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1 Disruptive Technologies Produits et Applications 02/10/2005 Diapo 1

2 La société Créé éée e en Octobre 2005 par Franck Do Vale et William Amoyal, respectivement Directeur Commercial et Directeur SAV de Bionisis. SARL au capital de Implantée à Paris. Couverture principale de la France et la Belgique pour la majorité des produits mais aussi la Suisse, le Royaume-Uni, l Italie l et l Espagne pour certains produits et enfin le monde pour l OPLCl OPLC. Réseau de commerciaux et distributeurs en cours de mise en place. 02/10/2005 Diapo 2

3 Mission et objectifs Offrir aux analystes, chimistes et scientifiques des industries pharmaceutique, biotechnologique, chimique, pétrochimique, p cosmétique, agroalimentaire et environnement ainsi qu aux instituts de recherche publics et privés, laboratoires officiels et universitaires des solutions innovantes permettant d accrod accroître leur productivité, accélérer leurs recherches, lancer leur propres produits sur le marché plus rapidement, réduire r leur coût t et obtenir des résultats r impossibles ou difficiles à atteindre avec les techniques actuellement disponibles. Sélectionner des fournisseurs et une gamme d instruments, d consommables et accessoires permettant à nos clients d atteindre d leurs objectifs. Fournir un service rapide, irréprochable et au juste prix à nos clients. 02/10/2005 Diapo 3

4 Gamme de produits Chromatographes OPLC et OSU Applicateur d éd échantillon, systèmes d imagerie et d archivage, d pulvérisateur de réactifs r automatiques CCM et OPLC Systèmes de Flash chromatographie Chaînes HPLC analytique et préparative parative Détecteurs DEDL pour HPLC et OPLC Passeurs d éd échantillons LC et GC Systèmes de dérivatisation post-colonne Systèmes de préparation paration d éd échantillons Systèmes d analyse d élémentaire Bains de dissolution automatiques Spotter MALDI Automate d analyse d de gel électrophorèse Colonnes HTSorb pour OPLC Colonnes HPLC Cartouches Flash SPE Accessoires et consommables pour électrophorèse capillaire Filtres pour seringues Splitters HPLC Vannes d injection d HPLC Lampes pour détecteurs d HPLC Accessoires bains de dissolution Logiciel CCM et Flash 02/10/2005 Diapo 4

5 Fabricants représent sentés 02/10/2005 Diapo 5

6 Les colonnes Cogent TM Une technologie unique pour la séparation s HPLC des petites molécules et biomolécules. 02/10/2005 Diapo 6

7 Évolution technologique des phases stationnaires pour HPLC Amélioration significative depuis l introduction des petites particules irréguli gulières. Les particules sphériques de plus en plus petites contenant peu de métaux baptisées TYPE-B dénotent cette évolution. MicroSolv Technology a baptisé sa propre phase TYPE-C TM pour marquer sa contribution dans l évolution de la silice pour HPLC. La phase TYPE-C C greffée e (C4, C8, C18 ou Cholesterol) ) est plus stable, moins agressive pour les molécules biologiques et fonctionne dans une gamme de ph plus large. 02/10/2005 Diapo 7

8 Avant l introduction l de la phase TYPE-C TM Toutes les phases stationnaires HPLC à base de silice comportent des groupes fonctionnels silanols (Si( Si-OH) ) qui sont polaires et acides. Même après end-capping et greffage, les 30% à 50% des silanols résiduels r peuvent contribuer à la séparation s et produire des effets indésir sirés à cause des intéractions électrostatiques avec les solutés. s. Pour minimiser l influence l des silanols sur la silice TYPE-B, des groupes C1 sont utilisés s pour couvrir ces sites (end( end-capping). Les groupes C1 sont facilement hydrolysables avec les solvants utilisu tilisés s en phase inverse en dessous de ph 3 La technologie end-capping par C1 est adaptée à des ph de 6 à 9. Cette technologie induit un manque de précision dans les méthodes m car beaucoup de silanols ne sont pas ionisés à aux ph moyens. Les silanols peuvent être totalement ionisés à des ph plus élevés s mais ces ph provoquent la dissolution de la silice. L end-capping est efficace pour retarder cette dissolution qui commence à ph 8. La perte de rétention r à ph élevé n est pas due à une perte de greffage (C4, C8, C18) ou end-capping par des C1 contrairement aux ph bas mais provient de la dissolution de la silice qui contribue à la formation de nouveaux silanols. 02/10/2005 Diapo 8

