MICRO-ORGANISMES. Bactéries Levures- Moisissures Champignons Virus Cellules animales Cellules végétales Cellules souches Algues. M.

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1 MICRO-ORGANISMES Bactéries Levures- Moisissures Champignons Virus Cellules animales Cellules végétales Cellules souches Algues M.Nonus 1

2 Disciplines Biologie Biochimie Microbiologie Génie métabolique Génie chimique Génie génétique Génie mécanique Génie informatique M.Nonus 2

3 Métabolisme Catabolisme Biodégradation Énergie Croissance Maintenance Anabolisme Biosynthèses Croissance Multiplication cellulaire Productions M.Nonus 3

4 Composition cellulaire Biomasse Humide : 20% de MS Ex: Levure Boulangerie Matière organique: 90% /MS: C : 45%, N:8,5%,O:32,4%, H: 14,1% Minéraux : 10%/MS : P, K, S, Na, Mg, Ca Composition cellulaire Protéines : 55%, RNA: 20,5%, Lipides : 9,1% Lipo-polysaccharides :3,4%, DNA: 3,1% Glycogène : 2,5%,polysaccharides 2,5% M.Nonus 4

5 Matières premières Sources Carbonées Amidon, sucres, hydrocarbures Sources azotées Minérales Organiques Phosphore Soufre Oligo-éléments Facteurs de croissance M.Nonus 5

6 Sucres simples Sources carbonées Glucose, saccharose, lactose. Mélasses, cannes Polymères Amidons : blé, maïs, cellulose? Hydrocarbures Méthanol, fractions pétrolières M.Nonus 6

7 Sources azotées Minérales NH 3, NH 4 OH, (NH 4 ) 2 SO 4, (NH 4 ) 2 HPO 4, NH 4 NO 3 Organiques Protéines Peptones Acides aminés Urée M.Nonus 7

8 Autres matières premières Phosphore: phosphates Soufre : sulfates Potassium : Kcl Magnésium : MgO, MgSO 4 Calcium: Ca CO 3, Ca Cl 2, Ca SO 4 Oligo-éléments : sels métalliques etc M.Nonus 8

9 CULTURES-MISE EN OEUVRE Cellules viables Source d énergie Apports nutritionnels Conditions de cultures Paramètres physico-chimiques Paramètres physiologiques Cinétiques Usine cellulaire Génie métabolique M.Nonus 9

10 CONSERVATION Souches Obtention : Collections (ATCC, NRRL, DSM ) Isolements,Sélection, criblage, Mutagenèse Génie génétique Méthodes de conservation Repiquages Cryo-préservation (- 80 C, Azote liq ) Lyophilisation Viabilité. Pureté Micro-biologique. Activités M.Nonus 10

11 Réalisation des cultures Micro-organismes Conservation, pré-cultures, cultures, contrôles Milieux Matériels Formulation, Préparation, stérilisation Calibration, stérilisation Management suivi des paramètres et conduite M.Nonus 11

12 M.Nonus 12

13 Agitateur M.Nonus 13

14 M.Nonus 14

15 M.Nonus 15

16 M.Nonus 16

17 M.Nonus 17

18 M.Nonus 18

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20 M.Nonus 20

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28 M.Nonus 28

29 M.Nonus 29

30 DIVISION BACTERIENNE M.Nonus 30

31 Croissance microbienne Augmentation du nombre Division par scissiparité Allongement des cellules ADN répliqué Dédoublement du chromosome Division de la paroi et membrane plasmique Formation d un septum Séparation en deux cellules M.Nonus 31

32 Croissance microbienne Convention internationale N = nombre de cellules N 0: nb cell initiales Symboles pour les masses mises en jeu X = biomasse nombre de cellules ou MS S = Substrat P = Produit 0 = di-oxygène C = C02 M.Nonus 32

