Evaluation de la toxicité de métabolites secondaires produits par les spores d Aspergillus fumigatus. Thierry GAUTHIER UMR 1331 TOXALIM INRA Toulouse
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2 Evaluation de la toxicité de métabolites secondaires produits par les spores d Aspergillus fumigatus Thierry GAUTHIER UMR 1331 TOXALIM INRA Toulouse
3 Aspergillus fumigatus Champignon saprophyte, peut pousser sur différents matériaux Extérieur: matières organiques comme céréales, l orge germé, foin tassé, compost, tabac Intérieur: dans les habitations humides et les vieux papiers. La tailles des spores (2 à 3 µm) leur permet de progresser tout au long du tractus respiratoire jusqu aux alvéoles pulmonaires Seconde cause de mortalité par infection fongique à l hôpital. Aspergillose invasive chez les malades immunodéprimés Aspergillose bronchopulmonaire allergique chez les personnes atteintes d asthme ou de mucoviscidose Rhinite chez les personnes travaillant dans des locaux humides et moisis Aspergillome lorsque le champignon peut se développer dans une cavité préexistant dans le poumon Peu de données concernant les métabolites portés par les spores et pas de données sur leurs effets toxiques sur les cellules pulmonaires
4 Toxines véhiculées par les spores d A. fumigatus 1) Identification des métabolites secondaires d Aspergillus fumigatus véhiculées par les spores Analyse LC-MS de l extrait de spores x mau min Aspergillus fumigatus NCPT13 sur CYA 25 C Trypacidin (MW=344) Fumiquinazoline C (MW=443) Tryptoquivaline F (MW=402) Monomethylsulochrin (MW= 346) Questin (MW=284) Time [min] Tryptoquivaline F H N O H N O O NH N H H CH 3 O Fumiquinazoline C CH 3 N NH N O O O H H N 3 C N H O Trypacidine Monomethylsulochrine Questine
5 2) Toxicité des métabolites portées par les spores lignée A549 Viabilité cellulaire LC-MS 13 jours à 25 C Incubation dans du chloroforme 4 jours Pre-purification Flash chromatographie 70 3 fumiquinazo.c Tryptoquiv.F trypacidin RP-HPLC monomethyl. questin % inhibition 60 2, , detected ions level 10 0,5 0 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F Metabolites trypacidin monomethyl. Questin fumiquinazo.c tryptoquiv. F Les fractions contenant de la fumiquinazoline C et de la tryptoquivaline F présentent une faible activité toxique la présence des 3 métabolites trypacidine, monomethylsulochrine et questine est associée à un pic de toxicité
6 Synthèse metabolique de la trypacidine chez A. fumigatus Emodine Questine Monomethylsulochrine Sulochrine Desmethylsulochrine Trypacidine
7 3)Toxicité de la trypacidine vs ses précurseurs métaboliques 100 µm de sulochrine et monomethylsulochrine montrent peu d effet toxique. 100 µm d emodine et de questine induisent une perte de viabilité mais très peu de lyse cellulaire 50 µm de trypacidine provoque une toxicité très importante: inhibition de 95% de la viabilité et 90% de cellules lysées 100 Viabilité cellulaire (MTT) (MTT) * 100 ** Lyse cellulaire (LDH) ** % cell viability ** ** % cell lysis ** ** 20 0 * ** ** 50 µm 100 µm Cellules A549 exposées pendant 24h à 50 µm et 100 µm de métabolites IC 50 trypacidine 7,4±2,0 µm(n=5) 7,4±2,4 µm(n=5)
8 4) Comparaison de la toxicité induite par différents temps d exposition à la trypacidine % viabilité cellulaire mesurée après 24H de culture Temps d exposition à la trypacidine 1h 2h 24h Trypacidine 50 µm 2 ±2 3 ±2 1 ±1 Trypacidine 10 µm 43 ±3 41 ±2 38 ±5 Dosage MTT sur cellules A549 La première heure d exposition à la trypacidine induit un processus irréversible qui conduit à une perte de viabilité au bout de 24h
9 Allergenes toxines Polluants Ozone fumée de cigarette Maladies respiratoires Stimuli Ca 2+ O 2 NADPH oxydase Stress Oxydant & Nitrosant NO L-arg NOS Oxyde nitrique NO peroxynitrite ONOO - Anion superoxyde O 2.- SOD H 2 O 2 GSH catalase GSSG H 2 O chaine respiratoire transport e - OH -, OH. formation de pores = dépolarisation synthèse ATP Cassures ADN Dysfonctionnement de protéines Peroxydation de lipides Inhibition de la respiration MT
10 5.1) Effet de la trypacidine sur la production de ROS et RNS Trypacidine 10 µm Trypacidine 50 µm 1h 2h 24h 1h 2h 24h NO H 2 O 2 O 2 - Control négatif Control positif trypacidine La trypacidine induit un stress oxydant et la production de NO dès les premières heures d exposition, suivi d un stress sévère après 24h d exposition.
