Anne-Françoise ROUX & Emmanuelle GIRODON VALIDATION DE METHODES : SEQUENCAGE SANGER, MLPA, COMPARAISONS INTER-LABORATOIRES : EEQ et CIL

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1 GROUPES DE TRAVAIL Anne-Françoise ROUX & Emmanuelle GIRODON VALIDATION DE METHODES : SEQUENCAGE SANGER, MLPA, COMPARAISONS INTER-LABORATOIRES : EEQ et CIL GROUPES DE TRAVAIL «NGS» RECOMMANDATIONS POUR LES COMPTES-RENDUS DE RESULTATS RIHN : PROPOSITIONS POUR LA REVISION Bio V5.2

2 GROUPES DE TRAVAIL «NGS» Coordination : J. Muller et M. Goossens 1. Cahier des charges informatique, bio-analyse / bio-informatique ; bases de données mutations (J Muller & C Houdayer+ 10 pers) 2. Techniques/technologies, négociation des tarifs avec les fournisseurs (P Gueguen & E Pasmant+ 5 pers) 3. Ethique, compte-rendu, consentement, découvertes fortuites (A Piton & AF Roux + 10 pers) 4. Validation de méthode (B Gérard + 9 pers) 5. Panelsmis en place dans les réseaux et filières (B Arveiler+ 10 pers)

3 GROUPES DE TRAVAIL «NGS» 1. Cahier des charges informatique, bio-analyse / bio-informatique ; bases de données mutations (J Muller & C Houdayer) a) Cahier des charges : que faut-il demander à nos directions d'hôpitaux? Recommandations à établir : serveurs, stockage, archivage, logiciels, b) Expérience sur les différents logiciels de bio-analyse c) Conservation des données d) Version de logiciel, profondeur de lecture, bases de données utilisées lors de l interprétation (transversal avec le GT Qualité) 2. Techniques/technologies, négociation des tarifs avec les fournisseurs (P Gueguen & E Pasmant) a) Choix de technologie, raisons, comparaisons (capture, amplicons multiplex, haloplex) b) Cartographie de ce qui est fait dans les différents laboratoires + contraintes / avantages (type de machine, technologie, ) c) Amélioration des protocoles d) Négociation avec les fournisseurs (Agilent, Life Technologies, Illumina )

4 GROUPES DE TRAVAIL NGS 3. Ethique, compte-rendu et consentement, découvertes fortuites (A Piton & AF Roux) a) Recommandations pour les comptes-rendus : en cours de finalisation b) Consentement : modèle proposé par la fondation Maladies Rares en discussion (ABM) c) Interactions entre laboratoires analysant de gros panels de gènes et les laboratoires experts pour les différents gènes (travail des réseaux) d) Soumissions aux banques de données internationales (ex: ClinVar, LSDBs, ) 4. Validation de méthode (B Gérard) a) Validations des méthodes et différentes techniques : profondeur, SNP, CIQ systématiques (identitovigilance) b) Validation des pipelines bioinformatiques c) Archivage d) Analyse des risques 5. Panels mis en place dans les réseaux / filières (B Arveiler) a) Bilan des panels de gènes par groupe de pathologies. Standardisation au plan européen b) Enquête «Base de Données des tests disponibles par NGS» en relation avec EuroGentest c) Interaction Réseaux et Filières

5 RECOMMANDTIONS POUR LES COMPTES-RENDUS DE RESULTATS Groupe de travail: Amélie Piton (Strasbourg), Anne-Françoise Roux (Montpellier), Emmanuelle Girodon (Cochin, Paris), Stéphanie Baert-Desurmont (Rouen), Marie-Pierre Buisine (Lille), Nelly Burnichon (HEGP, Paris), Laurent Castera (Caen), Claude Houdayer (Institut Curie (Paris), Eulalie Lasseaux(Bordeaux), Anne- Sophie Lèbre (Reims), Pascale Levy (ABM, Paris), Gert Matthijs(Leuven, Belgique) Préambule - Interprétation : mêmes exigences (concision, clarté) - Données en accord avec la prescription (consentement) - Documents de références : bonnes pratiques Fr., Intern., Claustres et al. EJHG 2014 Compte-rendu 1) Méthode (liste des gènes, technique d enrichissement, % de couverture des gènes, etc) Sensibilité de diagnostic : dépend des connaissances + de la Se analytique! 2) Limitesde la technique : CNV? 3) Confirmationdes résultats en Sanger: Variantspathogènes (Cl 4&5) + UV Cl 3 à adapter en fonction de l indication d étude : CF ou CFTR-RD 4) Variantsà mentionner dans le CR : idem 5) Découverte fortuite : attention au consentement Disponibles prochainement sur le site