9 Avant l introduction l de la phase TYPE-C TM Toutes les phases stationnaires HPLC à base de silice possédaient des mécanismes m de séparation s mixtes RP (intéractions avec les ligands greffés) et NP (intéractions avec les groupes silanols sur la silice). Le greffage avec des chaînes carbonées longues (C18) a été développé pour minimiser cette effet. L inconvénient nient du greffage avec des chaînes carbonées sur silice TYPE-B B est qu il diminue les possibilités s pour séparer s des molécules très s polaires et limite le nombre d analytes pouvant être sépars parés s avec succès. s. Cependant ces phases fonctionnent très s bien avec des substances protonnées. Pour réaliser r des séparations s en phase organique normale, les analystes étaient limités à de la silice non greffée e ou des phases spéciales comme les phases Amino ou Cyano. Les supports silice étaient hydroscopiques par nature et retenaient assez fortement l eau, c estc est-à-dire le solvant polaire le plus utilisé. La phase TYPE-B B adsorbait l eau l de la phase mobile à cause des silanols résiduels r et à mesure que la concentration en eau augmentait, la rétention r des analytes changeait. D oùd la nécessitn cessité de contrôler précis cisément la proportion d eau d dans les solvants composant la phase mobile. 02/10/2005 Diapo 9

10 Après s l introduction l de la phase TYPE-C TM La silice TYPE-C C a ouvert un champ de possibilités s considérable. Basé sur la pureté élevée e et la quasi-absence absence de métaux m de la phase TYPE-B, le processus de fabrication de la TYPE-C C continue làl où les autres se sont arrêtés. Le processus propriétaire et breveté de MicroSolv Technology produit une surface ne comprenant que des groupes Si-H très s stables et apolaires. La silice TYPE-C C possède tous les avantages de la TYPE-B B comme l excellente sphéricit ricité,, la faible teneur en métaux, m la pureté élevée, e, la résistance mécanique, m la distribution étroite de la taille des pores, la gamme importante du diamètre des pores, la facilité de modifier la surface chimiquement et l absence l de dégradation d au contact des solvants. 02/10/2005 Diapo 10

11 Silice TYPE-C TM : une chimie de surface unique Surface peuplée e d hydrure d de silice (Si-H)) apolaires au lieu des traditionnels silanols (Si( Si-OH) ) très polaires. Cette particularité de la phase TYPE-C lui confère des propriétés s uniques et utiles en HPLC. Moins d aciditd acidité Stable dans gamme ph plus large Moins hydroscopique Possibilité de travailler en Phase inverse en phase aqueuse sans les inconvénients nients habituels Phase normale en phase organique Phase normale en phase aqueuse 02/10/2005 Diapo 11

12 Comparaison entre silice TYPE-B B et TYPE-C TM 2 mécanismes m de rétention r en HPLC La partition différentielle (des solutés s entre les phases mobile et stationnaires) L adsorption (attraction entre solutés s et surface solide) La silice et le greffage sont responsables de l adsorption en HPLC. La partition se déroule d au niveau de la couche quasi- liquide sur la phase stationnaire. Sur la TYPE-B B l eau l est absorbée à la surface de la silice qui contient les silanols actifs formant une couche hydratante durable responsable : des durée e d éd équilibration très s longues du manque de reproductibilité en phase NP de l hystl hystérèse se ph Les Si-H de la TYPE-C C retiennent peu l eau, l ce qui en fait une phase de choix en phase NP avec des conséquences sur la rapidité et la gamme de solvants utilisables. L adsorption plus faible de l eau l sur la TYPE-C C est responsable de l absence l d hystérèse se en phase inverse lorsqu on on passe d un d éluant organique à un éluant aqueux ou lorsqu on on change le ph sur de la TYPE-C C greffée e comme dans les colonnes Cogent UDC-Cholesterol Cholesterol. 02/10/2005 Diapo 12

13 Des possibilités s de greffage uniques permettent d obtenir d des sélectivits lectivités s uniques Grâce à ses propriétés s uniques, il est possible de greffer n importe n quelle molécule possédant une double ou une triple liaison terminale. Grâce à la solidité des liaisons Si-C, ces phases sont plus stables et résistantes aux conditions d hydrolyse. d Les phases actuellement disponibles sont la TYPE-C Silica TM, TYPE-C Bidentate C TM 18 et TYPE-C C UDC Cholesterol TM 4 µm diamètre particules 100A taille de pore ID de 150 µm à 21,2 mm Longueur de 50 à 250 mm Dimensions spéciales possibles Colonnes pour LC capillaire, LC-MS, Analytique, Mini-Prep Prep, Semi-Prep Prep, Prep et phase en bulk pour process/purification 02/10/2005 Diapo 13

