Formation INSERM : Les Biopuces. Méthodes bioinformatique d analyse des puces à ADN - 1 ère partie

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1 Formation INSERM : Les Biopuces Méthodes bioinformatique d analyse des puces à ADN - 1 ère partie ENS - 9 février 2004 Laboratoire de Génétique Moléculaire - CNRS Laboratoire de Biologie Moléculaire du Développement - INSERM Plate-forme transcriptome - ENS Stéphane LE CROM -

2 Les étapes d une expérience de puces à ADN Étapes expérimentales Analyse des données Mise au point expérimentale Puces commerciales Puces maison Base de données disponibles Hybridation des puces Fouille de données Analyse de l image Traitement des données brutes - Normalisation - Analyse statistique - Stockage Traitement des données Représentation informative des données - Regroupement

3 Analyse bioinformatique des puces à ADN Analyse de l image

4 Lecture du résultat des hybridations Excitation des fluorochromes à la longueur d onde appropriée GenePix Axon Instrument ( ScanArray - Packard BioChip Technologies ( GeneTAC Microarray Analyzers - Genomic Solutions ( IRIS - University of Pennsylvania (

5 Obtention de l image Longueur d onde du Cy5 Longueur d onde du Cy3 Image finale

6 Principes généraux de l analyse d image But : Convertir l image en valeurs numériques quantifiant l expression des gènes Il existe des logiciels d analyse d image ScanAlyze (M. Eisen Stanford University) Genepix Pro (Axon software)

7 Les différentes étapes de l analyse d image 1 Localisation des spots sur la lame Pour chaque spot : 2 Délimitation des pixels correspondant à la zone d hybridation 3 Délimitation des pixels pour l estimation du bruit de fond 4 Calcul de l intensité globale de fluorescence Sur l ensemble de la lame : 5 Identification des spots déformés par des artéfacts

8 1- Localisation des spots sur la lame Il est important d assigner à chaque spot un identifiant de gène correct!

9 2 - Délimitation des pixels de la zone d hybridation Différentes méthodes sont possibles (segmentation)!: - Cercles à diamètres fixes - Cercles à diamètres variables - Histogrammes - Formes «!adaptée!» Cercles à diamètre fixe Cercles à diamètre variable Plusieurs logiciels sont disponibles!: - GenePix Pro - ScanAlyze - QuantArray - ImaGene - Dapple D après «!Microarray Bioinformatics!», Dov Stekel Intensité variable Méthode par histogramme

10 3 Délimitation des pixels du bruit de fond Les signaux observés ont deux composantes : Fluorescence issue d une hybridation spécifique Fluorescence non spécifique : Bruit de fond Analyse des pixels localisés à proximité de la région spottée : Méthode «ScanAlyze» Méthode «ImaGene» Méthode «GenePix» Zone de spotting Bruit de fond

11 4 Calcul de l intensité globale de fluorescence Intensité à l intérieure du spot Mesure du bruit de fond Intensité par pixel Moyenne ou médiane? Intensité globale du spot Critère qualité : taille du spot, déviation standard

12 5 Annotation des spots non conformes Quelques exemples : 500 µ Spots diffus Spots hétérogènes Spots en «beignets»

13 Obtention de l image (GeneChip Affymetrix) PM MM Des paires d oligonucléotides sont crées pour chaque gènes (8-10) : perfect match mismatch PM MM gènes de souris par lame

14 Détermination des pixels conformes Calcul du bruit de fond de la lame : La mesure est basée sur les 2% de cellules avec les intensités les plus faibles et ceci dans plusieurs blocs sur la lame. Détermination des valeurs moyennes : Image obtenue pour un gène Valeur moyenne calculée pour chaque cellule > Calcul du nombre de paires positives ou négative (matrice de décision) > Détermination de l état du gène (présent, marginal ou absent)

15 La récupération des résultats de l analyse d image Exemple d un fichier de sortie de logiciel d analyse d image : Position Intensités Taille Homogénéité Statistiques Brutes BDF Annotations

