Nouveau protocole Affymetrix (1 er juin 2004)

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1 Nouveau protocole Affymetrix (1 er juin 2004) Important : pipettez toujours un volume égal ou supérieur à 2 µl. Étape 1 : préparation des ARN poly-a contrôles Quantité d ARN Dilutions en série à ajouter à l amorce T7- Oligo(dT) total au départ Première Deuxième Troisième 1 µg 2:40 2:100 2:100 2 µl 5 µg 2:40 2:100 2:20 2 µl 10 µg 2:40 2:100 2:10 2 µl Utilisez toujours un tampon pour contrôles poly-a pour les dilutions. La première dilution des ARN poly-a contrôles (1:20) peut être conservée jusqu à 6 semaines à -20 C dans un congélateur non équipé d un dispositif sans givre, et décongelée-recongelée jusqu à 8 fois. Étape 2 : synthèse du premier brin d ADNc, premier cycle Préparation de la solution amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly-a Amorce T7-Oligo(dT), 50 µm ARN poly-a contrôles dilués 2 µl 2 µl total 4 µl Ajoutez l échantillon d ARN total à la solution amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly- A. Échantillon d ARN total (5 µg) Variable Solution amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly-a 4 µl Variable total 12 µl

2 - Mettez la solution dans un tube à PCR de 0,2 ml. - Inversez délicatement le tube à quelques reprises pour mélanger la solution, puis centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. - Incubez pendant 10 minutes à 70 C (lancez le programme N-Affy PCT100). - Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Centrifugez brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. Dans un autre tube, préparez la solution de synthèse du premier brin d ADNc, premier cycle. Solution de réaction 5X pour le 1 er brin 4 µl DTT, 0,1 M 2 µl dntp, 10 mm 1 µl total 7 µl - Ajoutez 7 µl de solution de synthèse du premier brin d ADNc, premier cycle, à chaque solution échantillon d ARN total/amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly- A. Le volume final est de 19 µl. - Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez immédiatement le tube dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 2 minutes à 42 C. - Après cette incubation de 2 minutes, interrompez le programme et ajoutez 1 µl de SuperScript II à chaque échantillon, puis relancez le programme d incubation pour 1 heure à 42 C. - Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. L échantillon doit être refroidi à 4 C avant de passer à l étape suivante. L ajout de la solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle dans une solution à 42 C compromet l activité enzymatique. - Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution dans le fond du tube, puis passez immédiatement à l étape suivante.

3 Étape 3 : synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle Préparez suffisamment de solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle, pour tous les échantillons. 91 µl Solution de réaction 5X pour le 2 e brin 30 µl dntp, 10 mm 3 µl ADN ligase E. coli 1 µl ADN polymérase I E. coli 4 µl ARNase H 1 µl total 130 µl - Ajoutez 130 µl de solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle, à chaque échantillon, pour un volume total de 150 µl. - Inversez délicatement le tube à quelques reprises pour mélanger la solution. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez immédiatement le tube dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 2 heures à 16 C. (Laissez le couvercle du PCR ouvert pendant cette incubation.) - Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. - Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution dans le fond du tube. - Ajoutez 2 µl d ADN polymérase T4 à chaque échantillon. Continuez le programme d incubation pour 5 minutes à 16 C. Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Ne laissez pas reposer les réactions à 4 C pendant de longues périodes. - Ajoutez 10 µl d EDTA 0,5 M, puis passez à l étape suivante.