14 Différents mécanismes m de séparations Colonne : Cogent UDC-Cholesterol Cholesterol Réf. : Dimensions : 75mm x 4.6mm ID Phase Mobile : 50% A: Water with 0.05% H3PO4 (ph 2.18) 50% B: Acetonitrile with 0.05% H3PO4 Détection : UV, 210nm Débit : 1ml/minute Contre-pression : 41 bars Une caractéristique ristique unique des colonnes Cogent TYPE-C Silica est que la surface de la silice avec ses liaisons Si-H peut agir indépendamment de la phase greffée e sur les molécules polaires et moyennement polaires. Un exemple de ce mécanisme m peut être observé sur la Metformine et le Glyburide,, 2 anti-diab diabétiques dont les coefficients de partage sont très s différents. Lorsque ces 2 molécules sont sépars parées dans un mélange, m la colonne Cogent TYPE- C Silica produit une bonne séparation s avec un pic correct pour le Glyburide et un pic qui traine pour la Metformine.. Lorsque la colonne Cogent UDC-Cholesterol Cholesterol est utilisée à la place de la Silica,, la forme des pics est excellente pour les 2 molécules. Ce résultats r suggère que le greffage agit différemment de la silice et que la silice agit de la même manière dans les 2 colonnes. 02/10/2005 Diapo 14

15 Caractéristiques ristiques et avantages des colonnes TYPE-C TM pour les chromatographistes Liaisons silyl (Si-C)) au lieu de siloxane (Si-O-Si) Meilleur ancrage sur la surface Meilleure stabilité aux températures plus élevéeses Utilisation avec les acides de Lewis Pas de sels Greffage sur surface peuplée e de Si-H Possible de faire de la phase inverse sur silice Plus stable et durable Silice : ph 2,0 8,2 UDC Cholesterol : ph 2,0 8,2 Bidentate : ph 1,5 10,0+ Qualité d adsorption unique Utilisation de la température comme facteur de sélectivits lectivité Utilisation des acides de Lewis comme additifs à la phase mobile Pas de contaminants Les acides carboxyliques et sulfoniques ne s accrochent s pas Faible activité silanophile Stable à débit élevé jusqu à 3 ml/min Pas de relargage de matière organique 02/10/2005 Diapo 15

16 Caractéristiques ristiques et avantages des colonnes TYPE-C TM pour les chromatographistes Faible association d eau d en surface Facile à «packer» Utilisation avec 100% d eau d sur C18 Pas d hystd hystérèse se due au ph Greffages et associations uniques Colonne facile à utiliser en phase aqueuse Facile et rapide d éd éliminer l eau l de la phase stationnaire Colonnes très s reproductibles et efficaces Pas de perte de rétention r à l usage Possibilité de changer la phase mobile et le ph du tampon très s rapidement Sélectivités s et résolution r de problèmes uniques 02/10/2005 Diapo 16

17 Différence entre les colonnes Cogent Bidentate C18 TM et les autres C18 Les colonnes Cogent Bidentate C18 TM sont fabriquées à partir de silice TYPE-C TM. La silice TYPE-C C et la technologie de greffage brevetée e par MicroSolv permettent d obtenir d des liaisons Si-C offrant 2 points d ancrage à la surface, d oùd le nom Bidentate C18. Ces colonnes donnent d excellents d résultats r non seulement en en mode inverse classique (solvants aqueux) mais aussi en phase normale (solvants aqueux ou organiques). 02/10/2005 Diapo 17

18 Avantages des liaisons Bidentate Si-C Les liaisons entre les chaînes C18 et la silice TYPE-C TM sont très stables et moins sujettes à l hydrolyse. Les colonnes ont des durées de vie plus longues ce qui permet d utiliser les équipements en routine plus longtemps. Une gamme de solvants et d additifs d plus large peut être utilisée pour des séparations s que les autres colonnes C18 ne peuvent pas réaliser. 02/10/2005 Diapo 18

