«Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d origine végétale» Professeur Michèle Boitel-Conti

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1 «Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d origine» Professeur Michèle Boitel-Conti Académie Nationale de Pharmacie 30 septembre 2015

2 «Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d origine» Professeur Michèle Boitel-Conti Membre fondateur Conseiller scientifique Académie Nationale de Pharmacie 30 septembre 2015

3 Système de production hétérologue Arômes Parfums Insecticides Principes actifs Protéines recombinantes (insuline, lipase gastrique humaine, ) Attraction des insectes pollinisateurs Répulsion pour des pathogènes Insecticides, fongicides Allélopathie Métabolites spécialisés (alkaloïdes, terpenes, ) Métabolites primaires (sucres, acides organiques, hormones ) Croissance Energie Respiration Morphogenese

4 Datura inoxia Principes actifs INDUSTRIES PHARMACEUTIQUES, DES COSMETIQUES Arômes INDUSTRIES AGRO-ALIMENTAIRES hyoscyamine, scopolamine, Catharanthus roseus vinblastine, vincristine, Extraction Aujourd hui - Molécules restreintes à quelques familles - Généralement à faibles concentrations - Plantes cultivées au champs - Importées ou cultures encadrées - > molécules d intérêt Papaver somniferum Marché non couvert Biotechnologies? codéine, morphine,

5 Problématiques Plantes supérieures Grande taille Organes pluricellulaires hétérogènes Activités métaboliques qui évoluent : - âge Culture en fiole d 1 clone - sollicitations environnement Lieux de biosynthèse et de stockage : - cellules - organes - molécules circulantes - faibles teneurs

6 Biotechnologies? Demain - Plantes à potentialités bio synthétiques amplifiées, Datura inoxia hyoscyamine, scopolamine, PGM - Culture en milieu confiné et contrôlé Catharanthus roseus vinblastine, vincristine, Papaver somniferum codéine, morphine, - Simplification de la «plante» - Dédifférenciation culture de cellules perte du métabolisme spécialisé - Transformation génétique culture d organe

7 Biotechnologies? - Transformation génétique culture d organe Datura inoxia hyoscyamine, scopolamine, Catharanthus roseus vinblastine, vincristine, Les chevelus racinaires ou «hairy roots» Papaver somniferum codéine, morphine, Métabolisme spécialisé?

8 Qu est-ce qu un chevelu racinaire? Il est issu d un évènement naturel Bactéries en symbiose avec les plantes au sein de la rhizosphère Rhizobium rhizogenes transfère certains de ses gènes (blessures mécaniques) Certaines cellules de racines naturelles sans avec

9 Rhizobium rhizogenes Certaines cellules de racines naturelles transfère certains de ses gènes (blessures mécaniques) Au laboratoire Culture in vitro de plantes Culture de R. rhizogenes Piqure avec aiguille infectée après 10 à 15 jours de co-culture Les gènes bactériens se sont insérés dans le génome des cellules de la plante Racine transgénique Les bactéries sont tuées par un antibiotique : le céfotaxime

10 - On coupe la racine transformée - On la place sur un milieu de culture solide stérile : sucres et sels minéraux - Chaque racine donnera un clone racinaire issu d une seule piqure 1 clone 6 clones Culture en fiole d 1 clone Culture en bioréacteurs de 3, 15 et 20 litres: milieu confiné et contrôlé - sans lumière - entre 20 et 25 - eau + sucre + sels minéraux et les molécules d intérêt?

