Il existe trois isoformes de CPT1 (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des niveaux différents selon les tissus.
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- Romain Hébert
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1 PARTIE BIOCHIMIE INTRODUCTION Chez les mammifères, la dégradation oxydative des acides gras à chaîne longue joue un rôle majeur dans le métabolisme énergétique. Le principal d entre eux est l acide palmitique : CH3-(CH2)14-COOH. Cette dégradation oxydative ayant lieu dans la mitochondrie, un système de transfert est nécessaire pour faire passer la forme activée (liée au coenzyme A et donc appelée acyl-coa) des acides gras à chaîne longue du cytosol vers la mitochondrie. Ce système de transfert implique le couplage de l acide gras à une molécule appelée carnitine et comprend deux enzymes membranaires appelées carnitine-palmityl transférases ou CPT : l activité CPT1 est située sur la face cytosolique de la membrane externe de la mitochondrie et l activité CPT2 sur la face interne de la membrane interne de la mitochondrie selon le schéma suivant : Il existe trois isoformes de CPT1 (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des niveaux différents selon les tissus. STRUCTURES L analyse de la séquence de la protéine CPT1A (un peu plus de 770 résidus) par le programme TopPred (Topology prediction of membrane proteins) permet de déterminer le diagramme d hydrophobicité présenté dans la figure B1A.
2 Figure B1A : En abscisse est indiquée la position des acides aminés et en ordonnée est indiqué le degré d hydrophobicité. Question 32 : Indiquez le nombre de segments transmembranaires que peut comporter la protéine membranaire CPT1A, prédit par le diagramme d hydrophobicité : a. Un FAUX : voir b b. Deux VRAI : Dans la question, la notion «que peut comporter» est importante car si on est rigoureux, avec ce type d expérience on ne peut que formuler une hypothèse sur la nature des segments que l on étudie. En effet ici on cherche le nombre de segments transmembranaires, or qui dit transmembranaire dit hydrophobe car la bicouche lipidique est elle même fortement hydrophobe. De plus ces segments doivent être assez longs pour pouvoir traverser la membrane, généralement on dit qu à partir de 20 résidus le segment est assez long pour cela. Sachant cela, on remarque que deux segments sur le diagramme d hydrophobicité correspondent à ces critères (entre les résidus 0 et 100 à peu près). Encore une fois ici ce sont des sortes de «segments candidats» pour être transmembranaire, car ils ont les caractéristiques pour, mais en l absence d autres expériences on ne peut pas totalement en être sûr. c. Sept FAUX : voir b d. Onze FAUX : voir b e. Douze FAUX : voir b
3 NB (Q32) : Sur ce genre de question il faut surtout faire attention à où est le 0 en ordonnée pour le degré d hydrophobicité car avec le stress et la rapidité à avoir on a vite fait de compter des segments en trop. La structure tridimensionnelle de la partie cytoplasmique de la protéine CPT1A a été résolue par diffraction des rayons X. Si la détermination de son appartenance à une classe est difficile à établir, il est par contre possible d observer certaines caractéristiques structurales présentées dans la figure B1B. Figure B1B Question 33 : Identifiez la ou les caractéristique(s) correspondant aux structures proposées : a. La protéine comporte un seul domaine FAUX : voir b b. La protéine comporte deux domaines VRAI : Le Domaine est l unité fondamentale de la structure tertiaire. Or sur la structure tertiaire de la CPT1A on voit deux grands ensembles se profiler, ce sont des domaines. Sachant que chacun des domaines correspond à un ensemble de structures secondaires (hélice α, feuillet β) et superstructures secondaires (par exemple motif α-α, hélice-bouclehélice ou encore β en épingle à cheveux..). c. La protéine comporte trois domaines FAUX : voir b d. Le coude est un coude bêta classique FAUX : un coude bêta classique est constitué de 4AA avec une liaison hydrogène entre les résidus i et i+3, or ici la liaison hydrogène se fait entre les résidus i (ARG) et i+4 (ASP) e. Le coude est un coude de structure atypique VRAI : C est une question de «par cœur»pure, bête et méchante. Ca vous montre surtout que le professeur Hainque adore les coudes et que même si il n insiste pas toujours dessus en cour il faut absolument connaître les exemples donnés. Petit rappel : il existe globalement deux grands types de coudes : - coude γ (ou «γ-turn») : d une longueur de 3 résidus, avec une liaison hydrogène entre le C=O du résidu i et le groupe N-H du résidu i+2 - coude β (ou «β-turn») : long de 4AA quelque soit le type de coude β. --> puis on distingue plusieurs types de coudes β classés selon les angles Ψ et Φ et des résidus i+1 et i+2.
4 Exemple : - Type I et II : i+1 est souvent une proline et i+3 est souvent une glycine (peu d encombrement stérique) pour pouvoir tourner court - Type VI : i+2 est souvent une Proline en configuration «cis» et i+1 est souvent une glycine. (on dit que la séquence «Gly-cis-Pro» est représentative d un coude β de ce type) Donc dans cette exo, il suffit de voir que le coude présente 5 résidus pour pouvoir tout de suite l exclure de la classification vue en cour. Les prédictions de structures secondaires pour la protéine CPT1A indiquent l existence d une hélice alpha entre les acides aminés 103 et 122. La projection des chaînes latérales des résidus d acides aminés selon l axe de l hélice présentée dans la figure B2 répond aux caractéristiques de celle-ci et permet d en reconstituer la structure primaire. Pour ne pas surcharger la représentation du modèle de la roue hélicoïdale, les acides aminés 121 et 122 ne figurent pas sur le schéma. Le code des acides aminés est fourni dans le tableau ci-dessous. Remarque : Ce n est pas nécessaire de voir cela pour la question suivante, mais si on fait attention au texte : «Les prédictions de structures secondaires pour la protéine CPT1A indiquent l existence d une hélice alpha entre les acides aminés 103 et 122», et que l on relie ça avec le diagramme d hydrophobicité de la première question, on remarque qu entre les résidus 103 et 122 (à peu près) on avait le deuxième «segment candidat» hydrophobe. Ceci va dans le sens d un segment transmembranaire puisque seule les hélice α (à de rares exceptions près) peuvent être transmembranaires. Trouver un feuillet β aurait été assez bizarre alors que là on est conforter dans l idée d avoir un segment transmembranaire à cet endroit là.