33 Croissance microbienne Temps de génération Temps que met une bactérie ou la population dont elle est issue à se diviser. Très variables : minutes, heures, jours. L augmentation du nombre de bactéries d une population qui double à chaque génération peut s exprimer sous forme de puissance de 2 2 m N 0 cellules m : nombre de doublements de la bactérie mère M.Nonus 33

34 Croissance microbienne X N III IV II I I M.Nonus 34 t

35 M.Nonus 35

36 Croissance microbienne 4 phases principales Latence I Croissance exponentielle II Stationnaire III Décroissance (exponentielle ou non ) IV 3 phases transitoires Démarrage : début phase exponentielle Ralentissement: fin phase exponentielle Déclin : fin de phase stationnaire M.Nonus 36

37 Croissance microbienne Phase de latence ou démarrage Ensemencement, adaptation au milieu et conditions de l environnement, premières divisions, activité métabolique intense ( ADN, ARN, enzymes.) Phase de croissance exponentielle ou log. Multiplication cellulaire maximale Temps de génération le plus court Taux de croissance maximal Activité métabolique maximale Limitation par le transfert d O2 ( cult. aérobies) M.Nonus 37

38 Croissance microbienne Phase exponentielle (suite ) Fin : Limitation d un substrat C, N, P, 02 Accumulation de produit (toxicité) ph, T, Flore compétitive Inhibiteurs Conservateurs, antibiotiques M.Nonus 38

39 Croissance microbienne Phase stationnaire Nb. de cell. Appa. = Nb de cell. Disp. Cellules fragiles meurent Arrêt de la reproduction Utilisation des réserves cellulaires Changements morphologiques exp Sporulation, modif. du cytoplasme M.Nonus 39

40 Croissance microbienne Phase de décroissance ou déclin Nombre bactéries qui meurent > nouvelles bactéries qui apparaissent Mortalité des cellules restantes peut suivre une progression géométrique ou non : déclin exponentiel ou non Bactéries adaptées à l environnement peuvent se multiplier sur les déchets métaboliques ou produits des réactions de conversion, voire les produits de lyse des cellules mortes (cannibalisme) M.Nonus 40

41 Cinétique de Croissance Phase de latence : x = cte dx/dt = 0 Phase de démarrage : x dx/dt µ Phase logarithmique: x dx/dt µ = c te Phase ralentissement : x dx/dt µ Phase stationnaire: x= c te dx/dt µ=0 Phase de déclin :x M.Nonus 41

42 Batch Terminologie Opération unitaire, traitement par lot, fournée Fed-batch : batch alimenté Ajout en cours de culture d éléments nutritifs, source de C, N, précurseur etc. Culture continue Renouvellement du milieu de culture par apport et retrait M.Nonus 42

43 Cinétique de Croissance M.Nonus 43

44 BATCH M.Nonus 44

45 Cinétique de Croissance M.Nonus 45

46 Cinétique de Croissance M.Nonus 46

47 Cinétique de Croissance M.Nonus 47

48 M.Nonus 48

49 M.Nonus 49

50 Cinétique de Croissance M.Nonus 50

51 Croissance microbienne x : concentration en biomasse kg/m 3 s : concentration en substrat p: concentration en produit r x : vitesse de production de la biomasse par unité de volume en kg / m 3 /h rs:vitesse de consommation du substrat par unité de volume en kg/ m 3 /h M.Nonus 51

52 Cinétique de Croissance M.Nonus 52

53 Cinétique de Croissance M.Nonus 53

54 RENDEMENT M.Nonus 54

55 Croissance microbienne Log X dx/dt µ=1/x dx/dt II III VII I M.Nonus 55 t t

56 Métabolite primaire Cultures Associé à la croissance microbienne Métabolites secondaire Dissocié de la croissance microbienne M.Nonus 56

57 Batch Cultures Modification permanente des paramètres de culture (X, S, P ) jusqu à épuisement de nutriments : limitations sauf ceux régulés, (ph, temp ) Pas d ajouts sauf air, anti-mousse, OH - régulation ph Métabolite primaire Métabolite secondaire M.Nonus 57

