DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES (Aliments des animaux crème glacée (non accrédité)) Version 10 Date d application

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1 Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire Administration des Laboratoires MET-LFSAL-003 DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES (Aliments des animaux crème glacée (non accrédité)) Version 10 Date d application Rédaction par : Marianne Aubry, Responsable technique Révision par : Responsable qualité LFSAL ; Autorisation de publication par : Patrick Genot Manager LFSAL ; Gestion et localisation de la version valide : Responsable qualité LFSAL; Serveur du LFSAL Destinataires : Collaborateurs de la section Chimie humide Mots clefs : Aliments des animaux, Protéines, PBT, qualité substantielle, crème glacée LAB23 I-MET003 Protéine brute-v09 05/08/2011

2 Aperçu des modifications * Révision par/date* EVRARD M / 15/06/2006 Aubry /03/02/2009 Aubry / 03/03/2010 MA/ 04/08/2011 MA/ 04/08/2011 Adaptation à la méthode Kjeltec Motif de la révision Adaptation du programme Kjeldhal 1 et nv template Ajout de remarque et correction de la valeur de recouvrement du contrôle Veille normative Mise à jour de la méthode Adaptation suite à publication d un nouveau dossier de validation Partie du texte/portée de la révision Tout Tout 10 et 11 * L écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans. Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge. LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

3 TABLE DES MATIERES 1 OBJECTIF CHAMP D APPLICATION DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS DEFINITIONS ET ABREVIATIONS PRINCIPE CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES CONSIGNES DE SECURITE ET MESURES SPECIFIQUES REACTIFS APPAREILS METHODE PRÉPARATION DE L ÉCHANTILLON ETAPE D ANALYSES Prise d essai Minéralisation Distillation et ti ration t CONTROLE DE QUALITE CONTROLE DE 1 ERE LIGNE CONTROLE DE 2 EME ET 3 EME LIGNE CONTROLES SUPPLEMENTAIRE CALCUL ET RAPPORTAGE REFERENCE AUX PROCEDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFERENTS PROCEDURES LISTE FORMULAIRES... 8 LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

4 1 Objectif Décrire la méthode de dosage de l Azote selon la méthode de Kjeldahl en vue du calcul conventionnel de la teneur en protéines brutes dans les aliments pour animaux. 2 Champ d application Cette procédure s applique à toutes les analyses d azote pour lesquelles il n y a pas nécessité de distinguer entre azote protéique et azote non protéique. 3 Documents légaux et normatifs Méthode dérivées de : Norme/Fil conducteur NBN EN ISO :2005 et -2 :2009 Aliments des animaux - Détermination en azote et calcul de la teneur en protéines brutes ISO 1871 : Ligne directrice pour la détermination de l azote par méthode Kjedhal Clauses Dérivé de la norme Norme 4 Définitions et abréviations Terme Origine de la définition Définition Pas d application Abréviation Origine Signification PBT - Protéines Brutes 5 Principe Minéralisation de la matière organique par l acide sulfurique en présence d un catalyseur, alcalinisation des produits de la réaction, distillation et titrage de l ammoniac libéré. L azote Kjeldahl de l échantillon est d abord transformé en ammoniaque par digestion acide dans un batch de minéralisation. L addition d une base forte permet de libérer l ammoniac qui est alors entraîné par de la vapeur d eau puis ensuite piégé dans une solution d acide borique. L ammoniaque est alors dosé par une solution d acide sulfurique de titre connu. Le point d équivalence est repéré par le changement de coloration d un indicateur. La teneur en protéines brutes du produit est obtenue en multipliant la valeur obtenue lors de la détermination de la teneur en azote par le facteur 6,25 dans le cas des aliments pour animaux et 6,38 pour les produits laitiers. 6 Caractéristiques de performances Voir données du dossier de validation LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

5 7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques - Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et dans le log book de l'appareil. - Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte. 8 Réactifs - Eau déminéralisée (R144) - Sulfate de sodium anhydre (R025) - Acide borique 1 % avec indicateur (R442) - Acide sulfurique concentré (H 2 SO 4, 95 %, (R001) - Acide sulfurique 0.5 N (R122) - Hydroxyde de sodium 40 % (R460) - Hydroxyde de sodium 32 % (R431) - Catalyseur : Kjeltabs Cx R007 (5.0 g K 2 SO g CuSO 4. 5H 2 O ) - Saccharose (R006) - Anti-mousse siliconé (R414) - Bleu de bromothymol (R074) - Tryptophane à minimum 98.5 %(R461) - Sulfate d ammonium, pureté > 99.5 % (R030) 9 Appareils - Kjeltec 2400 FOSS : unité de distillation et de titration munie d un passeur automatique - Balance analytique à 10-4 g - Unité de minéralisation FOSS avec programmateur - Tubes de minéralisation de 250 ml et portoirs - Distributeur d acide sulfurique réglé sur 12 ml 10 Méthode 10.1 Préparation de l échantillon L échantillon est préparé suivant les directives de la procédure «LAB23 P011 Préparation des échantillons» LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