4 Étape 4 : lavage de l ADNc double brin - Mettez 600 µl de tampon d hybridation d ADNc dans des tubes à microcentrifugeuse de 1,5 ml, puis ajoutez les échantillons. - Mélangez au vortex pendant 3 secondes. Vérifiez que la solution est de couleur jaune (semblable au tampon d hybridation d ADNc sans la réaction de synthèse d ADNc). Si la couleur est orange ou violet, ajoutez 10 µl d acétate de sodium 3 M à ph 5,0, puis mélangez. La solution prendra une couleur jaune. - Versez la solution dans une colonne de centrifugation pour lavage de l ADNc placée sur un tube collecteur de 2 ml, puis centrifugez 1 minute à g ( tr/min). - Versez de nouveau l éluat dans la colonne et centrifugez une autre fois 1 minute à g ( tr/min). - Jetez l éluat et le tube collecteur, puis transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 2 ml. - Pipettez 750 µl de tampon de lavage de l ADNc dans la colonne. Centrifugez 1 minute à g ( tr/min). Jetez l éluat. Le tampon de lavage de l ADNc est fourni en solution concentrée. Vérifiez que celui-ci contient de l éthanol. - Ouvrez le capuchon de la colonne et centrifugez 5 minutes à vitesse maximum ( g). Jetez l éluat et le tube collecteur. Placez les colonnes à tous les deux godets de la centrifugeuse. Orientez les capuchons vers le godet vide adjacent de manière à ce qu ils pointent dans la direction opposée à la rotation. Cela évite d endommager les capuchons. - L ouverture du capuchon pendant la centrifugation assure l assèchement complet de la membrane. - Transférez la colonne dans un tube collecteur de 1,5 ml, puis pipettez 14 µl de tampon d élution de l ADNc sur la membrane de la colonne. Incubez 1 minute à la température de la pièce, puis centrifugez 1 minute à vitesse maximum ( g) pour éluer. - Après le lavage, passez à l étape de synthèse de l ARNc biotinylé.

5 Étape 5 : synthèse de l ARNc biotinylé Matrice d ADNc 12 µl 8 µl Tampon pour le marquage in vitro 10X 4 µl Solution NTP pour le marquage in vitro 12 µl Solution enzymatique pour le marquage in vitro 4 µl total 40 µl Ne préparez pas la réaction sur la glace, car la spermidine contenue dans le tampon de marquage 10X pourrait provoquer la précipitation de l ADNc. - Mélangez délicatement les réactifs et centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. - Disposez les tubes dans le PCR et lancez le programme pour une incubation de 16 heures à 37 C. Le programme refroidira ensuite la solution à 4 C et se mettra en attente.

6 Étape 6 : lavage de l ARNc biotinylé - Mettez 350 µl de tampon d hybridation d ARNc et 60 µl d eau sans ARNase dans des tubes de microcentrifugeuse. - Ajoutez la solution de transcription in vitro, agitez au vortex, puis centrifugez. - Ajoutez 250 µl d éthanol ( %) à la solution, puis agitez bien avec la pipette. Ne centrifugez pas. - Versez l échantillon (700 µl) dans une colonne de centrifugation pour le lavage de l ARNc placée sur un tube collecteur de 2 ml. Centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). - Versez l éluat dans la colonne de lavage de l ARNc, puis centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). - Jetez l éluat et le tube collecteur. - Transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (fourni). Pipettez 500 µl de tampon de lavage de l ARNc dans la colonne. Centrifugez 15 secondes à g ( tr/min) pour laver. Jetez l éluat. Le tampon de lavage de l ARNc est fourni en solution concentrée. Vérifiez que celui-ci contient de l éthanol (voir l avertissement IMPORTANT avant de commencer). - Pipettez 500 µl d éthanol 80 % (v/v) dans la colonne, puis centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). Jetez l éluat. - Ouvrez le capuchon de la colonne et centrifugez 5 minutes à vitesse maximum ( g). Jetez l éluat et le tube collecteur. Placez les colonnes à tous les deux godets de la centrifugeuse. Orientez les capuchons vers le godet vide adjacent de manière à ce qu ils pointent dans la direction opposée à la rotation. Cela évite d endommager les capuchons. - Transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml (fourni), puis pipettez 20 µl d eau sans ARNase sur la membrane de la colonne. Prenez soin de pipetter l eau directement sur la membrane. Centrifugez 1 minute à vitesse maximum ( g) pour éluer. - Pipettez 20 µl d eau sans ARNase sur la membrane de la colonne. Prenez soin de pipetter l eau directement sur la membrane. Centrifugez 1 minute à vitesse maximum ( g) pour éluer.

