L hétérogénéité des populations microbiennes affecte l efficience des bioprocédés

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1 L hétérogénéité des populations microbiennes affecte l efficience des bioprocédés Mise en ligne de la cytométrie en flux pour l optimisation des bioprocédés Frank Delvigne Université de Liège, Gembloux Agro Bio Tech Passage des Déportés, Gembloux BELGIUM 1

2 1. Introduction Evolution des technologies de fermentation Fermentation naturelle par des micro-organismes (acétique, alcoolique ou lactique) Production de métabolites primaires (acides, alcools, ) Production de métabolites secondaires (antibiotiques, polysaccharides, arômes, ) Production d enzymes (amylases, cellulases, lipases, ) Production de protéines recombinantes (fragments d anticorps, insuline humaine, ) 2

3 Maîtriser la biologie 1m 1 cm 1mm 100µm 10µm 1µm 100nm 10nm 1nm dans des systèmes de culture industriels 1m 1 cm 1mm 100µm 10µm 1µm 100nm 10nm 1nm 3

4 Système physique : bioréacteur Système biologique : population microbienne 4

5 2. Système physique : Facteurs externes d hétérogénéité 5

6 Exemple : simulation de l homogenéisationd une pulsation de glucose dans un bioréacteur à trois étages d agitation Zone d alimentation Chemin de circulation suivi par les microorganismes Bakker[2000] 6

7 Problèmes associés au scale-up Gradient de substrat dans les procédés fed-batch Gradient en oxygène dissous dans les procédés aérobies Enforset al. [2001] Journal of biotechnology Schützeet al. [2006] 12th European Conference on Mixing 7

8 3. Système biologique : Facteurs internes d hétérogénéité Hétérogénéité au niveau : - Morphologie - Viabilité - Production de métabolites/protéines - Qualité des protéines 8

9 Biomarqueurs(externes) disponibles en microbiologie industrielle Hyka et al. [2013] 9

10 Hétérogénéité des systèmes recombinantes Système recombinant Signal pour l induction Phénotype «producteur» Signal transduction Protein coding sequence Concentration Prot Production globale P romoteur Phénotype «non producteur» Temps L hétérogénéité microbienne est dynamique au cours d un procédé : les cellules passent continuellement d un état producteur à un état non producteur 10

11 4. Exemples d utilisation de la cytométrieen flux en microbiologie industrielle Limitation en substrat Etat intracellulaire Signal transduction GFP coding sequence GFP synthesis P stress Export system ExtracellularGFP Etat extracellulaire 11

12 Combinaison avec le test d exclusion à base de l iodure de propidium 12

13 Phénomène moins connu : les fluctuations extracellulaires rencontrées dans les bioréacteurs industriels ont un effet bénéfique sur la viabilité cellulaire Résultats comparatifs obtenus par le test d exclusion de l iodure de propidium Enfors et al. [2001] J. Biotech, 85,

14 Les fluctuations environnementales affectent également le relargage de protéines Le phénomène est à mettre en relation avec la perméabilité de la membrane cellulaire et la viabilité Reacteur homogène Réacteur hétérogène Bäcklund et al. [2008] J. Biotech, 135,

15 Essais avec le système rapporteur GFP Test d exclusion à l IP Réacteur homogène SDR réacteur t R = 38s SDR réacteur t R = 79s 15

16 Mise en évidence de la GFP extracellulaire (western blot réalisé à partir des surnageants de culture Réacteur homogène Réacteur hétérogène 16

17 5. Mise en ligne de la cytométrieen flux au niveau des bioréacteurs 17

18 Première contrainte : dilution des échantillons (résolution acceptable si suspension cellulaire < particles/ml) Linear range Non-linear range 18

19 Gamme linéaire Gamme non linéaire 19

20 Deuxième contrainte : la prise d échantillon doit s effectuer à pression constante Pression constante Fluctuations de pression 20

21 Expérience : culture de E. coli pfis::gfpaav en chémostat Batch phase ChemostatD = 0.14 h -1 ChemostatD = 0.14 h -1 + glucose oscillations 21

22 P GFP gfpaav ATP -> ADP + Pi ssra Système protéase (ClpXP) Utilisation en «multiplex» : 22

23 T = 30 C T = 42 C 23

24 Comment «paramétriser» le degré d hétérogénéité de ma population au cours d une culture en bioréacteur? Phase de limitation en substrat Phase de fluctuation en substrat 24

25 25

26 6. Conclusion - La cytométrieen flux apporte des suivis pertinent en terme de procédé (viabilité, capacité de production, capacité à excréter) - Les biomarqueursdoivent être sélectionnés avec soins Perspective : Incorporation de la cytométrie en flux dans les boucles de régulation des procédés Nécessité : - De mettre au point des biomarqueursavec un temps de réponse correct - De développer les interface logicielle de manière à incorporer directement les résultats de cytométrie au niveau des systèmes de contrôle 26

27 Merci de votre attention 27

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