5 Question 34 : Déterminez la séquence de la région en hélice alpha : a. N L G L G V W V I T V V L V G S A F T M b. N F A S G V L V V T I V W V G L G L T M c. N W L L V V G I G L T S G V A V V F T M d. N V I L A V W L G T G T L V G S V V T M e. N V V S G V L F G T G L W V A L I V T M Réponse vrai : E : Pour ce genre de question assez classique il y a deux chose à savoir : - Si on réfléchie et qu on a le temps : grâce au cour on sait qu une hélice α droite classique comporte environ 3,6 résidus par tour de spire. Comme la représentation ici est une projection de la position de 18 résidus consécutifs, chaque résidu en partant du premier de l hélice peut être représenté tous les 100 (360 /3,6). Ainsi on part du résidu 103 et on tourne tout les 100 sur le résidu consécutif de la structure primaire!
6 - Une fois qu on sait ça et qu on veut aller vite, sur ce type de représentation il suffit de partir du premier acide aminé de l hélice (le 103) que l on appellera i, et de retrouver la séquence primaire en laissant entre chaque résidu consécutifs 4 autres résidus, c est à dire : i, i+5, i+10, i+15 etc.. soit ici N V V S etc.. Donc réponse E! Question 35 : Indiquez la caractéristique de la région en hélice alpha : a. Transmembranaire et hydrophile FAUX : il n y a pas assez de résidu hydrophile pour que l on puisse affirmer cela b. Transmembranaire et hydrophobe VRAI : sur 18 AA, 12 présentent une hydrophobicité importante (les L, V, W, I, A et F), l hélice et donc majoritairement hydrophobe c. Transmembranaire et amphiphile FAUX : une espèce chimique est dite amphiphile (ou amphipatique) si elle possède à la fois un groupe hydrophile et un groupe hydrophobe, or ici on a un gros bloc hydrophobe et à côté seulement 2 résidus hydrophiles (T et S) qui ne suffisent pas réellement à former un «groupe» hydrophile. d. Exposée au milieu aqueux (cytoplasmique ou intermembranaire mitochondriale) et amphiphile FAUX : pour deux raisons qui se complètent : l hélice alpha n est pas amphiphile mais hydrophobe, et étant hydrophobe elle ne peut pas être exposé «naturellement» (c est à dire en absence de tout problème au niveau de la protéine comme par exemple une mauvaise conformation pathologique) à un milieu aqueux e. Hétéropolaire (hydrophile sur 1,5 tour et hydrophobe sur 4,0 tours) FAUX : une partie de la proposition peut paraître cohérente car ce type de conformation permet bien à peu près de visualiser 5,5 tours (en effet 18résidus/3,6résidus par tour = 5) mais l hélice n est pas hétéropolaire mais hydrophobe. Deux oligopeptides de 15 acides aminés appartenant à la séquence de la protéine CPT1A (partie C terminale) ont été choisis en vue de produire des anticorps polyclonaux de lapins afin de pouvoir réaliser des western blots. On rappelle qu il existe trois isoformes (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des niveaux différents selon les tissus. La séquence d une partie de la région C terminale de l isoforme CPT1A (référence P50416) est alignée avec la séquence homologue de l isoforme CPT1B (référence Q92523) et celle de l isoforme CPT1C (référence Q8TCG5).
7 L oligopeptide 1 est à l origine de la production de l anticorps 1 et l oligopeptide 2 est à l origine de la production de l anticorps 2. A partir de broyats de tissus, on prépare des extraits totaux et des fractions purifiées mitochondriales. Pour chaque tissu (foie, muscle, cerveau), ces deux types d échantillons sont dénaturés par la chaleur en présence de SDS et de bêta-mercaptoéthanol et soumis à une électrophorèse de type SDS-PAGE (une même quantité de protéine est déposée dans chaque puits). On procède ensuite à un électrotransfert sur une membrane qui est finalement soumise à une immunodétection avec les anticorps 1 ou 2 (à une même concentration en immunoglobulines), marqués à l aide d un isotope radioactif. La révélation est faite par autoradiographie et les résultats sont portés en figure B3. Figure B3. Foie : pistes 1 et 2 ; Muscle : pistes 3 et 4 ; Cerveau : pistes 5 et 6. Question 36 : Interprétation qualitative du western blot. Analysez les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) : a. L anticorps 1 et l anticorps 2 sont spécifiques de CPT1A FAUX : on remarque sur la figure B3 que l anticorps 1 (marqué radioactivement) ne peut pas être spécifique de l isoforme CPT1A puisque l expression des trois isoforme de CPT1 est sensée être tissu dépendent, c est à dire que même si à première vu on ne sait pas si CPT1A est plutôt exprimé dans le foie, les muscles ou dans le Cerveau, on peut penser que globalement elle sera majoritaire dans un de ces tissu et moins dans les autres. Or l autoradiographie révèle globalement avec l anticorps 1 un tâche sur le gel pour chacun des tissus, et donc à priori que toutes les isoformes sont détectées par cet anticorps d où sa non spécificité. De plus on peut conforter cette conclusion en regardant le tableau de séquence des Cter des 3 isoformes où on voit bien que la séquence de l oligopeptide 1 (qui a servit a faire l anticorps 1) est présente dans l isoforme CPT1A, et que les isoforme CPT1B et CPT1C possèdent des séquences très proches de l oligopeptide 1 (à quelques résidus près) qui seront donc aussi surement reconnaissables par l anticorps 1. Cet anticorps reconnaît donc les 3 isoformes et n est donc pas spécifique de CPT1A. En ce qui concerne l anticorps 2, en regardant le Western Blot on remarque que cet anticorps semble être spécifique d une seule des isoformes de CPT1, en l occurrence l isoforme qui s exprime principalement dans le Foie. Puis grâce au tableau de séquence on remarque que l oligopeptide qui a servit à fabriquer l anticorps 2 a sa séquence présente uniquement dans l isoforme CPT1A. On peut donc conclure deux chose, d une part qu il semblerait que l isoforme présente dans le foie soit la CPT1A (mais bon on s en fou un peu pour le moment, mais c est important de comprendre ça pour les questions suivantes), d autre part on voit que l isoforme pour laquelle l anticorps est spécifique est la CPT1A!