6 10.2 Etape d analyses PRISE D ESSAI Remarque : Prévoir un tube vide en début de rack pour effectuer les rinçages Dans des tubes à minéralisation, introduire une prise d essai d environ exactement 1g (pour les échantillons à haute teneur en protéines (>30% prendre une prise d essai de 0,5g), deux pastilles de catalyseur Kjeltabs et 12,5 ml d acide sulfurique concentré (R001) en commençant par le blanc (réactif sans échantillon). Placer les tubes dans un rack et compléter celui-ci à l aide de tubes à minéralisation vide MINÉRALISATION Allumer le bloc de minéralisation et l ascenseur associé Vérifier la validité des solutions du scrubber : Le flacon de gauche est remplit à son niveau minimum d eau distillée ; le flacon de droite est rempli avec un mélange 50/50 NaOH 32% (R431) / Eau distillée sans dépasser le niveau maximum ; quelques gouttes de bleu de bromothymol (R074) (bleu) indiquent que le ph de la solution est basique (remplacer la solution si l indicateur a viré au jaune). Retirer le support de protection des calottes d aspiration. Placer le réflecteur sur la partie avant du rack et déposer celui-ci sur les bras latéraux de l ascenseur au-dessus du bloc de minéralisation. Vérifier à l aide du bouton poussoir de l ascenseur que les tubes rentrent sans frottement dans les encoches prévues à cet effet. Relever les tubes. Vérifier le programme sur le contrôleur : N programme Temps Température 1 1 min 30 C 2 1h C (Montée en T ) 3 1h C (Attaque) 4 0h00 10 C (mode STOP) Mettre la minéralisation en route en actionnant la fonction RUN du contrôleur. Le scrubber se mettra automatiquement en fonctionnement. La minéralisation terminée, laissé reposer au moins 45 minutes avant de distiller. Replacer le support de protection des calottes d aspiration. Remarque - S il y a des particules noires dans le minéralisateur ou sur les parois du tube, stopper la minéralisation, laisser refroidir et avec une pissette d eau distillée, faire tomber les particules dans l acide puis redémarrer la distillation en déduisant le temps écoulé. Si ces particules sont constatées la minéralisation terminée, reminéraliser le ou les tubes en question. - S il y a présence d éclaboussure ou de mousse, utiliser 3 à 4 gouttes d anti-mousse (R414) ou diminuer la prise d essai. - S il y a présence de cristallisation dans le tube, cela est du à une perte d acide due à un système d extraction trop performant ; réduire alors le débit de l extracteur (scrubber) jusqu à disparition des fumées blanches LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

7 - Lorsqu un échantillon a une structure grasse, il peut-être nécessaire d effectuer un dégraissage avant d extraire l azote afin de faciliter la phase de minéralisation de celuici DISTILLATION ET TI RATION T Pour l utilisation correcte du kjeltec, se référer à sa SOP et au manuel de l utilisateur. Vérifier les niveaux des réactifs et des waste avant de débuter l essai. Insérer le ou les racks de minéralisation dans le passeur (attention à la position A, B ou C). Encoder les données relatives aux échantillons dans la séquence d analyse en utilisant le programme " Kjeldalh 1 " : - 30 ml d acide borique - 60 ml d eau - 50 ml de soude - mode «délai» - temps : 2 sec - distillation : «volume» - vidange : «oui» Effectuer des rinçages manuels en utilisant le tube vide, et laisser agir la "vapeur active" 10 minutes environ afin que le système se mette à température. Remarque Si le système indique à l écran la mention " générateur de vapeur trop faible ", introduire maximum 0,5 g de sulfate de sodium (R025) dans le bidon de réserve d eau déminéralisée. Terminer chaque séquence par 3 rinçages automatiques. 11 Contrôle de qualité 11.1 Contrôle de 1 ère ligne L analyse est suivie par une carte de contrôle de type Shewhart. Tout écart de la carte doit être signalé au responsable technique ou à son remplaçant qui décidera des actions correctives à prendre Contrôle de 2 ème et 3 ème ligne Ces contrôles sont exécutés suivant les directives de la procédure LAB23 P020 Gestion des controle qualité 11.3 Contrôles supplémentaires Minéralisation Au minimum six fois par an en cas d écart par rapport à la carte de contrôle, il est nécessaire de vérifier la performance de minéralisation, pour cela, analyser 0,5g de tryptophane (préalablement séché à environ 103 C pendant une heure) dans les même conditions que l analyse décrite ci-dessus. Le résultat en azote doit correspondre à 13,51 % 0,30 %. En cas d écart observé, le signaler au responsable technique ou à son remplaçant qui décidera des actions correctives à prendre. LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

8 Distillation En cas de soupçon d anomalie concernant la partie distillation (sans la minéralisation) de l analyse, une vérification peut-être effectuée en dosant dans les conditions de l analyse, une quantité connue de sulfate d ammonium. Le rendement en azote doit-être compris entre 99 et 101 % 12 Calcul et rapportage H SO + 2NH (NH ) SO La teneur en azote ammoniacal se calcul comme suit (Calcul effectuer par l appareil) où N(%) ( V V 0 : volume d acide versé pour le blanc V 1 : volume d acide versé pour l échantillon 1 V0 )* T *0,014*100 m T : titre de l acide sulfurique (0,5 Mol/l) m : prise d essai de l échantillon Dans le cas d un échantillon préséché, tenir compte de la perte d humidité N(%) telquel N * m m sec hum où m sec : masse de l échantillon après séchage M hum : masse de l échantillon avant séchage La teneur en protéines brutes du produit est obtenue en multipliant la valeur obtenue lors de la détermination de la teneur en azote par le facteur conventionnel 6,25 pour les aliments pour animaux et (6,38 pour les produits laitiers). L incertitude de mesure sur l analyse est reprise dans la liste L : Liste des incertitudes de mesure section Chimie humide Aliment 13 Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents 13.1 Procédures LAB23 P018 : Création et suivi des cartes de contrôle qualité LAB23 P020 : Gestion des contrôles qualité LAB23 P011 Préparation des échantillons 13.2 Liste LAB L : Liste des incertitudes de mesure section Chimie humide - Aliment 13.3 Formulaires LAB23 F543-CH01 Feuille de travail chimie humide LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v /8

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