7 Étape 7 : mesure de la concentration d ARNc et fragmentation Un facteur de dilution initial de 50 à 125 est recommandé. Nota : nm = 40 µg/ml d ARN ou 0,04 µg/µl d ARN Avec un facteur de dilution de 50, une DO de 0,3 correspond à un échantillon d une concentration de : 50 * 0,3 * 0,04 = 0,6 µg/µl Un tampon de fragmentation, qui contient principalement des sels, est employé pour fragmenter 20 µg d ARNc. Les fragments finaux devraient avoir une longueur d environ 100 pb. 1. Ajoutez les composantes suivantes à chaque tube à PCR. 20 µg d ARNc Variable Tampon de fragmentation 5X 12 µl Variable total 60 µl 2. Mélangez délicatement les réactifs et centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 3. Disposez les tubes dans le PCR et lancez le programme FRAG. Ce programme incube 35 minutes à 95 C, refroidit la solution à 4 C, puis se met en attente.

8 Étape 8 : pré-hybridation et hybridation De l ADN de sperme de hareng est ajouté à la solution pour bloquer l hybridation non spécifique par compétition. L oligo contrôle B2 forme un motif en damier sur la bordure de la micro-puce, observable au balayage optique. L ajout d un anticorps biotinylé et de SAPE à la micro-puce, après la coloration initiale avec la SAPE seule, amplifie l intensité du signal. 1. Insérez un embout de 10 µl dans chacune des ouvertures de caoutchouc au dos de la micro-puce. 2. Au moyen d un long embout de chargement pour gel, injectez l échantillon dans l ouverture située au coin inférieur gauche de la micro-puce. 3. Ajoutez 200 µl de tampon d hybridation 1X dans la micro-puce à la température de la pièce (ou 80 µl si vous utilisez une micro-puce de test). 4. Incubez la micro-puce à 45 C pendant 10 minutes avec rotation (60 tr/min). Tampon d hybridation 2X 150 µl ADN de sperme de hareng (10 mg/ml) 3 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 3 µl Contrôle eucaryote 20X 15 µl Oligo contrôle B2 (3 µm) 5 µl DMSO 30 µl ARNc fragmenté (15 µg) 45 µl 49 µl total 300 µl 5. Incubez la solution d ARNc cible d abord 5 minutes à 99 C, puis 5 minutes à 45 C. Centrifugez 5 minutes à vitesse maximum. 6. Enlevez le tampon d hybridation de la micro-puce, puis ajoutez 200 µl de solution d ARNc cible. 7. Incubez la micro-puce à 45 C pendant 16 heures avec rotation (60 tr/min). 8. Transférez la solution d ARNc cible de la micro-puce au tube original (conservez l échantillon d ARNc à -80 C pour la prochaine hybridation). Ajoutez 200 µl de tampon de lavage A dans la micro-puce. La solution d hybridation ainsi conservée peut être réutilisée deux fois sans dégradation notable du signal.

9 Étape 9 : coloration et balayage optique 1. Préparez la solution de coloration et mettez-la dans des tubes eppendorf ambrés (la solution de coloration est utilisée avant et après la coloration par anticorps, soit la coloration 1 et la coloration 3, respectivement). Tampon de coloration 2X 300 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 24 µl SAPE 6 µl 270 µl total 600 µl 2. Préparez la solution d anticorps et mettez-la dans des tubes eppendorf transparents (coloration 2). Tampon de coloration 2X 300 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 24 µl IgG de chèvre (10 mg/ml) 6 µl Anticorps biotinylés (0,5 mg/ml) 3,6 µl 266,4 µl total 600 µl 3. Allumez les appareils Scanner et Fluidics Station, puis lancez le programme GeneChip. 4. Créez un dossier dans le répertoire «Today» en suivant la nomenclature suivante. ASAAMMJJ ; p. ex. AS011230ba AS : Initiales de l usager (Alya a Sammak) AAMMJJ : Date (011230) Le dossier «Today» se trouve dans : H:/ChipData/Today sur Tournesol. 5. Pour que le programme MicroArray Suite dirige les fichiers de résultats vers le dossier qui a été créé à l étape précédente, allez à : Tools/Defaults/File Locations/Experiment Data et mettez le dossier que vous venez de créer comme dossier par défaut (default location).