8 b. L anticorps 1 est spécifique de CPT1A et l anticorps 2 n est pas spécifique de CPT1A FAUX : voir a c. L anticorps 1 n est pas spécifique de CPT1A et l anticorps 2 est spécifique de CPT1A VRAI : voir a d. Vis-à-vis des 3 isoformes, la différence de spécificité des anticorps 1 et 2, n est pas surprenante VRAI : Pour répondre à cette question on s appui surtout sur le tableau de séquence. On remarque alors qu en effet la différence de spécificité entre les anticorps 1 et 2 n est pas surprenante car l anticorps 1 va pouvoir reconnaître dans les trois forme la séquence soit exacte soit proche de l oligopeptide 1 dont il est issu, alors que l anticorps 2 ne pourra reconnaître que l isoforme CPT1A car c est la seul qui possède dans sa séquence la séquence de l oligopeptide 2 dont est issue l anticorps 2 e. Vis-à-vis des 3 isoformes, les résultats obtenus à l aide de l anticorps 1 en termes de spécificité, ne sont pas surprenants VRAI : là on essayait éventuellement de vous piéger sur le fait que les isoformes CPT1B et CPT1C n avaient pas exactement au résidu près la séquence de l oligopeptide 1 qui a permit de fabriquer l anticorps 1. Or ce n est pas par ce que la séquence n est pas exactement la même que l anticorps ne la reconnaîtra pas, il la reconnaîtra peut être un peu moins bien (même si ça ne semble pas être le cas ici) mais il la reconnaîtra quand même. D autant plus que les anticorps fabriqués ici sont des anticorps polyclonaux qui ne sont pas aussi spécifiques que des monoclonaux car pouvant reconnaître plusieurs épitopes d un même antigène donc il n est pas surprenant de voir que notre anticorps 1 reconnaisse des séquences qui ne sont pas strictement identiques. Question 37: Interprétation quantitative du western blot. Analysez les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) : a. La masse moléculaire estimée de CPT1A est proche de 68 kda FAUX : voir b b. La masse moléculaire estimée de CPT1A est proche de 88 kda VRAI : on sait grâce à la question précédente que l anticorps 2 est spécifique de CPT1A, on regarde à peu près où se situe la tâche sur le gel laissé par la révélation de l anticorps 2 et on lit un poids un peu en dessous de 97kDa donc entre les 68kDa et 88kDa proposés on choisit 88kDa. NB : on se rend compte dans la suite de l exo qu il s agit plutôt ici de la masse moléculaire d une sous unité de CPT1A, mais cette question était plus une question de lecture de blot qu autre chose. c. Pour l anticorps 2, la piste 1 correspond à la fraction purifiée mitochondriale et la piste 2 à l extrait total FAUX : voir d d. Pour l anticorps 2, la piste 2 correspond à la fraction purifiée mitochondriale et la piste 1 à l extrait total
9 VRAI : on sait que «une même quantité de protéine est déposée dans chaque puits» et que l immunodétetion sur ce western blot s est fait «à une même concentration en immunoglobulines». De plus on voit que sur la piste 2 la tâche est significativement plus grosse que sur la piste 1, cela signifie que l anticorps 2 s est lié à plus de CPT1A. On en conclue que la piste 2 correspond à la fraction purifiée mitochondriale puisque si plus de CPT1A est présente alors que l on a mit dans chaque puits une même quantité de protéine totale, c est que la CPT1A a une concentration plus grande dans l échantillon mis sur le deuxième puits, or cette plus grande concentration s explique par une étape de purification qui permet d isolé la protéine qui nous intéresse. e. L anticorps 1 a plus d affinité pour CPT1A que l anticorps 2 FAUX : si on suppose que pour les deux Blot les étape préalable de prélèvement et de purification se sont fait de manière strictement identique, cela signifie qu il y aura autant de protéines CPT1A dans les piste 1 respectives et 2 respectives de chaque Blot. Ainsi la seul chose pouvant expliquer une différence de grosseur de tâche entre les deux pistes 1 ou les deux pistes 2 c est une différence d affinité de l anticorps pour la CPT1A. Or en comparant respectivement les piste, on voit que globalement les tâches révélées par l anticorps 2 sont plus grosses que celles laissées par l anticorps 1, d où le fait que ce soit l anticorps 2 qui ai plus d affinité que le 1 pour CPT1A Pour mieux comprendre la structure 3D de la protéine CPT1A, des mitochondries isolées sont, dans un premier type d expérience, traitées par du DSS (disuccinimidyl suberate), un agent de pontage hydrophobe. Ce genre de réactif chimique est capable de créer des liaisons covalentes entre les sous-unités d un complexe (dans l expérience on voit qu il est utilisé à différentes concentrations). Après action, les réactifs sont éliminés et les mitochondries sont récupérées par centrifugation. Celles-ci sont alors remises en suspension puis on procède à une extraction des protéines pour finir par leur analyse par western blot (figure B4). La masse moléculaire du complexe déterminée par SDS-PAGE et correspondant à CPT1A est d environ 270 kda. Dans un deuxième type d expérience, les mitochondries isolées sont traitées par un tampon contenant une faible concentration d un détergent non ionique (triton X-100, digitonine), de façon à extraire et solubiliser sans les dénaturer les protéines de la membrane externe mitochondriale. Après centrifugation, les surnageants sont soumis à une chromatographie par filtration sur gel (superose 6) et sur chaque fraction recueillie (éluats de 200 microlitres), il est procédé à un western blot afin de mettre en évidence de façon semi-quantitative la protéine CPT1A (exprimée en unités arbitraires, a.u., figure B5). Le chromatogramme représente pour chaque point : en abscisse le volume d élution et en ordonnée la quantité de CPT1A éluée. La masse moléculaire du complexe déterminée par filtration sur gel et correspondant à CPT1A est d environ 270 kda.
