Pipeline d'annotation des variants

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1 Pipeline d'annotation des variants École Bioinformatique AVIESAN 2015 Maria Bernard Rachel Legendre Sabrina Rodriguez 30/09/2015

2 Pourquoi et comment analyser les variants?

3 Quelques définitions. Variation génétique / variant / polymorphisme un changement de base(s) à une même position sur le génome SNP («Single Nucleotide Polymorphism») substitution d un nucléotide dans une séquence nucléique. rs (chromosome 1, position ): AGGAAGCTGAC AGGAAACTGAC

4 Quelques définitions. Gène Promoteur Transcription Epissage Partie codante E1 E2 E1 E2 E3 E4 E3 E4 E5 Traduction E5 pre-arnm ARNm mature Protéine

5 Quelques définitions. Gène Promoteur Partie codante Un SNP peut être localisé n importe où sur le génome Transcription Epissage E1 E2 et E3 E4 E5 pre-arnm affecter différents processus de biologie moléculaire E1 E2 E3 E4 E5 Traduction ARNm mature Protéine

6 Quelques définitions. Affecter l'expression des gènes en impactant le promotteur Promoteur Partie codante Facteur de transcription fixation transcription Partie codante

7 Quelques définitions. Affecter l'expression des gènes en impactant le promotteur Promoteur Partie codante Partie codante SNP

8 Quelques définitions. Affecter l'expression des gènes en impactant le promotteur Promoteur Partie codante Facteur de transcription fixation transcription Partie codante SNP

9 Quelques définitions. Affecter l'expression des gènes en impactant le gène Gène Promoteur Transcription Epissage Partie codante E1 E2 E1 E2 E3 E4 E3 E4 E5 Traduction E5 pre-arnm ARNm mature Protéine

10 Quelques définitions. Affecter l'expression des gènes en impactant le gène Gène Promoteur Partie codante E1 E2 E3 E4 SNP E1 E2 E3 E4 E5 SNP Modification sur un domaine de la protéine E5

11 Quelques définitions. Affecter l'expression des gènes en impactant le gène Gène Promoteur Partie codante E1 E2 E3 E4 E3 E4 E5 SNP E1 Modification sur un domaine de la protéine par création d'un nouveau site d'epissage E5

12 Pourquoi et comment analyser les variants But : Identifier les causes génétiques responsables d'un phénotype particulier ou Comment adapter les suites logiciels Pupasuite ou SNPnexus à d autres espèces que l homme et la souris

13 Pourquoi et comment analyser les variants Exemple de projets : 4 animaux séquencés (2 sains, 2 malades) Technique utilisée: Séquençage de génomes complets avec génome de référence (Plateforme GenoToul) High Seq 2000 Ref ACGTACGTACGGCGTC ACGTACGTACGGCGTC ACGTACGTACGGCGTC GTACGTACAGCGTC CGTACAGCGTC Alignement des séquences sur génome de référence. Détection des variants potentiels (chez le bovin: > SNPs)

14 Pourquoi et comment analyser les variants Exemple de projet réalisé à l'inra : Etude de la Maladie «Complex Vertebral Malformation» ou CVM Caractéristique : Veau avec ses vertèbres soudées Détection des variants par séquençage haut débit Cause génétique : Anomalie génétique autosomique récessive dans l espèce bovine, mutation dans le gène SLC35A3: Substitution d une base G en T => modification d un acide aminé valine (V) en phénylalanine (F) ADN ch3 781 GAACTTTCAGCTGGCTCACAATTTGTAGGTCTCATGGCAGTTCTCACA Prot 169 -E--L--S--A--G--S--Q--F--V--G--L--M--A--V--L--TTTT F

15 Pourquoi et comment analyser les variants Exemple de projet réalisé à l'inra : Etude de la Maladie «Complex Vertebral Malformation» ou CVM Caractéristique : Veau avec ses vertèbres soudées Détection des variants par séquençage haut débit Cause génétique : Anomalie génétique autosomique récessive dans l espèce bovine, mutation dans le gène SLC35A3: Substitution d une base G en T => modification d un acide aminé valine (V) en phénylalanine (F) ADN ch3 781 GAACTTTCAGCTGGCTCACAATTTGTAGGTCTCATGGCAGTTCTCACA Prot 169 -E--L--S--A--G--S--Q--F--V--G--L--M--A--V--L--TTTT F Ce type de variant est appelé «missense_variant» Let 's go to the