16 Analyse bioinformatique des puces à ADN Normalisation et nettoyage des données

17 Les sources de variations d une puce à ADN Quantité d ADN Efficacité de : - l extraction des ARN - la reverse transcription - l étape du marquage - des fluorochromes Erreur systématique => Effets similaires sur plusieurs mesures => Les corrections peuvent se mesurer à partir des données Rendement de la PCR Qualité des ADN déposés et du spotting Effets de cross-hybridation et hybridation non spécifique Erreur stochastique => Effets qui se produisent de façon trop aléatoire et qui du coup ne peuvent se mesurer comme du bruit Calibration Modèle d erreur

18 1 ère étape : Le nettoyage des données 1 Élimination des gènes dont l annotation est différente de 0 (Éventuellement retourner voir l image originale) 2 Filtrage sur les intensités : - Saturation du scanner - Écart avec le bruit de fond trop faible 3 Il est nécessaire d appliquer certaines transformations mathématiques au données pour faciliter leur analyse :

19 La transformation logarithmique Les effectifs sont plus important vers les faibles intensités Les intensités sont distribuées de façon uniforme Remarque : On choisira le logarithme en base 2 pour les analyses

20 Effet sur la distribution des intensités : La transformation logarithmique La plupart des intensités mesurées sont faibles Distribution «en cloche» Recentrage de la distribution : Facilite l utilisation des statistiques D après «Microarray Bioinformatics», Dov Stekel

21 La rotation des graphiques log 2 R vs log 2 G M=log 2 R/G vs A=log 2 RG

22 Les graphiques MA (MA plot) Différences des intensités : M = log ratio = log f/g = log f - log g Contre la moyenne géométrique des intensités : A = log moyenne géométrique = log fg = [log f + log g]/2. En règle générale, f = intensité en Cy 5 pour un spot sur une puce sur lame de verre ADNc et g = intensité Cy3 pour le même spot sur la même lame.

23 2 ème étape : La normalisation Pourquoi faire? Pour corriger les différences systématiques entre les échantillons sur la même lame, ou entre les lames, qui ne représentent pas de véritables variations biologiques entre les échantillons. Pourquoi la normalisation est nécessaire? En examinant les réplicats et/ou les hybridations contre le même échantillons, où de vraies différences d expression n apparaissent pas. On retrouve des biais qui varient avec l intensité globale des spots, leur localisation sur la lame, les fluorochrome, les plaques d origines, les pointes de dépôts, les scanner, les paramètres du scanner,

24 2 ème étape : La normalisation Le but est d ajuster ou de corriger les données brutes dans l espoir d enlever les effets systématiques, en gardant à l esprit : que la distinction entre les effets systématiques et les autres est souvent loin d'être claire; qu il est d habitude assez difficile de démontrer que l on améliore et pas que l on diminue le «vrai» signal; que déterminer de façon juste quel est l ajustement idéal est très difficile.

25 Quels spots utiliser pour normaliser? Utilisation de contrôles positifs - Prise en compte de spots contenant des gènes de ménages ou de l ADN génomique - Les contrôles positifs doivent être détectables, posséder une expression stable et tomber dans la gammes de détection du scanner Avantage : peu de gènes sont nécessaires Inconvénient : ces gènes subissent trop de fluctuations non contrôlées dans les systèmes biologiques Mesure de l intensité globale - Utilisation de l intensité globale sur toute la membrane, mesurée pour tous les spots - La mesure de l intensité globale doit s effectuer sur un nombre suffisant de spots et doit utiliser des valeurs homogènes Avantage : mesure efficace sur un grand nombre de spots Inconvénient : il est nécessaire que la majorité des gènes analysés n ait pas une expression modifiée

26 Les différentes méthodes de normalisation 1) Normalisation basée sur un ajustement global : log 2 R/G Æ log 2 R/G - c = log 2 R/(kG) Le choix pour k ou c = log 2 k sont de plusieurs types : c = médiane ou moyenne des log de ratios pour un gène particulier ou un ensemble de gènes (gènes de ménage) MA plot avec médianes 0 Régression linéaire Cy5/Cy3 c = normalisation en utilisant les intensités totales où : k = R i / G i.