10 Figure B4 Figure B5 Question 38 : Interprétation des expériences de pontage et de filtration sur gel. Analysez les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) : a. La concordance des masses moléculaires observée en SDS-PAGE et en filtration sur gel est une coïncidence FAUX : voir b b. La concordance des masses moléculaires observée en SDS-PAGE et en filtration sur gel reflète l organisation en sous-unités VRAI : ici on essaye de vous piéger sur le fait que la première expérience de SDS PAGE se fait en condition dénaturante alors que la deuxième non et que vu de loin on ne s attend pas forcément à avoir le même résultat. Mais il faut voir qu on utilise dans la première expérience du DDS qui est «capable de créer des liaisons covalentes entre les sous-unités d un complexe» (on rappel que mis à part les ponts disulfure, les différentes sous unités sont associées les unes aux autres par des liaisons faibles sensible au SDS), et donc que dans les deux expériences on voit au final la protéine CPT1A sous sa forme oligomérique. De plus le témoin de la première expérience sans DDS montre une seule
11 tâche de plus petit poids moléculaire qui correspond au poids d une sous unité de la protéine. Ces deux expériences démontrent donc bien l organisation en sous unités. c. Les résultats expérimentaux sont incompatibles avec une organisation oligomérique de la protéine CPT1A FAUX : au contraire le gradient croissant de DDS dans la première expérience montre une organisation oligomérique puisqu il permet de re-associer les différentes sous unités de CPT1A entre elles malgré des conditions dénaturante dans un premier temps. d. Les résultats expérimentaux sont compatibles avec une organisation homodimérique de la protéine CPT1A FAUX : voir e e. Les résultats expérimentaux sont compatibles avec une organisation homotrimérique de la protéine CPT1A VRAI : on sait que la protéine native a un poids moléculaire de 270 kda. Ensuite, soit sur la figure B4, soit sur la figure B3 (où en effet on était aussi en condition dénaturante avec SDS et bêta-mercaptoéthanol histoire d être sûr que même d éventuels pont disulfures ne viennent pas fausser les résultats) que chacune des sous unité de CPT1A a en gros un poids moléculaire de 90kDa, or 90 x 3 = 270 kda d où une organisation homotrimérique! Après hydrolyse trypsique de la protéine CPT1A, on isole par chromatographie sur phase inversée 2 tétrapeptides parmi les différents peptides produits. On analyse ces peptides par spectrométrie de masse. Les spectres obtenus après électronébulisation (ESI, pas de fragmentation) fournissent un ion moléculaire (M+H)+ de rapport m/z déterminé pour chaque peptide. La fragmentation (ESI-MS-MS) de chaque ion fournit les fragments de type «y» de rapport m/z suivants : Il convient de noter que le prétraitement de la protéine CPT1A par une phosphatase suivi de l hydrolyse trypsique ne permet d isoler qu un seul tétrapeptide (tétrapeptide 1). Rappel : La fragmentation des chaînes peptidiques se fait principalement au niveau des liaisons peptidiques selon le schéma suivant :
12 La charge positive retenue côté COOH fournit les fragments de type «y». L acide aminé C terminal verra sa masse augmenter de 19 (à cause du OH du groupement carboxylique et de la fonction amine). En vous aidant du tableau ci-dessous, déterminez la séquence de chaque tétrapeptide : Question 39 : Déterminez la séquence des peptides trypsiques (PTyr correspond à de la phospho tyrosine) : a. Tétrapeptide 1 : Arg - Asp - Tyr - Cys Tétrapeptide 2 : Arg - Asp - PTyr Cys b. Tétrapeptide 1 : Cys - Tyr - Asp - Arg Tétrapeptide 2 : Cys - PTyr - Asp Arg VRAI c. Tétrapeptide 1 : Arg - Asp - PTyr - Cys Tétrapeptide 2 : Arg - Asp - Tyr Cys d. Tétrapeptide 1 : Cys - PTyr - Asp - Arg Tétrapeptide 2 : Cys - Tyr - Asp Arg e. Tétrapeptide 1 : aucune séquence proposée Tétrapeptide 2 : aucune séquence proposée Raisonnement : Tout d abord on élimine facilement les proposition a et c en déterminant le dernier acide aminé des deux tétrapeptides. En effet on prend le dernier fragment d un PM de 175,1190 auquel on retire 19, ce qui donne à peu près 156, ce qui correspond dans le tableau à l Arginine. Puis on «remonte» :. 290, ,1190 = > Asp. pour le tétrapeptide 1 : 453, ,1458 = > Tyr 556, ,2092 = > Cys. pour le tétrapeptide 2 : 533, ,1458 = >? 636, ,1756 = > Cys On a donc tetrapeptide 1 = Cys Tyr Asp - Arg et Tetrapeptide 2 = Cys -? Asp Arg Ensuite il faut voir que lorsque l on fait subir une déphosphorylation de la protéine CPT1A à l aide d une phosphatase, on n obtient ensuite que le tétrapeptide 1. Or le fragment obtenu avec le tétrapeptide 2 de PM 243 semble indiquer une augmentation de PM d à peu près 80 témoignant ainsi d un résidu ayant subit une modification post-traductionnelle (c est pour cela que l on ne retrouve nulle part 243 dans le tableau). Vu l expérience avec la phosphatase, on en déduit que cette modification post-traductionnelle est certainement une phosphorylation. Or il faut savoir qu une phosphorylation est l ajout d un groupement H2PO3 à la place d un H, ce qui ajoute un PM approximatif de 3x16 (pour l oxygène) + 30 (pour le phosphate) + 2 = 80. (Vous devez connaître approximativement le poids des modifications post-traductionnelles données en cours histoire de ne pas avoir à refaire le calcul à chaque fois. Pour finir il faut remarquer que = > Tyr, c est donc bien sur une tyrosine qu a eu lieu la phosphorylation! Donc le tétrapeptide 2 est bien : Cys PTyr Asp Arg!
