successives avec coloration des première et dernière coupes A éviter : Fragment de tissus avec contrôle histologique sur un fragment adjacent (+/- RNAlater) Macro ou microdissection La bonne gestion du prélèvement KIT DOG-1 F HES avant HES avant c.1727t>c, p.l576p R

5 Extraction des acides nucléiques à partir de prélèvements histologiques Lésions induites par le formol Dérivés hydroxyméthyl : XXX-NH-CH2-OH Ponts méthylènes entre deux fonctions amines : XXX-NH-CH2-NH-XXX Sur acides nucléiques intra- ou inter-brins Entre acides nucléiques et protéines

6 Extraction des acides nucléiques à partir de prélèvements fixés en formol Nombreux protocoles publiés ARN : en développement ADN : trois étapes principales : Déparaffinage Digestion enzymatique Purification de l ADN Extraction d ADN : le déparaffinage Pas indispensable Xylène puis alcool à dilutions croissante puis tampon aqueux Sur coupes (microdissection) : attention aux contaminations en tubes Par la chaleur : température > 56

7 Extraction d ADN : Influence de la température D après Overton et al, Cytometry 1994 Extraction ADN : Digestion enzymatique D après Diaz-Cano et al, Diagn Mol Pathol 1997

8 Purification Phénol/chloroforme/alcool isoamylique Colonnes d affinité Autres : chauffage, «salting-out», Prendre en compte : Simplicité, fiabilité, rendement, degré de pureté requis, toxicité,... Les protocoles d extraction d ADN Nombreux Très variés : Ex : 7 mn au micro-onde dans H2O Ex : 7 jours avec déparaffinage au xylène, digestion prolongée avec protéinase K et purification phénol/chloroforme. Tous les intermédiaires

9 Facteurs influant sur la qualité et la quantité d ADN obtenu Mode de conservation des blocs ou des coupes Nature du fixateur : Formol ou AFA / Bouin +++ Temps de fixation : 24 heures / qq jours +++ Température de fixation : RT / 4 Imprégnation : Nature des solvants, temps, températures, pression, Epaisseur des coupes? Qualité de l ADN en fonction du laboratoire d origine 100% % % 10 70% 60% 50% Série2 Série1 40% % 16 20% 10% 0%

10 Extraction d ADN : aspects pratiques Importantes variations en fonction de la provenance des prélèvements Problème pour les études multicentriques Deux situations principales : Blocs entiers ou macrodissection Microdissection ou lames rares La fragmentation de l ADN conditionne la taille des PCR D après Poncin et al, Diagn Molec Pathol 1999

11 Contrôle de l ADN obtenu Qualitatif : PCR dont le produit est de taille > aux tests prévus PCR multiplex (150, 300 et 600 bp) Quantitatif : Dosage pondéral : non PCR temps réel PCR multiplex

12 Dosage pondral ADN/nombre de copies de 300bp amplifiables copies 300bp/µl EBV DNA Globin Détection d un agent pathogène

13 Extraction d ARN Prélèvements congelés (ou RNAlater) Critères de qualité (congélation, conservation et coupes) Extraction à partir de blocs congelés : broyage mécanique 20 mg de tissus - environ - 20 µg ARN Le choix des prélèvements Indications Particularités Frais Congelés Fixés Extraction ou tri de cellules viables ARN ADN de haut poids moléculaire ADN fragmenté (<300bp) Uniquement prospectif Peu de patients Souvent prospectif Peu de patients Coût ++ Contraintes de qualité La majorité des patients Rétrospectif et/ou prospectif Conservation/transport faciles

14 Analyse de l ADN tumoral Circuit d un prélèvement Sélection des blocs, contrôle histologique Extraction de l ADN Amplification de l ADN Organisation d un laboratoire de pathologie moléculaire Analyses sur l ADN PCR Séquence : base de données sur internet Amorces : oligonucléotides avec logiciels appropriés Patron : extrait d ADN du prélèvement Thermocycleur Température de dénaturation : 92 Température d hybridation : variable (50 à 60 ) Température d élongation : 72 Contrôle qualité : électrophorèse en minigel d agarose

15 Organisation d un laboratoire de pathologie moléculaire Pré-analytique Contrôle histo Extraction Mix Pré PCR PCR Post-PCR Analyse de l ADN tumoral Circuit d un prélèvement Sélection des blocs, contrôle histologique Extraction de l ADN Amplification de l ADN Organisation d un laboratoire de pathologie moléculaire Analyses sur l ADN

16 Pathologie moléculaire Analyse des microsatellites pour l étude des adénocarcinomes colorectaux Microsatellites Séquences répétitives de l ADN Généralement non codantes Présentes en très grand nombre dans pratiquement tout le génome Les séquences d amont et aval sont uniques Exemple AGGGTTCAG CACACA(x)CA GCCTAAAG

17 Microsatellites Polymorphisme variable Utilisation des microsatellites pour l analyse du génome tumoral Non tumoral Exemple : perte du 18q Tumeur LOH Perte d hétérozygotie

18 Utilisation des microsatellites pour l analyse du génome tumoral Non tumoral Tumeur LOH MSI Réparation des erreurs de réplication

19 Réparation des erreurs de réplication Instabilité génétique (MSI) Non tumoral Tumeur MSI

20 Les 2 principaux types d adénocarcinomes colorectaux Avec instabilité génétique 15% des CCR sporadiques ou familiales (Lynch) Avec instabilité chromosomique 85% des CCR perte d hétérozygotie Adénocarcinomes colorectaux : Détermination du statut MSI Immunohistochimie (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) Perte de l expression nucléaire Extraction ADN et analyse de 5 microsatellites (BAT25, BAT26, D5S346, D5S123, D17S250) Si >1 marqueur instable : MSI-H Si 1 marqueur instable : MSI-L Si stable : MSS