58 Cultures Batch ou opération unitaire Fed Batch ou Batch alimenté Culture continue Production T, kg, U Productivité volumique: kg/m 3 /h, g/l/h,u/l/h Productivité spécifique: kg/kg, g/g, U/g Productivité vol. spécifique: kg/m 3 /kg/h, g/g/l/h M.Nonus 58

59 Cultures Limitations : équation de MONOD Nutriments : substrat limitant O2, OUR=OTR S : C, N, P etc µ= µmax S Ks + S Ks :coefficient de demi saturation Relie le taux de croissance µ à la nutrition Empirique,proche de la réalité M.Nonus 59

60 Cultures Quand une source de Carbone est utilisée comme source d énergie et élément de croissance, sa concentration en phase liquide a une grande influence sur la vitesse de croissance. Ks est numériquement égal à la valeur de la concentration qui correspond à une vitesse de croissance égale à la moitié de µ max. Plus Ks est petit plus la vitesse de croissance est grande M.Nonus 60

61 Cultures µ µ µmax µmax/2 Ks S M.Nonus 61

62 Cultures Constantes de saturation µ-organisme substrat Ks mg/l E.coli glucose 6, E.coli mannitol 2 E.coli lactose 20 E.coli tryptophane 4, Candida oxygène 4, Pseudomonas méthanol 0,7 M.Nonus 62

63 CULTURES FED BATCH Fed batch : batch alimenté Ajout milieu, S, f. croissance Facile à mettre en œuvre Aug. la productivité et production Peut permettre de dissocier les phases de croissance et production Maintenir certaines constantes Production Penicilline (C ) Glucose trop élevée favorise X (C) glucose trop basse pénalise P M.Nonus 63

64 CULTURES FED BATCH CO2, N2, O2 res, Volatils Pas de sortie de milieu Air, air enrichi, gaz M.Nonus 64

65 M.Nonus 65

66 M.Nonus 66

67 M.Nonus 67

68 CULTURES FED BATCH V: volume du milieu de culture F : débit d alimentation S 0 : concentration du substrat à l entrée t = 0 S: concentration du substrat dans le réacteur à t X 0 : concentration de biomasse entrée X : concentration de biomasse à t M.Nonus 68

69 CULTURES FED BATCH Biomasse V d X /dt = µvx XdV/dt + VdX/dt = µxv VdX/dt = µxv XdV/dt Ajout de liquide = débit d alimentation = dv/dt = F dx/dt = X (µ- F/V ) F/V = D taux de dilution M.Nonus 69

70 CULTURES FED BATCH Substrat SdV/dt = S 0 F µxv 1/Y x/s max VdS/dt + SdV/dt = S 0 F µxv 1/Y x/s max ds/dt = (S 0 S) F/V - µxv 1/Y x/s max À l équilibre ds/dt = 0 F = µxv/ Yx/s max ( S 0 S) XV = X 0 V 0 e µt F = µ X 0 V 0 e µt / Yx/s( S 0 S) M.Nonus 70

71 CULTURES CONTINUES M.Nonus 71

72 CULTURES CONTINUES Notion de CSTR : CHEMOSTAT Continuous Stired Tank Reactor Réacteur continu agité Homogénéité : stabilité Distribution (X,S,P = constante) distribution homogène dans l ensemble du volume du réacteur Volume constant alimentation et soutirage en continu M.Nonus 72

73 CULTURES CONTINUES Batch puis alimentation continue A l équilibre les variables du batch deviennent constantes : état stable étude de l influence de paramètres sur la culture : recherche des conditions limites de conduite Améliore la productivité pour X et métabolites primaires Exp utilisation : Traitement d eau Bioconversion ( resting cells) Produits instables ou à faible productivité M.Nonus 73