13 ENZYMOLOGIE On s intéressera ici principalement à la CPT1, qui catalyse la réaction : palmityl-coa + carnitine palmityl-carnitine + CoA La CPT1 a été purifiée à partir de mitochondries de foie de rat, afin de comparer son activité sur des acyl-coa de différentes longueurs, pour une concentration constante et saturante de carnitine (2 mm). Les résultats sont les suivants : Question 40 : Pour une enzyme dont la cinétique est michaelienne, et qui satisfait aux conditions du quasi-équilibre, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? A. La Km est approximativement égale à la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat (ES), c est-à-dire de l équilibre E + S ES VRAI : En conditions de quasi-équilibre, k 2 << k 1, donc K m k -1 /k 1 soit K m K d B. La Km est approximativement égale à l inverse de la constante d affinité du substrat pour l enzyme (Kaff) VRAI : Nous sommes dans l hypothèse du quasi-équilibre, et K d = 1/K aff, donc K m 1/K aff C. La Vmax est proportionnelle à la Km FAUX :Vmax est proportionnelle à k 2 et non à K m, Vmax= k 2.[E]t D. La Km est la concentration de substrat pour laquelle la vitesse initiale est égale à V max /2 VRAI :Du pur cours E. La Km est proportionnelle à la concentration totale de l enzyme ([E]t) FAUX : Vmax est proportionnelle à la concentration totale de l enzyme [E]t Question 41 : On admet que la cinétique de la CPT1 correspond aux conditions de quasi-équilibre. Au vu des résultats présentés dans le tableau ci-dessus, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? A. Le substrat qui a la plus grande affinité pour la CPT1 est le composé de longueur C 2 FAUX : ce composé a la plus faible affinité pour CPT1 (son K m étant le plus grand, il a l affinité la plus faible (K m = 1/K aff )) B. Le substrat pour lequel la V max est la plus élevée est le composé de longueur C 16 VRAI : 100% de Vmax pourquoi chercher compliqué C. Les différences de K m et de V max prouvent que l enzyme purifiée est en réalité le mélange de différentes iso-enzymes FAUX : ici, ce sont bien les substrats qui changent (longueur des chaines) et non l enzyme, rien ne permet de conclure cela
14 D. Les données présentées ne permettent pas de calculer le rapport k cat /K m VRAI : on ne dispose pas de la concentration totale d enzyme, on ne peut pas calculer k cat.[e] t =V max, et donc k cat /K m non plus E. Les données présentées ne sont pas interprétables car, dans les conditions du quasiéquilibre, on ne peut pas déterminer la V max FAUX : la Vmax dépend de la concentration totale d enzymes, elle dépend des conditions expérimentales et peut donc être déterminée, même en condition de quasiéquilibre La CPT1 a été purifiée à partir de mitochondries de rat, préparées soit à partir de muscle (CPT1B), soit à partir de foie (CPT1A). Dans les deux cas, on a utilisé soit des animaux nourris, soit des animaux laissés à jeun pendant 24 heures. Sur les CPT1B et CPT1A purifiées à partir d animaux nourris ou à jeun, on a étudié l effet du malonyl-coa, qui est un composé intermédiaire de la synthèse des acides gras. Les résultats sont présentés dans la figure B6. Figure B6 : Effet du malonyl-coa sur l activité CPT1, mesurée avec comme substrats le palmityl-coa et la carnitine. Question 42 : Au vu des résultats présentés dans la figure B6, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. Ces résultats démontrent que le malonyl-coa est un inhibiteur compétitif vis-à-vis du palmityl-coa FAUX : ces résultats démontrent qu il est inhibiteur, mais pas nécessairement compétitif b. Seule la forme hépatique de la CPT1 (CPT1A) est significativement inhibée par le malonyl-coa VRAI: que les rats soient à jeun ou nourris, l inhibition de CPT1B est quasiment négligeable, surtout à côté de l effet du malonyl-coa sur CPT1A
15 c. Le jeûne induit la protéolyse de la CPT1A FAUX : Rien ne permet de le dire (ne faites JAMAIS de conclusion hâtive en bioch!) d. Le malonyl-coa est un substrat de la CPT1A, mais pas de la CPT1B FAUX : Cette expérience ne permet pas de le dire. e. Le jeûne entraîne une augmentation de la sensibilité de la forme hépatique (CPT1A) à l effet inhibiteur du malonyl-coa FAUX: On voit bien que l état nourri renforce l inhibition du malonyl-coa sur CPT1A et non l inverse. Sachant que le jeûne induit la libération de glucagon, une hormone qui agit par l intermédiaire de protéines-kinases, certains chercheurs ont supposé que l effet du jeûne sur la forme hépatique de la CPT1 (CPT1A) était dû à une phosphorylation de la protéine. Ils ont purifié la CPT1A à partir de foies de rats laissés à jeun, et ont étudié l effet du traitement de l enzyme purifiée par un mélange de protéines-phosphatases. L activité de l enzyme non traitée, était de 115 nmol.min-1.mg-1 de protéines, contre 65 nmol.min-1.mg-1 de protéines pour l enzyme traitée. Ils ont aussi comparé l effet inhibiteur du malonyl-coa sur l enzyme traitée ou non par les protéines-phosphatases. Les résultats sont présentés dans la figure B7. Figure B7 : Effet du malonyl-coa sur la CPT1A purifiée à partir du foie de rats à jeun, non traitée (- PPases) ou traitée (+ PPases) par des protéines-phosphatases. Les substrats utilisés sont le palmityl-coa et la carnitine. Question 43 : Compte-tenu des données de l énoncé, et des résultats présentés dans la figure B7, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)?
16 a. La déphosphorylation de la CPT1A entraîne une augmentation de son activité enzymatique FAUX : On passe de 115 à 65 après déphosphorylation, l activité diminue et n augmente donc pas b. La déphosphorylation de la CPT1A entraîne une augmentation de la sensibilité de l enzyme à l effet inhibiteur du malonyl-coa VRAI : après déphosphorylation, on obtient la courbe de la figure B6 pour les rats à l état nourri, la sensibilité de CPT1A à l effet inhibiteur du malonyl-coa a augmenté c. Les données expérimentales sont incompatibles avec une régulation de la CPT1A par modification covalente de l enzyme FAUX : la déphosphorylation et la phosphorylation sont des liaisons covalentes, et il y a bien régulation de l activité de l enzyme en fonction de son état de phosphorylation d. La déphosphorylation de la CPT1A fait disparaître le site de fixation du malonyl-coa FAUX : la déphosphorylation rend la CPT1A sensible à l effet inhibiteur du malonyl- CoA.. e. La protéolyse partielle de la CPT1A par les protéines-phosphatases entraîne une baisse de l activité enzymatique FAUX : ce n est pas la déphosphorylation elle-même qui entraine la baisse de l activité Question 44 : Concernant la régulation d une activité enzymatique par modification covalente de la protéine (phosphorylation/déphosphorylation), quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. La