21 CCR : Intérêt de la détermination du statut MSI Dépistage syndrome de Lynch 3% des patients opérés Perte MSH2/MSH6 ou perte MLH1/PMS2 sans mutation de BRAF Pronostic MSI = meilleur pronostic Théranostic MSI-H = moins sensible au 5-FU Pathologie moléculaire Mutations des recepteurs tyrosine kinase dans les tumeurs stromales gastrointestinales (GIST)

22 GIST : Pathologie moléculaire Mutations de KIT et PDGFRA Détection recommandée (Casali & Blay 2010) Mutations «gain de fonction» Classées le plus souvent en fonction de l exon c.1679t>a p.v560d GIST : mutations activatrices des RTK MolecGIST: 138 mutations différentes Variables selon leur localisation : KIT : Exons 9, 11, 13, 17 PDGFRA : Exons 12, 14, 18 Variables selon leur nature Délétions, insertion, substitution Emile et al. Med Oncol 2011

23 Mutations KIT exon 11 : Substitutions c.1679t>a p.v560d c.1727t>c p.l576p Analyse de taille de produits de PCR (LAPP) : Détection des délétions et insertions

24 Mutations KIT exon 11 : Délétions c.1669_1674del p.557_558del (hétérozygote) c.1666_1680del p.556_560del (homozygote) Indications de la recherche de mutation dans les GIST Diagnostic GIST KIT négatives en immunohistochimie Pronostic Valeur pronostique de certaines mutations de KIT et PDGFRA Théranostic (GIST métastatiques) Bonne réponse à l Imatinib si mutation de l exon 11 de KIT Nécessité d adapter le traitement si mutation de l exon 9 de KIT Résistance de la mutation D842V de PDGFRA Bachet & Emile Appl Clin Genet 2010

25 GIST : Pathologie moléculaire Fréquence des mutations : Intérêt pronostic? Comparaison MolecGIST (n=437) et MetaGIST (n=867) Localisé Avancé PDGFRA p.d842v 8,5% 1,2% P<0,0001 KIT exon9 p.502_503dup2 4,8% 13,1% P<0,0001 KIT exon11 p.v559d 6,2% 2,5% P=0,001 KIT exon11 p.557_558del 5,3% 9,6% P=0,007 Emile et al. Med Oncol 2011 GIST : intéret théranostic des mutations Exon 11 de KIT : Très bonne réponse, meilleure survie Exon 9 de KIT : doubler la posologie D842V de PDGFRA : résistance Heinrich et al, J Clin Oncol 2008 MetaGIST, J Clin Oncol 2010

26 Pathologie moléculaire Détection des mutations de BRAF dans les mélanomes à un stade avancé Mélanomes BRAF muté : intérêt théranostic Amélioration survie Mélanomes stade IV (Chapman et al. N Engl J Med 2011)

27 Mutations de BRAF Mutation p.v600e : Adénocarcinomes colorectaux : 98% des mutations Mélanomes : 86% des mutations Mélanomes : Nature des mutations (Source COSMIC, Juin 2010) 58% 36% V600E V600K Autres V600 Autres mutés Non mutés 2% 3% 1% Mélanomes : Nature des mutation p.v600e : p.v600k : Mélanomes : mutations de BRAF Non muté c.1798_1799gt>aa, p.v600k c.1799t>a, p.v600e c.1799_1801del, p.600_601delinse LPAP (Laboratoire de Pathologie Ambroise Paré)

28 Mutations de BRAF : Allèlotypage par PCR en temps réel Non muté : Amplification de l allèle sauvage (courbe verte) Muté : Amplification des 2 allèles sauvage (vert) et muté V600E (rouge) Mutations de BRAF : pyroséquençage Non muté c.1799t>a, p.v600e

29 Mélanomes BRAF muté : intérêt pronostic Pronostic Mélanomes stade IV (Long et al. J Clin Oncol 2011) Pronostic Mélanomes stade III (Moreau et al. soumis) Pathologie moléculaire Détection des mutations de KRAS dans les adénocarcinomes colorectaux

30 CCR métastatique et mutations de KRAS : intérêt théranostic 113 patients (analyse poolée) Survie sans progression Survie globale 32 vs 9 sem 14,3 vs 10,1 mois Lièvre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374-9 Analyses sur l ADN tumoral : Méthode de détection des mutations de KRAS Séquençage direct des produits de PCR Allélo-typage par PCR en temps réel (Taqman) Pyroséquençage Snapshot HRM puis séquençage HRM puis Taqman

31 Mutation KRAS : Interpration du TAqman Mutations : HRM (1) (2) Température

32 Mutations de KRAS dans les carcinomes (Source COSMIC, Juin 2010) 1% 7% 0% 2% 3% 20% 9% 24% 37% G12A G12C G12D G12R G12S G12V G13D G13C 31% 3% 49% G12A G12C G12D G12R G12S G12V G13D G13C 1% 1% Colon (35%) 12% Pancrés (69%) 2% 3% 7% 3% 1% 4% 9% 21% 5% 2% 43% G12A G12C G12D G12R G12S G12V G13D G13C 12% 19% G12A G12C G12D G12R G12S G12V G13D G13C 17% Poumon (17%) 4% 48% Voies biliaires (35%) Conclusions - Perspectives Bonne gestion du prélèvement Intégration du diagnostic morphologique et moléculaire Importance du «pré-analytique» Pathologiste prescripteur, mais respect des recommandations Perspectives théranostiques Aspect techniques/stratégiques : Exemples ALK-EML4 : FISH versus RT-PCR versus IHC? BRAF p.v600e : ADN versus immunohistochimie?

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