19 Exemples d utilisations d possibles avec la Bidentate C18 par rapport à la C18 standard Possible d utiliser d 100% d eau d comme phase mobile avec des molécules qui n ont n aucune rétention r en phase inverse avec des phases aqueuses contenant des solvants organiques. Pas de risque de perte de rétention r dans le temps et de méthodes m instables constatées avec les colonnes C18 habituellement. Utilisation possible de ces colonnes en phase inverse et phase normale n au cours du même run avec des molécules ionisables. Séparation de substances d hydrophobicitd hydrophobicité très s différentes en un seul run isocratique. La Bidentate C18 est bien plus rétentrice r avec certains solvants que les C18 actuelles. Très s utile pour les molécules très s polaires. Cette phase est très s stable à ph 10 avec NaOH ou 20 mm NH4COOH- NH4OH Pas de relargage de la phase ni détérioration d de la colonne ou de ses performances 02/10/2005 Diapo 19

20 Application: 100% H2O pour produits polaires Les produits très s polaires sortent dans le front de solvant en RP avec des colonnes C18 classiques La Bidentate C18 permet de les retenir car possible d utiliser 100% H 2 O L exemple ci-contre contre montre une séparation s isocratique de plusieurs acides organiques avec 100% H 2 O sans perte de rétention r dans le temps, efficacité ou forme des pics Dans cette expérience, la colonne est utilisée pendant 3 heures avec 100% d eau d sans changement dans les résultats r obtenus Colonne Cogent Bidentate C18 Réf R Dimensions 75mm x 4.6mm id Débit 1ml/minute Phase Mobile 100% Aqueous H3PO4 0.05% v/v Détection UV 255nm Pics Oxalic Acid, Formic Acid, Acetic Acid,, Sodium Azide, Uracil, Fumaric Acid, Propionic Acid 02/10/2005 Diapo 20

21 Application: gradients aqueux faciles à réaliser Colonne Cogent Bidentate C18 Réf Dimensions 250mm x 4.6mm id Débit 1ml/minute Phase Mobile 0-44 min: 5% ACN : 95% eau/tfa (0,1% v/v TFA) 4-10 min: 15% ACN : 85% eau/tfa (0,1% v/v TFA) min 5% ACN : 95% eau/tfa (0,1% v/v TFA) Détection UV 270nm Vol. injection 5 µl Pics 1. Niacinamide 2. Thiamine 3. Pyridoxine 4. Acide folique 5. Riboflavine Puisque l eau l n est n pas fortement retenue dans la Cogent Bidentate C18, les changements rapides dans la composition des gradients sont faciles à réaliser. Les changements rapides peuvent améliorer la performance en permettant des gradients linéaires très s pentus ou même des «step» gradients. La plupart du temps il n est n pas nécessaire n de modifier la phase mobile avec en utilisant des modificateurs agressifs tels que l acide l hexanesufonique utilisé pour la séparation s de vitamines (cf( exemple ci-dessus). L acide hexanesufonique est connu pour les dommages occasionnés s aux colonnes. Avec la colonne Cogent Bidentate C18, le TFA suffit à obtenir une bonne forme de pic, de la rétention et des résultats r sans risques pour la colonne. 02/10/2005 Diapo 21

22 Application: gamme de phases mobiles plus étendue pour les problèmes de solubilité Colonne Cogent Bidentate C18 Réf Dimensions 75mm x 4.6mm id Débit 1ml/minute Phase Mobile 95% Hexane : 5% THF Détection UV 255nm Pics Carvone Une colonne Cogent Bidentate C18 peut être utilisée e en phase normale avec des solvants phase inverse, en phase normale avec des solvants organiques ou en phase inverse classique. Dans ces 3 modes d utilisation, d cette colonne n est n sujette à aucun phénom nomène ne d hystd hystérésis sis lorsqu on on pas d un d mode à l autre même pendant des périodes p prolongées. Si l él échantillon n est n pas soluble dans l eau, l il est possible de passer à une phase mobile 100% organique comme 100% d hexane. d 02/10/2005 Diapo 22

23 Un choix de colonnes adapté à/au Développement de méthodesm Recherche pharmaceutique Études du métabolismem Synthèse à haut débitd Protéomique omique Chromatographie préparative parative 02/10/2005 Diapo 23

24 Pour plus d information d sur les colonnes MicroSolv Technology Pour plus d information d sur les colonnes : Cogent Bidentate C18 Cogent Bidentate C8 Cogent Bidentate UDC Cholesterol Cogent HPS Cogent hq et bien d autres d produits, visitez le site web 02/10/2005 Diapo 24

25 Coordonnées de Disruptive Technologies Contact: William Amoyal Disruptive Technologies 9 rue Léon L Cogniet Paris Mobile: wamoyal@disruptechno.com Web: (en cours de construction) 02/10/2005 Diapo 25

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