déphosphorylation entraîne toujours une diminution de l activité catalytique FAUX : Non non non! Ne tombez pas dans ce piège, la déphosphorylation peut aussi augmenter l activité catalytique. b. La phosphorylation entraîne toujours une augmentation de l affinité de l enzyme pour le substrat FAUX : Comme pour la proposition a, ce n est pas toujours le cas (questions simples pour le c*******, faites gaffe) c. Le pourcentage d enzyme sous la forme phosphorylée dépend uniquement de la concentration intracellulaire de l ion phosphate FAUX : le «uniquement» rend la proposition fausse d. La phosphorylation est nécessairement catalysée par des protéines-kinases et la déphosphorylation est nécessairement catalysée par des protéines phosphatases VRAI : A chaque action, son enzyme. e. La régulation par modification covalente ne concerne jamais des enzymes allostériques FAUX : elle peut concerner ce type d enzyme Afin de déterminer la localisation du site actif et du site de liaison du malonyl-coa, la CPT1A, purifiée à partir de foies de rats nourris, a été soumise à des protéolyses ménagées. Ces expériences et des expériences complémentaires de mutagénèse dirigée in vitro, ont montré que le site de fixation du malonyl-coa était situé sur l extrémité N-terminale de
17 l enzyme, et que le site actif était situé sur l extrémité C-terminale. Pour préciser le mode d action du malonyl-coa, des chercheurs ont fait exprimer différentes protéines recombinantes dans la levure S. cerevisiae (qui possède des mitochondries, mais n a pas d activité CPT) : la CPT1A en totalité, la CPT2 (voir schéma de l Introduction) en totalité, et un hybride CPT1A/CPT2, formé de la fusion de l extrémité N-terminale de CPT1A avec la totalité de CPT2. Les sites actifs de la CPT1A et de la CPT2 sont strictement identiques. Les propriétés de chacune de ces enzymes ont été étudiées. Les constructions et les résultats sont présentés ci-dessous : Question 45 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) compatible(s) avec les données de l énoncé et avec les résultats présentés ci-dessus? a. La CPT2 est insensible à l effet inhibiteur du malonyl-coa VRAI : le % d inhibition est de 0 pour la CPT2 b. La présence du site actif de l enzyme suffit pour que le malonyl-coa puisse exercer son effet inhibiteur FAUX : La protéine recombinante est insensible à l effet inhibiteur du malonyl-coa et possède pourtant le site actif de l enzyme CPT2 c. L effet inhibiteur du malonyl-coa nécessite la présence simultanée de l extrémité N-terminale et de la partie C-terminale de la CPT1A VRAI : la protéine recombinante possède le site de fixation du malonyl-coa sur CPT1A mais que le site actif de CPT2, et il n y a pas d inhibition. Il faut donc la partie C-TER de CPT1A pour avoir une inhibition d. L extrémité N-terminale de la CPT1A régule négativement l activité de la CPT2 FAUX : l activité reste sensiblement la même quand on compare la CPT2 et la protéine
18 recombinante CPT1A/CPT2 e. L extrémité N-terminale de la CPT1A régule négativement l affinité du site actif de la CPT2 pour le palmityl-coa FAUX : la baisse est très faible, et en plus, c est la Km qui baisse, donc l affinité augmente ;) Des travaux ont montré que le jeûne provoque une augmentation de la fluidité de la membrane externe de la mitochondrie, et qu il existe une relation inverse entre cette fluidité et le degré d inhibition de la CPT1A par le malonyl-coa. L insertion de la CPT1A dans la membrane externe de la mitochondrie est telle que l extrémité N-terminale et l extrémité Cterminale se trouvent toutes deux dans le cytosol. Pour préciser la relation entre la fluidité de la membrane externe mitochondriale et l inhibition de la CPT1A par le malonyl-coa, des chercheurs ont utilisé : d une part, l alcool benzylique, qui augmente la fluidité membranaire ; d autre part, un réactif qui a la propriété de stabiliser un éventuel contact entre l extrémité N-terminale et l extrémité C-terminale de la CPT1A, en créant une liaison covalente. Les résultats de cette étude sont présentés dans la figure B8 et dans le tableau B1 ci-dessous.
19 Tableau B1 : Des mitochondries de foies de rats nourris ont été traitées à l alcool benzylique aux concentrations indiquées, puis avec l agent permettant le couplage stable de l extrémité N-terminale et de l extrémité C-terminale de la CPT1A («Couplage N/C»), ce qui permet d évaluer la probabilité de contact entre ces deux extrémités. Les résultats sont exprimés en de la CPT1A sous forme couplée. Question 46 : Compte tenu des données de l énoncé, et des résultats présentés dans la figure B8 et le tableau B1, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. En fluidifiant la membrane externe de la mitochondrie, l alcool benzylique diminue la probabilité de contact entre l extrémité N-terminale et l extrémité C- terminale de la CPT1A VRAI : le tableau B1 montre qu en augmentant la concentration d alcool benzylique (et donc en augmentant la fluidité membranaire), la probabilité de couplage diminue. b. L alcool benzylique mime l effet du jeûne sur la sensibilité de la CPT1A à l effet inhibiteur du malonyl-coa VRAI : quand on met de l alcool benzylique dans le milieu, la courbe de la figure B8 se superpose à celle des rats à jeun. L alcool mime donc l effet du jeûne (ils augmentent tous deux la fluidité membranaire). c. L alcool benzylique augmente la sensibilité de la CPT1A à l effet inhibiteur du malonyl-coa FAUX : l alcool benzylique diminue la sensibilité de la CPT1A à l inhibition puisqu il mime le jeûne d. L alcool benzylique diminue l activité catalytique de la CPT1A FAUX : Il ne la diminue pas, il permet de contrer l effet inhibiteur du malonyl-coa et ainsi, «augmente» l activité catalytique de la CPT1A e. L alcool benzylique, qui est hydrophobe, entre en compétition avec la palmityl-coa pour le site actif de la CPT1A FAUX : l alcool benzylique à surtout une action indirecte selon l expérience (celle d augmenter la fluidité de la membrane), rien ne dit qu il se fixe sur la CPT1A Question 47 : Au total, concernant la régulation de la CPT1A, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) compatible(s) avec l ensemble des données des énoncés et des résultats présentés dans la partie «enzymologie» de ce problème? a. L inhibition de la CPT1A par le malonyl-coa nécessite un contact entre l extrémité N-terminale et l extrémité C-terminale de l enzyme VRAI : l alcool benzylique augmente la fluidité membranaire, ce qui permet une diminution de la probabilité de couplage entre les extrémités N-TER et C-TER, et cette fluidité empêche l inhibition du malonyl-coa. On peut donc dire que le couplage N- TER/C-TER intervient dans l inhibition de l enzyme.