11 5.2) Stress oxydant après 2h et 24h d exposition à 50 µm trypacidine IP IP H 2 O 2 NO controle Trypacidine controle Trypacidine 2 h 24 h Après 2 h d exposition, la trypacidine provoque la mort cellulaire d une partie de la population (20%) et un stress oxydatif d une autre partie (15%). Au bout de 24h, les cellules qui ont subi un stress oxydant sont mortes.
12 Trypacidine O 2 Stress Oxydant & Nitrosant Ca 2+ NADPH oxydase NO L-arg NOS Oxyde nitrique NO peroxynitrite ONOO - Anion superoxyde O 2.- SOD H 2 O 2 GSH catalase GSSG H 2 O chaine respiratoire transport e - OH -, OH. formation de pores = dépolarisation synthèse ATP stress important chute d ATP, inhibition des caspases nécrose Cassures ADN Dysfonctionnement de protéines Peroxydation de lipides Inhibition de la respiration MT Stress modéré arrêt du cycle réparation activation des caspases apoptose
13 6) Effet de la trypacidine sur le cycle cellulaire G0/G1 Sub-G1 S G2/M MTT/ IC 50 = 7,4± 2,0 µm MTT/IC 50 = 9,2 ± 2,0 µm 2 N < > 4 N 100 A549 = carcinome alvéolaire pulmonaire 100 HBEpC: cellules primaires de bronche % cell population % cell population µm trypacidin µm Trypacidin Sub-G1 G 0 /G 1 S G 2 /M Aucun effet sur les différentes phases du cycle Absence de population sub-g1: pas d induction d apoptose
14 7) Mesure du potentiel membranaire mitochondrial Après 2h et 24h d exposition à la trypacidine DiOC 6 ATP H + Ψ m ADP H + Apoptose Facteurs proapoptotiques H + H + DiOC 6 control trypacidin 10 µm Trypacidin 50 µm FCCP (Fluoro-carbonylcyanide phenylhydrazone ) L absence de diminution du PMM confirme que le trypacidine n induit pas d apoptose
15 Principales conclusions La trypacidine est le métabolite le plus toxique véhiculé par les spores d A. fumigatus: première démonstration de son activité toxique contre des cellules pulmonaires. Une heure d exposition à la trypacidine suffit pour induire un mécanisme de mort cellulaire impliquant un stress oxydant et conduisant à la lyse cellulaire dans les 24 heures La trypacidine n induit pas d arrêt du cycle cellulaire, ni un processus apoptotique mais provoque une nécrose cellulaire.
16 Equipe Immuno-Toxicologie UMR ToxAlim Marie-Pierre Artigot (master 2) Xiaodi Wang (master 2) Athanasios Fysikopoulos (master 2) Joice Sifuentes Dos Santos (post-doc) Equipe IMT Souria Tadrist Nicolas Loiseau Olivier Puel Isabelle Oswald Plate-forme Axiom: Cécile Canlet
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