16 Comment sélectionner les SNPs impactant Ou Comment interpréter l'effet des SNPs

17 Pipeline d'annotation des SNPs Une annotation en 2 étapes : Déterminer une annotation fonctionnelle pour chaque variant Prédire l'effet des «missense-variant» sur les modifications post traductionnelles

18 Pipeline d'annotation des SNPs 1) Déterminer une annotation fonctionnelle pour chaque variant

19 1 - annotation fonctionnelle Les outils disponibles : Pour l'homme SNPnexus et Pupasuite Pour les autres espèces : Annovar, Variant Effect Predictor, SnpEff,...

20 1 - annotation fonctionnelle Les outils disponibles : Pour l'homme SNPnexus et Pupasuite Pour les autres espèces : Annovar, Variant Effect Predictor Predictor, SnpEff,...

21 1 - annotation fonctionnelle Variant Effect Predictor Ensembl fournit une base de données complètes d'informations génétiques et génomiques pour un large nombre d'espèces. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics 26(16): (2010) Variant Effect Predictor est développé par Ensembl. Ensembl fait égalemnt appel à des bases plus spécialisées comme dbsnp ou DGVa Ensembl fournit un ensemble d'apis permettant d'explorer cette base de données dont

22 1 - annotation fonctionnelle VCF À partir : D'une liste de variant D'information de séquences De variants connus VEP produit : Gènes et transcrits impactés Localisation sur le gènes Conséquences du variant sur le gène Extra pour l'homme Information sur les SNPs déjà connus Score SIFT et Polyphen

23 1 - annotation fonctionnelle Format d entrée de variant_effect_predictor: Un fichier de variants au format VCF Un fichier de variants au format EnsEMBL: CHR START END ALLELE STRAND T/C /C + IDENTIFIER* *(optionnal) If not provided, the variant_effect_predicto.pl program will construct an identifier from the given coordinates and alleles. Un rsids (identifiants issus de la base de données publique dbsnp) ex: rs

24 1 - annotation fonctionnelle Une base de données pré-enregistrées Ensembl Plusieurs génomes sont déjà intégrés à Galaxy, d'autres peuvent être ajouté sur demande Ou Une référence personnelle : - Les annotations du génome au format GTF/GFF2 - Les séquences fasta correspondantes

25 1 - annotation fonctionnelle

26 1 - annotation fonctionnelle Résultat Un fichier de variants au format VEP Colonnes 1 à 6 pour la descriptions du variant sur le génome ID pos allele gene feature feature type 11_224088_C/A 11: A ENSG ENST Transcript 11_224088_C/A 11: A ENSG ENST Transcript Colonnes 7 à 14 Pour la description du variant sur le transcript et la protéine Conséquences Pos in cdna Pos in CDS Pos in Prot aa change Codon change Variation ID Extra MISSENSE_VARIANT T/N acc/aac - - 5_PRIME_UTR_VARIANT

27 1 - annotation fonctionnelle Résultat Un fichier de variants au format VEP Colonnes 1 à 6 pour la descriptions du variant sur le génome ID pos allele gene feature feature type 11_224088_C/A 11: A ENSG ENST Transcript 11_224088_C/A 11: A ENSG ENST Transcript La colonne Extra peut contenir les scores SIFT et Polyphen (uniquement pour l'humain) Colonnes 7 à 14 Pour la description du variant sur le transcript et la protéine La colonne VariationID peut Pos in Pos in Pos in contenir les cdna identifiants CDSconnus Prot des bases de MISSENSE_VARIANT 742données spécialisées- (dbsnp,- DGVa,-...) 5_PRIME_UTR_VARIANT Conséquences aa change Codon change Variation ID Extra T/N acc/aac