20 b. Le jeûne, en provoquant une augmentation de la fluidité de la membrane externe de la mitochondrie, diminue la probabilité de contact entre l extrémité N- terminale et l extrémité C-terminale de la CPT1A VRAI : l alcool mime le jeûne et le tableau montre qu il permet de diminuer la probabilité de contact (et donc, le jeûne aussi) c. Le jeûne, en provoquant une diminution de la sensibilité de la CPT1A à l effet inhibiteur du malonyl-coa, entraîne une diminution du transfert de l acide palmitique vers la matrice mitochondriale FAUX : le jeûne entraîne une activation de l enzyme CPT1A, il faut alors retourner au chapitre du début pour voir sa fonction (les textes sont longs, donc pensez à noter les infos importantes sur une feuille à part) : faire passer l acide palmitique du cytosol vers la matrice mitochondriale. Si elle est active, elle augmente le transfert de l acide gras. d. La diminution de la concentration de malonyl-coa observée au cours du jeûne peut contribuer à l augmentation du transfert de l acide palmitique vers la matrice mitochondriale VRAI : Si la concentration de l inhibiteur diminue, l activité de CPT1A augmente, et elle peut ainsi faire passer plus d acide palmitique du cytosol vers la matrice pour qu il y soit dégradé. e. Une augmentation du transfert de l acide palmitique vers la matrice mitochondriale permet d augmenter sa dégradation oxydative VRAI : Evidemment, puisque la dégradation oxydative se déroule dans la mitochondrie. L inhibition de la CPT1A pourrait être un moyen de traiter certaines maladies métaboliques. Plusieurs groupes ont donc cherché à synthétiser des inhibiteurs de cette enzyme. Une première série de composés, appelés C73-CoA, C76-CoA et C75-CoA ont été testés sur une CPT1A recombinante produite dans la levure S. cerevisiae. Les résultats sont présentés dans la figure B9
21 Figure B9 : L activité CPT1A a été mesurée en l absence d inhibiteurs, ou en présence de l un d entre eux. Chaque inhibiteur a été utilisé à la même concentration (5 μm). Question 48 : Concernant les composés étudiés dans l expérience de la figure B10, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs allostériques de la CPT1A FAUX : voir proposition b b. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs compétitifs de la CPT1A VRAI : les droites coupent l axe des ordonnées en un même point qui est 1/Vmax, et elles coupent l axe des abscisses en des points différents qui sont plusieurs -1/Km. La Vmax est donc inchangée, contrairement à la Km. On a donc affaire à des inhibiteurs compétitifs c. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs non compétitifs de la CPT1A FAUX : voir la proposition b d. Le composé qui a le plus fort pouvoir inhibiteur est le C75-CoA VRAI : c est celui qui donne le -1/Km le plus proche de l origine, ce qui correspond au plus grand Km, et donc à la plus faible affinité ( plus grand pouvoir inhibiteur) e. Le composé qui a le plus fort pouvoir inhibiteur est le C73-CoA FAUX : même raisonnement qu en d, il donne le -1/Km le plus éloigné de l origine, donc le plus petit Km, et la plus grande affinité (plus faible pouvoir inhibiteur des 3) BIOENERGETIQUE Des souris mutantes présentant un excès d activité CPT avec un métabolisme lipidique anormal font l objet d analyses biochimiques musculaires qui donnent les résultats suivants, exprimés en % par rapport aux valeurs mesurées dans des muscles de souris contrôles : 148 sur la vitesse de production mitochondriale d ATP 151 sur la vitesse de production mitochondriale d acétyl-coa 62 pour la teneur en lipides totaux 144 sur la vitesse de production mitochondriale de FADH2 Question 49 : Sur la base des résultats ci-dessus, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. Les souris mutantes ont une glycolyse hépatique anormalement élevée FAUX : dans cette expérience on regarde des analyse musculaire et non hépatique, de plus comme c est le métabolisme lipidique qui est anormal, on ne parlerai plutôt d une bêtaoxydation anormal (voie de dégradation des acides Gras) que d une glycolyse qui est la voie de dégradation du Glucose. b. L accroissement de la production d ATP peut résulter d un accroissement de la fourniture de molécules de coenzymes réduits à la chaîne respiratoire VRAI : les coenzymes réduits NADH et FADH2 vont agir au niveau des complexes CoI et CoII en «relâchant» leurs électrons dans la chaîne respiratoire, permettant ainsi en passant de complexe en complexe le bon fonctionnement de l ATP synthase en
22 permettant le maintient du gradient de proton nécessaire à cette dernière. Ainsi les 148% sur la vitesse de production mitochondriale d ATP peuvent être dut à un grand apport de molécules de coenzymes réduits. c. Ces souris mutantes ont une capacité anormalement élevée d oxydation musculaire des acides gras VRAI : on voit en effet que la teneur en lipide totaux est inférieur à la normale (62%), cela témoigne d une surconsommation de ces lipides, or cette surconsommation se fait via la bêta-oxydation, d où une oxydation musculaire anormalement élevée. d. Un défaut du Cycle de Krebs est responsable de la totalité des observations effectuées chez les souris mutantes FAUX : un défaut au niveau du cycle de Krebs n expliquerai pas la teneur lipidique anormalement faible. e. Aucune des interprétations ci dessus n est exacte FAUX Dans des conditions où les acides gras peuvent entrer dans les mitochondries, les capacités fibroblastiques de production mitochondriale de NAD+, NADH + H+, FAD, FADH2 et ATP sont mesurées, en réponse à l addition d acides gras libres, chez un malade présentant un déficit sévère de la ß-oxydation des acides gras. Question 50 : Par comparaison avec des fibroblastes d un individu sain, identifiez la ou les bonne(s) réponse(s) : a. La production d ATP est accrue FAUX : le malade présente un déficit sévère de la bêta-oxydation, la dégradation des acides gras en acétyl-coa est donc diminuée, du coup le cycle de Krebs est moins alimenté en Acétyl Coa et ne fonctionne donc pas de manière optimal, d où au final une production d ATP qui diminue. b. Le rapport NAD+ / NADH+H+ est diminué FAUX : la chaine respiratoire n est pas affectée en soit, donc elle continuera à consommer tous les NADH,H+ qu elle trouvera, alors que dans le même temps, comme le cycle de Krebs est ralentie par la baisse de fourniture d Acétyl-CoA, la formation de NADH,H+ se trouve ralentie. On a donc de plus en plus de NAD+ alors que le NADH,H+ est moins renouvelé, le rapport NAD+/NADH,H+ diminue donc! c. Les productions de NADH + H+, FADH2 et ATP sont diminuées VRAI : comme il y a un déficit de la bêta-oxydation, moins d Acétyl-CoA est fournit au cycle de Krebs qui est donc moins efficace et qui ne produit plus autant de coenzymes réduits. De plus comme il y a moins de coenzymes réduits, la production d ATP au niveau de la chaine respiratoire diminue également. d. Les productions de NADH + H+ et FADH2 sont diminuées VRAI : voir c e. Le rapport FAD / FADH2 est diminué