74 CULTURES CONTINUES Peu utilisées en milieu industriel Risques de contamination Stabilité génétique des souches Beaucoup de métabolites secondaires ( pas associés à la croissance) Logistique et fiabilité M.Nonus 74

75 CULTURES CONTINUES CHEMOSTAT - croissance cellulaire est limitée par un nutriment essentiel les autres sont en excès - à l état d équilibre les concentrations en S, X P sont constantes - le CSTR est alimenté en milieu neuf à la même vitesse que le milieu du réacteur est soutiré. V = Constante - les autres paramètres de la culture restent constant (T, ph, 02 dissous,.) M.Nonus 75

76 M.Nonus 76

77 CULTURES CONTINUES Bilan matière F X 0 FX + V µx V k d X = V dx/dt (0) F = Débit d alimentation en l/h V = milieu de culture l X = concentration cellulaire g/l µ = taux de croissance h -1 k d = taux de mortalité h -1 M.Nonus 77

78 CULTURES CONTINUES dx/dt = D X 0 + ( µ- k d - D)X (1) taux de dilution D = F/V Inverse du temps de séjour milieu d alimentation est stérile X 0 = 0 taux de mortalité négligeable / taux de croissance k d <<µ A l équilibre dx/dt = 0 µ = D (2) M.Nonus 78

79 CULTURES CONTINUES Si D 0 X S 0 Y x/s S 0 D µ max X 0 S S 0 C en X, S td DX X S D h -1 M.Nonus 79

80 CULTURES CONTINUES Limitations physiologiques -synthèse des enzymes -excrétion des enzymes -transport des substrats -transport des métabolites -inhibition par excès de substrat -inhibition par le métabolite excrété -inhibition par accumulation de composés toxiques dans le cellule concerne l analyse d un type de micro-organisme. M.Nonus 80

81 CULTURES CONTINUES Limitations technologiques - ph - température - Aw - force ionique - Oxygénation - Présence de CO2 - Concentrations en précurseurs - Élimination des calories concerne une population de micro-organismes M.Nonus 81

82 CULTURES CONTINUES µ max sur glucose Organisme T C µ max h -1 t d h A.niger 30 0,2 3,46 P.chrysogenum 25 0,123 5,65 A.nidulans 20 0,090 7,72 A.nidulans 30 0,215 3,23 a.nidulans 37 0,360 1,96 E.coli( glc) 30 0,28 2,48 E.coli( malt.) 30 0,22 3,15 E.coli( maltotriose) 30 0,18 3,85 M.Nonus 82

83 CULTURES CONTINUES Influence aw sur µ max de Saccharomyces µ 1 0,98 0,96 0,94 0,92 aw M.Nonus 83

84 CULTURES CONTINUES S il y a au moins une limitation par un élément nutritif : équation MONOD substitue dans (2) µ = D = µ max S / Ks + S (3) S = substrat limitant g/l Si D > µ max la culture ne peut se reproduire assez vite pour se maintenir c est le lavage ( wash out) Graphe 1/µ par rapport 1/S on peut estimer Ks et µ max M.Nonus 84

85 Cultures µ µ µmax µmax/2 Ks S M.Nonus 85

86 CULTURES CONTINUES Si D 0 X S 0 Y x/s S 0 D µ max X 0 S S 0 C en X, S td DX X S D h -1 M.Nonus 86

87 M.Nonus 87

88 CULTURES CONTINUES Pour D < µ max la concentration en substrat de l effluent S = Ks D/ µ max - D (4) Le bilan matière en l absence de métabolisme endogène F S 0 - FS -V µ X 1/Y x/s max Vq p X 1 /Y p/s max = V ds/dt (5) S 0 et S concentration en S de l alimentation et l effluent q p est le taux spécifique de formation du produit extra cellulaire Y x/s Y p/s sont les rendements en cellules et produits g X/g S g P/ g S M.Nonus 88