28 1 - annotation fonctionnelle Let 's go to the SIFT : Polyphen : Prediction de l'impact d'une substitution sur la fonction de la protéine en se basant sur le degré de conservation des acides aminés Prédiction de l'impact d'une substitution sur la structure et la fonction des protéines en utilisant des informations de séquences et de structure. Résultat : Résultat : «deleterious» «tolerated» Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm Nature Protocols 4, (2009) A method and server for predicting damaging missense mutations Nature Methods 7, (1 April 2010) «benign» «possibly_damaging» «probably_damaging»

29 Pipeline d'annotation des SNPs 2) Prédire l'effet des «missense-variant» sur les modifications post traductionnelles

30 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Les outils disponibles : Mitoprot : adressage à la mitochondrie eucaryote Netphos : site de phosphorylation GPI-som : ancrage GPI Conservation mammifère Yinoyang Netcglyc Netoglyc humain Site de glycosylation Netnglyc Disembl : désordre protéique...

31 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Les outils disponibles sur Galaxy : Mitoprot : adressage à la mitochondrie Netphos : site de phosphorylation GPI-som : ancrage GPI Conservation Netoglyc Netnglyc Netcglyc Site de glycosylation Yinoyang Disembl : désordre protéique...

32 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Les données d'entrées : Protseq des séquences protéiques référentes et alternatives > 7_ _G/T_rs _ENSBTAT [D/E-12]_allele1 (REFERENCE) MSGAIFTSLEGDGALDGTSGHPLVCPLCHAQYERPCLLDCFHEFCAGCLRGRAADGRLACPLCQHQTV > 7_ _G/T_rs _ENSBTAT [D/E-12]_allele2 (ALTERNATIF 1) MSGAIFTSLEGEGALDGTSGHPLVCPLCHAQYERPCLLDCFHEFCAGCLRGRAADGRLACPLCQHQTV > 7_ _G/A_rs _ENSBTAT [D/N-12]_allele1 (REFERENCE) MSGAIFTSLEGDGALDGTSGHPLVCPLCHAQYERPCLLDCFHEFCAGCLRGRAADGRLACPLCQHQTV > 7_ _G/A_rs _ENSBTAT [D/N-12]_allele2 (ALTERNATIF 2) MSGAIFTSLEGNGALDGTSGHPLVCPLCHAQYERPCLLDCFHEFCAGCLRGRAADGRLACPLCQHQTV

33 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Let 's go to the

34 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Allèle ref Protseq Module annotation Score ref Score > α oui MPT dans la ref non Pas de MPT dans la ref

35 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Allèle ref Allèle alt Module Module annotation Module annotation Score ref Score alt Score > α oui MPT dans la ref MPT dans l'alt oui non Score > α non Pas de MPT dans la ref Pas de MPT dans l' alt

36 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Allèle ref Allèle alt Module Module annotation Module annotation Score ref Score alt Score > α oui MPT dans la ref MPT dans l'alt oui non Score > α non Gain de modification Perte de modification Pas de MPT dans la ref Pas de MPT dans l'alt

37 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Allèle ref Allèle alt Module Module annotation Module annotation Score ref Score alt Score > α oui MPT dans la ref MPT dans l'alt oui non non Gain de modification Perte de modification Pas de MPT dans la ref Perte potentielle de modification Score > α Pas de MPT dans l'alt Score Ref Score Alt > β Gain potentiel de modification

38 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Exemple de recherche de différence de phosphorylation (module netphos) chez le bovin entre les deux variants Module seuil paramétrable de détection de signal: α = 0.5 seuil paramétrable de différence de score: β = 0.3 CHR POS Allèles Score Signal CCL C/T 0.2/0.639 no/w Gain A/T 0.55/no W/no Loss C/A 0.1/0.4 no/no Gain? A/T 0.4/0.1 no/no Loss?