23 Des mitochondries de souris normales sont isolées et placées dans un milieu permettant leur respiration en présence de substrats. La capacité de ces mitochondries à respirer, synthétiser de l ATP et être le siège d un transport de protons est mesurée. Question 51 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. La face inter-membranaire de la membrane mitochondriale interne se charge positivement par rapport à la face matricielle au cours de la respiration VRAI : b. La membrane mitochondriale externe contrôle l établissement du gradient de protons présent de part et d autre de la membrane interne lorsque les mitochondries respirent FAUX : c est au niveau de la membrane mitochondriale interne que s effectue ce contrôle c. La synthèse mitochondriale d ATP est accompagnée par un transport de protons depuis l espace inter-membranaire vers la face matricielle de la membrane interne VRAI : c est grâce à ce mouvement des ions H+ qui passent selon leurs gradient que l ATP synthase peut faire sont boulot et reformer de l ATP d. Au sein de la chaîne respiratoire, interviennent des systèmes transporteurs de protons et d électrons VRAI : les Co I et CoIII ou IV en sont de bon exemple puisqu ils permettent de transporter des électrons de complexe en complexe et de faire remonter des H+ pour maintenir un gradient entrant. e. Le transport des électrons, le transport des protons et les phénomènes de phosphorylation correspondent à des processus étroitement couplés VRAI : tous ceci permet au final la resynthèse d ATP. BIOLOGIE MOLECULAIRE Pour étudier la structure du ou des gènes codant la CPT1 ainsi que le profil d expression tissulaire, des chercheurs disposent d une banque d expression réalisée à partir d un mélange de tissus (foie, muscle, muscle cardiaque) ainsi que, pour le criblage, d un anticorps anti CPTA1 de lapin préparés à partir de l oligopeptide 1 comme indiqué plus haut (figure B3). Cette banque d expression utilise un système bactérien comme cellules hôtes. Question 52 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. On réalise une banque d expression après extraction des acides nucléiques suivie d une transcription in-vitro puis synthèse des ADNc et clonage FAUX : on réalise la banque après extraction des ARN suivie de l action de la transcriptase inverse pour obtenir les ADNc. Les ADNc étant ensuite insérés dans des vecteurs. b. On réalise une banque d expression après insertion de l ensemble des ADNc obtenus à partir du mélange dans un phage comportant un gène codant la bêta galactosidase sous le contrôle du promoteur d un «gène domestique» humain
24 FAUX : le promoteur n est pas celui d un gêne domestique humain mais de plusieurs gènes différents dont celui codant la bêta galactosidase c. On réalise une banque d expression après insertion des ADNc obtenus à partir du mélange, chacun dans un vecteur comportant un gène codant la bêta galactosidase sous le contrôle d un promoteur de l opéron lactose VRAI : Pour faire une belle banque d expression, il nous faut une cellule hôte (la bactérie), le fragment d intérêt (ADNc) et notre vecteur portant un marqueur de sssélection (aaah!). L intérêt est que notre fragment d intérêt s insère dans le gène de la bêta galactosidase et l invalide, tout en se servant du promoteur de l opéron lactose pour pouvoir être transcrit. Invalider la bêta galactosidase permet de détecter quelles bactéries contiennent les vecteurs recombinés, car la bêta galactosidase, en présence de son substrat, rend le milieu bleu. Si le milieu ne devient pas bleu, la bactérie a recombiné le bon vecteur. d. La protéine produite est en général une protéine de fusion VRAI : les vecteurs d expression contiennent notre ADNc, placé au sein d un gène codant une protéine du vecteur normalement. La transcription de cette séquence recombinée suivie d une traduction aboutit donc à une protéine de fusion. e. Tous les ADNc insérés correspondant à CPTA1, exprimeront la protéine CPTA1 FAUX : les ADNc insérés ne sont pas forcément mis dans le bon sens de lecture et ne Seront donc tous transcrits. Le criblage à l aide de l anticorps 1 a permis d identifier deux clones recombinants (X et Y). Chacun de ces clones est amplifié après culture en milieu bactérien et les inserts sont extraits et isolés du vecteur. Chacun des inserts (ADNc) des clones X et Y est marqué de manière radioactive et utilisé comme sonde pour réaliser un northern blot à partir d extraits de différents tissus. Après hybridation avec l ADNc du clone X et lavages, l autoradiographie montre les résultats indiqués dans la figure B10 : Figure B10 : Northern blot obtenu après hybridation avec l ADNc du clone X. GB = globules blancs. La ligne en pointillés fins est un simple guide d alignement. Question 53 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? Les résultats observés sont compatibles avec : a. Une transcription spécifique de tissu
25 VRAI : la taille des transcrits diffèrent en fonction des tissus, et ceux retrouvés dans les globules blancs (2,4Kb) ne sont pas ailleurs, de même pour les transcrits de 0,8Kb du placenta b. Une réplication spécifique de tissu FAUX : piège classique^^, on est dans un northern blot, on ne voit donc que les ARN c. Une utilisation de promoteurs alternatifs VRAI : on obtient des transcrits de tailles différentes d. Une maturation spécifique de tissu des ARNm VRAI : l épissage alternatif n est pas le même en fonction du tissu e. L absence du signal au niveau du muscle ne peut s expliquer que par des artéfacts liés à la qualité de l anticorps 1 utilisé pour le criblage de la banque d expression FAUX : ce n est pas la seule explication possible, il peut aussi s agir d une question de sensibilité de la technique utilisée ou autre. La membrane du northern-blot est débarrassée (déshybridée) de la sonde ADNc du clone X puis ré-hybridée avec l ADNc du clone Y. Les résultats obtenus sont indiqués dans la figure B11 : Figure B11 : Northern blot obtenu après hybridation à l aide de l ADNc du clone Y. GB = globules blancs. La ligne en pointillés fins est un simple guide d alignement. Question 54 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? Les résultats des deux northern blots (B10 et B11) sont compatibles avec: a. L utilisation de sites d initiation de la traduction différents selon les tissus FAUX : Northen blot, donc parler de traduction n a pas sa place ici b. L utilisation de promoteurs alternatifs selon les tissus VRAI : en fonction des positions des promoteurs, les transcrits obtenus n ont pas forcément la même taille
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