11 Les alcaloïdes morphiniques? P. Somniferum produit les alcaloides benzylisoquinoline à partir de la L-tyrosine. Voie de biosynthèse codéine thébaine Morphine (2 cycles arômatiques suppl.) Anthony G. Millgate et al, 2004, Nature

12 Les alcaloïdes morphiniques? Alcaloides (contenus en % Poids sec) Hairy roots (HR) Racines naturelles Milieu de culture (HR) Total / / morphine / / / sanguinarine / / /- 0 codeine / /- 0 Le Flem-Bonhomme V. et al, 2004, Planta

13 resvératrol stilbènes/ Vitis vinifera: exploration analytique et développement de procédé stratégies Photos BIOPI 2015: Léo-Paul Tisserant Hairy roots de Vitis vinifera

14 stilbènes/ Vitis vinifera: exploration analytique et développement de procédé Pics connus?? Exploration analytique??????? 1 Elicitation de la voie de biosynthèse stratégies X 1500 Sécrétion de stilbènes totaux : 150 mg. l -1 de milieu de culture Vin (France) : 5,4 ± 1,2 mg l 1 Grain de raisin sec (Thomson seedless) : 486 mg kg -1 Renouée du Japon : 10 mg.kg -1

15 Chevelus racinaires : Alternative aux systèmes microbiens et CHO pour les protéines complexes? Systèmes défaillants: - diabète/insuline - croissance/ h-gh - Immunité/ IFNγ - Coagulation/ facteur VIII Extraction tissus humains Ivan Boublik, CRBM UMR 5237 CNRS stratégies Systèmes recombinants Systèmes cellulaires Insatisfaisant pour les protéines complexes Production de protéines recombinantes : 50 Milliards $ en Milliards $ en 2015 Organismes transgéniques CHO

16 Chevelus racinaires : Alternative aux systèmes microbiens et CHO pour les protéines complexes? Génération de racines porteuses du gène codant la protéine d intérêt Culture de racines en milieu confiné (bioréacteur) Protéine d intérêt thérapeutique (insuline, anticorps, vaccins, ) Végétaux comestibles Transformation génétique Sélection / mise en culture Extraction / purification R. rhizogenes Identification séquençage gène Pathologie caractérisée (déficience en une protéine) Médicaments (traitements hormonaux, antiviraux, vaccins, )

17 Etude de cas: GFP (I) RB Gène d intérêt nptii LB RB Rol A Rol B Rol C LB PromSP Term Prom Term Vecteur binaire Prom TermProm TermProm Term Plasmide pri Co-transfert des deux T-DNAs dans le génome de la cellule infectée (feuille, tige Génération de racines adventives type «hairy root» porteuses du gène d intérêt stratégies Type sauvage GFP Type sauvage GFP Brassica rapa rapa (navet) lumière blanche lumière bleue GFP

18 Marqueur Protéines totales sécrétées Brassica rapa rapa 37 kda 25 kda GFP Plate forme RhizoProt Gel acrylamide coloré au coomassie Directement à partir du milieu de culture et sans aucune étape de purification La GFP représente plus de 70% des protéines totales sécrétées (120 mg/l) 18

19 Système historique tabac Plateforme RhizoProt (Brassicaceae) Sécrétion GFP 0.8 mg/l* 100 mg/l Durée de vie de la culture Stabilité des protéines sécrétées < 40 jours Présence de protéases** > 3 mois =>production en continu stable Toxicité Alcaloïdes (nicotine ) Végétaux alimentaires *Medina-Bolivar et al.; 2004 ** Pham et al.; 2011 RhizoProt : Plateforme de production de biomolécules - innovante - performante - sans pathogène, - à faible coût, - confiné et contrôlé Brevet UPJV

20 Valorisation industrielle: Développement d un procédé de production/sécrétion de protéines recombinantes à partir de chevelu racinaire (brevet WO A1) Start-up de biotechnologie créée en 2011 Exploitant exclusif du brevet et de la plateforme RhizoProt Développement de candidats médicaments Industrialisation du procédé 3 protéines propriétaires (enzymes humaines) en développement pour le traitement de patients atteints de 20

21 stratégies L équipe et moi-même vous remercions de votre attention

22 stratégies

23 La démarche, les outils, les compétences molécules découvertes Chimie analytique Génie métabolique 10 molécules d intérêt à l étude Application en industrie Génie génétique ESSAIS CLINIQUES 10 ans Systèmes modèles Recherche fondamentale transfert Développement industriel Génie des bio-procédés 1 seule produite H 3 C N H CH 2 OH O C 1 3 C 2 O

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