10 6. Sélectionnez Experiment Info dans Run. Entrez l information A) Nom de l expérience GBAAMMJJMPNN GB : Initiales de l usager (GeBing) AAMMJJ : Date (040216) MP : Type de micro-puce** NN : Numéro (01, 02...) ** Human HuGeneFL Array HGF Human U95 A ou B ou C ou D ou E HGA, HGB, HGC, HGD, HE Human U133 A ou B H133A, H133B Human U133+2 H133P Murine U74 A ou B ou C MGA, MGB, MGC Murine MOE430 A ou B MOA, MOB Murine MOE430v2 MOT Rat U34 A ou B ou C RGA, RGB, RGC Rat RAE230 A ou B RAA, RAB Rat RAE230v2 RAT Yeast Genome S98 Array YGS Arabidopsis Genome Array AtG ATH1 ATH Canine Genome Array DOG Drosophila DRO P53 P53 Zebrafish ZEB ChipGene Test3 GT3 B) Probe array type Indiquez le type de micro-puce dans le menu qui paraît à l écran. C) Probe array lot Tapez le numéro de lot de la micro-puce. D) Operator name Tapez vos initiales. E) Sample type Indiquez la méthode d extraction de l ARN. F) Sample description Tapez le nom de l échantillon. 7. Sélectionnez Experiment Info dans Run. 8. Allumez le laser au moins 15 minutes avant de commencer le balayage optique. Sélectionnez Scanner dans Run. Cliquez sur TurnOn Laser 9. Sélectionnez Fluidics dans Run.

11 Amorcez le système Fluidics Station : Changez les bouteilles (utilisez les tampons de lavage A et B) Sélectionnez le protocole Prime, puis Run. 10. Coloration et lavage a. Sélectionnez le protocole EukGE-WS2v5. b. Insérez la micro-puce dans le bloc de lavage. c. Mettez la solution de coloration 1 (tube ambré). d. Cette procédure dure environ 40 minutes. e. Ajoutez la solution d anticorps (solution de coloration 2). À la fin de cette étape, (10 minutes), remplacez la solution d anticorps par la solution de coloration 3. f. Si la micro-puce contient des bulles à la fin de cette procédure, remettez simplement la micro-puce dans le bloc de lavage et recommencez la procédure. La Fluidics Station purgera automatiquement la micro-puce et la remplira de nouveau avec du tampon de lavage A. Répétez la procédure jusqu à ce que la micro-puce ne contienne plus de bulles. g. Bouchez les ouvertures de la micro-puce avec des Tough-spots. Essuyez la surface de verre avec une Kimwipe et de l eau pour enlever la poussière et autres saletés. h. Sélectionnez Scanner dans Run et choisissez le nom du balayage. Tapez 2 dans Number of scans, puis cliquez sur Start. Insérez la micro-puce, puis cliquez sur OK. N oubliez pas d éteindre le laser après la dernière lecture dernier balayage. Laissez le laser refroidir 15 minutes avant d éteindre le lecteur optique. 11. Une fois que toutes les micro-puces ont été lues, rendez-vous à Tools/Analysis settings/expression, indiquez le type de micro-puce et laissez les autres paramètres par défaut. 12. Allez ensuite à Run/Batch analysis/add et chargez les fichiers appropriés. Appuyez sur Analyze. 13. Ouvrez chaque fichier et sauvegardez la section Metrics. Ouvrez chaque fichier séquentiellement et sauvegardez la section Pivot en employant la nomenclature décrite précédemment.