6 RECOMMANDATIONS POUR LES COMPTES-RENDUS DE RESULTATS METHODES : ITEMS Liste gènes faisant l objet du rendu, n acc Si panel élargi, le mentionner Technique d enrichissement Séquenceur Pipeline bioinformatique % couverture gènes /régions pour profondeur > seuil défini Recours au séq Sanger pour régions de couverture insuffisante CFTR CFTR: NM_ , NG_ /- gènes pancréatites Capture : SureSelect XT, Agilent, Amplification : AmpliSeq PGM (Life Technologies) MiSeq (Illumina) NextGENe, Ion Reporter, Sophia Genetics, Cartagenia, SeqNext CFTR exigé: 100% +/- à mentionner en un seul item Sensibilité analytique Validation de méthode! Disponibles prochainement sur le site

7 EXEMPLE DE COMPTES-RENDUS DE RESULTATS ANALYSE MOLÉCULAIRE Nomenclature HGVS suivie pour les mutations (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app, nomenclature traditionnelle entre parenthèses) et la numérotation des exons Séquences de référence: GenBank NM_ ; NG_ Recherche de 32 mutations fréquentes par la trousse CF OLA (Cystic Fibrosis Genotyping Assay,Abbott; version 3) : c.254g>a (G85E), c.262_263del (394delTT), c.350g>a (R117H), c.489+1g>t (621+1G>T), c.579+1g>t (711+1G>T), c.1000c>t (R334W), c.1040g>c, (R347P), c.1040g>a (R347H), c.948del (1078delT), c.1364c>a (A455E), c.1519_1521del (I507del), c.1521_1523del (F508del), c.1558g>t (V520F), c g>a (1717-1G>A), c.1624g>t (G542X), c.1652g>a (G551D), c.1657c>t (R553X), c.1679g>c (R560T), c.1647t>g (S549R(T>G), c.1646g>a (S549N), c g>a (1898+1G>A), c.2051_2052delinsg (2183AA>G), c.2052del (2184delA), c g>a (2789+5G>A), c g>a (3120+1G>A), c.3484c>t (R1162X), c.3528del (3659delC), c c>t ( kbC>T), c.3846g>a (W1282X), c.3773dup (3905insT), c.3744del (3876delA), c.3909c>g (N1303K) Etude des 27 exons du gène CFTR ainsi que des régions introniques flanquantes par séquençage de nouvelle génération (NGS) pour la détection des mutations ponctuelles et des grands réarrangements à type de délétion : 1) Design AmpliSeq et analyse sur PGM (Life Technologies) 2) Couverture: 100% des séquences codantes de profondeur > 40X ; régions introniquespour la détection des mutations c a>g (1811+1,6kbA>G) et c _1110delt ( _1110delGAAT) 3) Analysedes données brutes par NextGENe et Ion Reporter (mutations ponctuelles) et Coverageanalysis(réarrangements) Confirmation de la présence des mutations par séquençage selon la technique Sanger Confirmation de la présence de la délétion par PCR avec amorces spécfiques/ MLPA Sensibilitéde l étude réalisée : diag = 99%... Mais limitée par la Se analytique du NGS!!!

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9 Principes PROPOSITIONS POUR LA REVISION DU RIHN Bio V5.2 1) Forfaitiser les activités de génétique moléculaire en distinguant le préanalytique & l analytique du post-analytique 2) Privilégier l utilisation du NGS et valoriser l interprétation des résultats et les validations fonctionnelles 3) Proposer au remboursement NABM des examens «simples» ne répondant aux critères de l innovation (exemple de quelques examens de pharmacogénétique) 4) Actualiser et harmoniser les cotations NABM et RIHN pour le diagnostic prénatal CFTR Forfaits Séquençage* Mise en œuvre Interprétation Total FG3 < 20 kb RIHN RIHN 400 RIHN FG4 > 20 et < 100 kb RIHN RIHN RIHN FG5 > 100 et < 500 kb RIHN RIHN RIHN FG6 > 500 kb RIHN RIHN RIHN *Incluant la confirmation par Sanger

10 En pratique pour les arbres décisionnels CFTR SITUATION PRISE EN CHARGE PROPOSEE 1) Mucoviscidose, ABCD, CFTR-RD - Trousse mut fréq : B400 à réviser (chap 18) - NGS : RIHN ) Conjoint mucoviscidose - Trousse mut fréq : B400 - NGS : RIHN ) Anomalies digestives foetales - Trousse mut fréq : B /-Origines géo : RIHN 200 (N036)? - +/- Séq complet Sanger: RIHN 200 (N036)x32 - +/- MLPA/QFM : RIHN 500 (N318) 4) Conjoints d hétérozygotes - Trousse mut fréq : B /-Origines géo : RIHN 200 (N036)? 5) Apparentés : rech mut familiale - Trousse mut fréq : B /-Sanger prmut rare identif/ngs : RIHN ou Sanger pr mut rare nonidentif/ngs :RIHN 200 (N906/N036)? 6) DPN - A réviser PROPOSITIONS POUR LA REVISION DU RIHN Bio V5.2

Version 11/07/2016 Page 1/8

Version 11/07/2016 Page 1/8 Date de Création : 23/05/2014 Date de la remise à jour : 11/07/2016 Nom Hôpital Date Rédacteur(s) Piton Amélie CHU Strasbourg 23/05/2014 Roux Anne-Françoise CHU Montpellier Girodon Emmanuelle CHU Cochin

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