89 CULTURES CONTINUES Si D 0 X S 0 Y x/s S 0 D µ max X 0 S S 0 C en X, S td DX X S D h -1 M.Nonus 89

90 CULTURES CONTINUES Quand la formation en produit est négligeable et la culture en état stable ds/dt = 0 D (S 0 - S) = µx/y x/s max (6) si µ=d à l équilibre et k d = 0 X = Y x/s max (S 0 -S) (7) à partir de (4) la concentration cellulaire à l état d équilibre X = Y x/s max (S 0 - Ks D / µ max D) (8) approximation : Y x/s est considéré comme constant du fait que la formation en produit est négligeable M.Nonus 90

91 CULTURES CONTINUES En (7) et( 8) Y x/s est considéré comme constant( approximation)si on ne prend pas en compte le métabolisme endogène Y x/s Varie avec le taux de croissance et la limitation en substrat si on le prend en compte, le métabolisme endogène(2) devient D = µ- k d = µ net (9) ou µ = D + k d (10) On substitue (10) le bilan du substrat à l état stable et on considère qu il n y a pas de produit formé D (S 0 -S) 1/ Y x/s max ( D+ k d ) X= 0 (12) Y x/s max rendement maximum ( pas de métabolisme endogène et d énergie de maintenance) valeur constante indépendante du taux de croissance M.Nonus 91

92 CULTURES CONTINUES (12 ) peut être arrangée D (S 0 -S/X) 1 / Y x/s max (D+k d ) = 0 (13) D(1 / Y x/s ) D/ Y x/s max - k d / Y x/s max = 0 (14) 1/ Y x/s max + k d / Y x/s max D = 1 / Y x/s (15) I/ Y x/s = 1/ Y x/s max + m s /D (16) m s =k d / Y x/smax (17) On obtient les valeurs de Y x/s max et m s à partir d essais en chemostat en traçant 1/ Y x/s max par rapport à 1/D pente m s interception 1/ Y x/s max M.Nonus 92

93 CULTURES CONTINUES 1/ Y x/s 3 ms = pente = 0, 2 gs/gx h 2,5 2 1/ Yx/s max = 2 Yx/s max = 0,5g de X/ g de S /D h M.Nonus 93

94 CULTURES CONTINUES En présence d un métabolisme endogène µ net = µ max S / (Ks +S ) On montre que S= Ks (D+ k d ) / µ max D - k d (18) X = Y x/s max (S 0 -S) D/D+ k d (19) Si on considère la transformation du substrat en produit Le bilan masse du produit associé à la croissance DP= q p X (20) q p = taux spécifique de conversion en produit M.Nonus 94

95 CULTURES CONTINUES Pour les produits non associés q p est une constante β alors que pour la produits associés à la croissance c est une fonction de µ Pour le bilan substrat (5) devient : D (S 0 -S) = 1 /Y x/s max (D+k d )X=1/ Y p/s q p X (21) (21) peut être résolue pour X X= Y x/s max (S 0 S)( D/ D+k d + q p Y x/s max / Y p/s )( 22) productivité d un chemostat Pr s exprime en terme de production de produit DP ou de biomasse DX le taux de dilution qui permet d atteindre la productivité maximale et obtenu d(dp)/dd = 0 ou d(dx)/dd = 0 M.Nonus 95

96 CULTURES CONTINUES La valeur optimale de D ( D opt )pour la biomasse : D opt = µ max ( 1- ) Ks (Ks + S 0 ) S 0 est >>>> à Ks, D opt approche D = µ max ou point de lavage D doit être légèrement < à D opt stable et productivité maximale D opt pour la production optimale ne l est pas forcément pour le produit M.Nonus 96

97 CULTURES CONTINUES A chaque valeur de D X = Y x/s (S 0 S) La culture continue permet de travailler avec des µ donnés ou choisis Y x/s peut être testé pour différents µ l effet de chaque substrat peut être testé M.Nonus 97

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