27 Les différentes méthodes de normalisation 2) Normalisation dépendante des intensités : Dans ce cas on trace une ligne à travers le centre des MA plot, en modifiant la valeur de M dans chacun des points (M,A) en utilisant c=c(a), soit : log 2 R/G Æ log 2 R/G - c (A) = log 2 R/(k(A)G). Une estimation de la valeur de c(a) est faite en utilisant une méthode de régression qui utilise la fonction lowess de Cleveland (1979) : LOcally WEighted Scatterplot Smoothing

28 Normalisation par Lowess Courbe de régression Régression linéaire locale Paramètres à prendre en compte : - Taille des fenêtres - Chevauchement entre les fenêtres

29 Normalisation par Lowess Avant Après Normalisation intensités globales Normalisation dépendante des intensités

30 Les différentes méthodes de normalisation 3) Normalisation en prenant en compte les pointes de spotting En plus des variations dépendantes de l intensité, un biais spatial peut aussi être une source importante d erreur systématique. Peu de méthodes de normalisation corrigent les effets spatiaux qui produisent des artéfacts d hybridation comme les pointes de spotting ou les différentes plaques lors de la production des lames. Il est possible de corriger en même temps les biais dû à l intensité et aux différentes pointes utilisées en effectuant une régression par Lowess sur les données à l intérieur de chaque groupe de pointes soit : log2 R/G Æ log2 R/G - ci(a) = log2 R/(ki(A)G), où ci(a) est le coefficient de régression Lowess sur le MA plot pour la grille i.

31 Lowess par groupes de pointes Lame de verre Lames de verre avec ADNc 4x4 blocs = 16 groupes de pointes

32 Quels spots utiliser pour la normalisation? L utilisation de la méthode Lowess globale suppose à l échelle de l abondance des ARNm : - que seulement une minorité de gènes est exprimée de façon différentielle - que toutes les expressions différentielles sont aussi bien induites que réprimées Pour la méthode spécifique des groupes de pointes, il est nécessaire que les conditions précédentes soient respectées pour chaque groupes. D un point de vue statistiques le nombre de spots concernés ne doit pas être trop faible. L utilisation d ensemble de gènes spécifiques pour la normalisation (contrôles, gènes de ménage) impliquent des hypothèse similaires.

33 Les différentes méthodes de normalisation Avantages Inconvénients Régression linéaire (Cy5 vs Cy3) Méthode très simple Bonne vision d ensemble des données Asymétrie entre Cy5 et Cy3 Peu efficace sur les nuages déformés Régression linéaire «MA plot» Méthode très simple Alignement sur une horizontale Peu efficace sur les nuages déformés Lowess Marche bien sur les nuages déformés Correction à la fois des intensités en Cy5 et Cy3 Requiert l utilisation de logiciels statistiques Nécessite de faire attention aux paramètres de la régression

34 La normalisation : résumé La normalisation : Réduit les effets systématiques (non aléatoires) Rend possible la comparaison entre plusieurs puces à ADN On conseille : Utilisation des log 2 de ratios (MA plot) Normalisation Lowess (biais des fluorochromes) Normalisation en utilisant les informations de blocs En principe : Les spots mauvais sont éliminés avec les réplicats Les améliorations à apporter : Utilisation d une méthode de normalisation adaptive permettant d adopter une méthode adaptée aux données concernées, ni trop, ni trop peu. Il est important de ne pas laminer les variations ni de faire apparaître des faux positifs.

35 Normalisation La normalisation avec les puces Affymetrix Comparaison entre deux expériences : - Chaque condition est hybridée sur une seule membrane. - L utilisation des intensités globales permet la normalisation de toutes les valeurs et donc la comparaison des deux expériences Standardisation Comparaison entre plusieurs expériences : - Toutes les expériences doivent être comparées à une condition contrôle. - Il est nécessaire d utiliser une intensité cible, fixée arbitrairement ou obtenue de façon absolue (gènes de ménage).