39 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Module MITOPROT Description: Ce composant vérifie s'il y a gain ou perte d'un signal d adressage à la mitochondrie entre les séquences protéiques des 2 allèles par SNP et transcrit. Spécifications du programme: les séquences protéiques doivent commencer par une méthionine (M). une seule séquence est traitée à la fois. Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur. J. Biochem. 241, (1996)

40 Données d entrée Protseq 2 - annotation d'impact post traductionnel MITOPROT Module

41 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Module NETPHOS Description: Netphos est un outil de prédiction des sites de phosphorylation. La phosphorylation consiste en l ajout d un groupement phosphate sur un acide aminé alcoolique (Serine, Thréonine et Tyrosine). Les enzymes responsables de la phosphorylation sont les kinases. Pour chaque acide aminé alcoolique, Netphos détermine un score de phosphorylation pour chaque enzyme (20 différentes) : ATM, CaMII, cdc, cdk, CKI, CKII, DNAPK, EGFR, GSK3, INSR3, 38MAPK, PKA, PKB, PKC, PKG, RSK, SRC. La plupart étant des kinases. Spécifications du programme: 1 seule séquence protéique a la fois les séquences protéiques ne doivent pas dépasser 4000 acides aminés Sequence and structure based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites. Journal of Molecular Biology: 294(5): ,

42 Données d entrée Protseq 2 - annotation d'impact post traductionnel NETPHOS Module

43 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq GPI-SOM Module Description: Ce composant vérifie s'il y a gain ou perte d'un signal d ancre gpi («GlycosylPhosphatidylInositol», ou glypiation ) entre les séquences protéiques des 2 allèles par SNP et transcrit. Il utilise le programme «gpi-som». KohGPI: Identification of GPI-anchor signals by a Kohonen Self Organizing Map. Publication soumise

44 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq GPI-SOM Module KohGPI: Identification of GPI-anchor signals by a Kohonen Self Organizing Map. Publication soumise

45 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Module Conservation Description: Ce module génère 2 résultats selon 2 méthodes différentes. API d Ensembl Compara pour calculer la conservation d un acide aminé à une position X d une protéine par rapport aux protéines orthologues disponibles dans Ensembl 2 scores sont générés: un score observé et un score attendu. Le score attendu prend en compte le contexte génomique pour donner une indication de conservation (région soumise à forte pression de sélection? Autrement dit hautement conservée dans les autres espèces). Plus la différence de score est élevée, plus la position est conservée et plus une mutation à cette position a de fortes chances d être délétère.

46 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Module Conservation Description: Ce module génère 2 résultats selon 2 méthodes différentes. API d Ensembl Compara pour calculer la conservation d un acide aminé à une position X d une protéine par rapport aux protéines orthologues disponibles dans Ensembl La matrice Grantham. Cette matrice est une matrice de transition entre les 20 acides aminés connus en se basant sur les propriétés physico-chimiques et le volume moléculaire de chaque acide aminé. Plus le score est petit plus les propriétés physico-chimique de la protéine sont respectées: Score < 50; conservée Score entre 51 et 100; modérément conservée Score entre 101 et 150; modérément radicale Score >151 ; radicales Grantham R. Amino acid difference formula to help explain protein evolution. Science 1974;185:862 4

47 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Module Conservation Description: Ce module génère 2 résultats selon 2 méthodes différentes. API d Ensembl Compara pour calculer la conservation d un acide aminé à une position X d une protéine par rapport aux protéines orthologues disponibles dans Ensembl La matrice Grantham. Cette matrice est une matrice de transition entre les 20 acides aminés connus en se basant sur les propriétés physico-chimiques et le volume moléculaire de chaque acide aminé. Spécifications du programme: utilise en entrée un fichier vep avec les «non_synonymous_coding» SNPs

48 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Conservation Module Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur. J. Biochem. 241, (1996) Let 's go to the

49 Données d entrée 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq Module La dernière étape consiste à fusionner les résultats en un seul fichier de sortie. Join conservation Grantham score conservation Observed score conservation Expected score conservation Difference score mitoprot Case mitoprot score allele1 mitoprot score allele2 13_ _T/A ENSBTAT [L/Q-11] gain _ _C/A ENSBTAT [S/I-29] loss _ _C/A ENSBTAT [S/I-29] _ _C/A ENSBTAT [S/Y-167] _ _C/A ENSBTAT [---] _ _C/T ENSBTAT [E/K-29] 56 loss Name

50 Données d entrée Protseq 2 - annotation d'impact post traductionnel Join Module Join Let 's go to the

51 2 - annotation d'impact post traductionnel Protseq

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