36 Analyse bioinformatique des puces à ADN Stockage des données

37 Gestion du flux d information obtenu Exemple d une structure de gestion des données Base de données Base de données Web Publiques Internet Intranet Images obtenues avec le scanner Images Analyse d images Données brutes Serveur de Fichier Données brutes Résultats normalisés Normalisation Données publiées Résultats normalisés Interface serveur

38 L organisation des données de puces à ADN Il y a trois grands niveaux d organisation des résultats : 1. Les entrepôts de données publics Construits de la façon la plus flexible possible pour permettre le stockage de données hétérogènes provenant d organismes différents et traités dans des conditions différentes. 2. Les bases de données institutionnelles Construites dans le but de répondre à une communauté d utilisateur sur un plateau technique particulier. 3. Les bases de données installées localement Construites pour un petit groupe d utilisateur et à même de répondre à des besoins particuliers et spécifiques.

39 Un élément central : le LIMS Base de données locale pour le suivi des expériences LIMS = Laboratory Information Management System - Toutes les étapes du protocole expérimental sont stockées dans la base de données. - Le LIMS permet le suivi des lames et des contrôles de qualité. - La structure flexible du LIMS permet l analyse de différents types de lames. - Un ensemble de tables de correspondance est disponible pour aider à la détermination du nom des gènes et la liaison avec la fouille de données. - Le stockage des données et des processus permet différents types de visualisation - Les caractéristiques du LIMS sont paramétrables et ajustables aux besoins (tables supplémentaires, modules d interrogation spécifiques). Le LIMS se doit d être modulaire Lames de verre Puces à oligonucléotides

40 La construction d un LIMS Les étapes clefs de la construction d une base de données : 1. Bien choisir son gestionnaire de base de données - Prendre en compte son prix, sa facilité d utilisation et ses capacités à s agrandir Robustesse Simplicité Prix Oracle *** * MS SQL ** ** PostgreSQL ** * 0 MySQL ** * 0 Access * *** FileMaker * *** 2. Prendre son temps pour réfléchir au modèle à utiliser 3. Penser aux aspects de sécurité des données (perte de données, corruption, ) 4. Toujours conserver les données sous leur forme d origine

41 La construction d un LIMS Les étapes clefs de la construction d une base de données : 5. Créer des filtres pour l import et l export des données - Certains langages sont plus adaptés à ce type de manipulations (PHP, Perl, Java, ) 6. Construire des liens vers les données externes 7. Utilisez les standards disponibles - HTML, SQL - MIAME, MAGE-OM 8. Conservez des traces des modifications et des étapes de traitement des données 9. Pensez à SAUVEGARDER vos données 10. Essayez de construire une structure évolutive - Il est impossible de résoudre tous les problèmes en une fois

42 La standardisation des données - MGED Pourquoi définir un standard? - Pour spécifier quelles sont les informations minimales à donner pour caractériser une expérience de puces à ADN - Pour permettre l interprétation des données ainsi que la vérification par d autres - Pour faciliter la mise en place d entrepôts de données ainsi que l échange de résultats entre les laboratoires

43 La définition d un standard - MIAME MIAME - Minimum Information About Microarray Experiment : - Le standard MIAME est défini comme l ensemble des informations minimales qui doivent être fournies avec les données de puces à ADN pour permettre leur utilisation, re-normalisation ou ré-interprétation éventuelle. - Ce standard est constitué de 6 différentes parties : 1. Le modèle expérimental : contient l ensemble des informations d hybridation. 2. Le modèle des puces à ADN : contient les informations sur chaque puce utilisée et sur les éléments (spots) qui y sont présents. 3. Échantillons : contient la description de chaque échantillons employés avec les conditions de préparation et de marquage. 4. Hybridations : contient les protocoles et paramètres. 5. Mesures : contient les données, les images et les méthodes de quantification. 6. Contrôles : contient la description des différents contrôles utilisés.

44 But : Les entrepôts de données d expression - Offrir l accès aux données brutes pour valider les données publiées - Permettre la comparaison avec d autres groupes - Permettre la comparaison des design de puces - Favoriser le développement de nouvelles méthodes d analyse Exemples : - ArrayExpress - EBI - Gene Expression Omnibus - NCBI - Stanford Microarray Database - Stanford - ExpressDB - Harvard

45 La bioinformatique et le «transcriptome» à l ENS Stéphane LE CROM - Gaëlle LELANDAIS - Sophie LEMOINE

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