Cours de la section de Mathématiques EPFL Introduction aux Sciences de Vivant Premier semestre, octobre Bénédikt TRAN

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1 Cours de la section de Mathématiques EPFL Introduction aux Sciences de Vivant Premier semestre, octobre 2013 Bénédikt TRAN 12 janvier 2014

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3 Table des matières I Polycopié 7 1 Préambule 9 2 Introduction L ADN et l ARN Structure de l ADN La réplication de l ADN La structure de l ARN Rôle de l ADN/ARN De l ADN à l ARN De l ARN à la protéine Conclusion La manipulation de l ADN Introduction Séquençage de Sanger Séquençage Next Generation Séquençage d un génome Phylogénie Moléculaire Génome humain La PCR : Polymerase Chain Reaction La réparation de l ADN L expression des gènes Introduction Généralités sur les protéines De l ADN à la protéine La transcription

4 4 TABLE DES MATIÈRES La traduction Généralités sur les cellules Introduction Le cycle cellulaire L Interphase Les phases de l interphase Checkpoints du cycle cellulaire La division cellulaire La division cellulaire : pas à pas La Méiose Meiose I Méiose II Variation génétique Télomères et Réplication Introduction La réplication Fork Proteins Origines de réplication Télomères Fonctionnement de la télomérase Rôle de la télomérase Horloge cellulaire et rôle des télomères Applications de la télomérase Structure d un télomère Conséquences d un raccourcissement Le vieillissement La biologie du cancer Introduction Généralités sur les tumeurs Caractéristiques communes des tumeurs Production énergétique d une cellule Généralités sur les cancers Les oncogènes et suppresseurs de tumeurs Récepteurs tyrosines kinases (RTK) et protéine signal (Ras) Généralités sur RAS

5 TABLE DES MATIÈRES Mutations sur RAS Suppresseurs de tumeurs Généralités sur les suppresseurs de tumeurs Cancer du poumon Classification moléculaire EFG-R SDS-Page et Western Blot Biotechnologie Introduction L hormone de croissance Le peptide signal Production d une hormone de croissance Production dans le cytoplasme Production dans le cytoplasme : pas à pas Les corps d inclusion Production dans le périplasme Libération hors du périplasme Résumé Biotechnologie et société Hormones de croissance et isoformes Génétique mendelienne Généralités sur les Erythrocytes Facteur Rhésus Homogénéité génétique L appartenance familiale L étude des microsatellites Introduction Disomie uniparentale L étude des microsatellites Déterminer le génotype Applications pratiques Quand la PCR rate, tout dérape Disomie uniparentale du chromosome Méthylation de l ADN Exemple de méthylation

6 6 TABLE DES MATIÈRES 11 Conclusion 79 II Bibliographie 81

7 Première partie Polycopié 7

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9 Chapitre 1 Préambule Ce polycopié est destiné aux étudiants en première année de la section de mathématiques de l EPFL. Nous supposons que les personnes qui le liront ont pris connaissance des slides présentés en cours, ou ont la possibilité de les consulter à leur guise. De cette manière, il nous est plus simple de leur demander de se référer aux figures présentes dans ces présentations plutôt que de les inclure dans ce polycopié. Toute erreur dans ce polycopié est purement due au hasard et il ne se dit nullement parfait. Il s agit simplement d un polycopié basé sur les notes de cours, des présentations ainsi que d ajouts personnels obtenus lors de la scolarité au gymnase de l auteur. 9

10 10 CHAPITRE 1. PRÉAMBULE

11 Chapitre 2 Introduction 2.1 L ADN et l ARN Structure de l ADN L ADN (acide désoxyribonucléique) est le support de stockage de l information génétique chez tous les organismes vivants connus et chez certains (mais pas tous) virus. La structure de l ADN est une double hélice, composée de deux brins complémentaires qui sont formés de bases azotées (A, T, C et G), de phosphates (P) ainsi des glucoses (en l occurrence des désoxyriboses : C 5 H 10 O 4 ) La réplication de l ADN La réplication de l ADN se fait d une manière semi-conservative. Après ouverture de la double hélice d ADN, chacun des deux brins est utilisé comme matrice pour la synthèse d un nouveau brin. On notera que la réplication se fait d une manière bi-directionnelle, et ce à partir de la même origine. Les fourches de réplication progressent le long de l ADN- Matrice dans le sens 3 à 5. De plus, la réplication est asymétrique ; l un des brins est synthétisé de façon continue (brin précoce) alors que l autre est synthétisé sous forme de fragments d Okazaki (brin tardif). L enzyme en jeu pour cette synthèse est l ADN polymérase La structure de l ARN L ARN est comme l ADN à quelques différences près. Premièrement le désoxyribose de l ADN est remplacé par un ribose dans l ARN (C 5 H 10 O 5 ). Si dans l ADN, la thymine (T) se trouve en face de l adénine (A), dans l ARN, cette dite thymine est remplacée par 11

12 12 CHAPITRE 2. INTRODUCTION une Uracile (U). On notera également que l ARN possède des structures 3-D complexes, i.e. elle peut se replier de plusieurs manières. On distingue également plusieurs "sousgroupes" d ARN comme les ARNm, ARN t, ARNr... Nous reviendrons en détail dans le chapitre traitant l expression des Gènes. 2.2 Rôle de l ADN/ARN L ADN est, comme nous l avons vu, le support de l information génétique, c est-à-dire qu il contient toutes les informations nécessaires à la survie de l être vivant ; l ARN, quant à lui, en plus de stocker l information de l ADN, est un catalyseur des réactions biologiques. Les rôles de l ARN sont multiples, mais son principal est l expression génique, c est-à-dire la production de protéines à partir de l information primaire (l ADN). On remarquera une complexité plus grande dans les mécanismes des Eucaryotes que chez les Procaryotes De l ADN à l ARN L ADN est stocké dans les chromosomes (pour les êtres vivants Eucaryotes 2 ). Pour passer du stade ADN au stade ARN, plusieurs étapes sont nécessaires avant d y parvenir. La première étape se passe dans le noyau : il s agit au préalable de transcrire l ADN et pré-arnm, (ARN pré-messager). On appelle cela la transcription. Il est après nécessaire de faire subir des modifications à cet ARN pré-messager pour le transformer en ARNm un peu plus "fonctionnel" : cette étape s appelle le splicing ou épissage, qui a pour but d enlever les introns (parties non-codantes) et de laisser les exons (partie codantes).la deuxième étape consiste simplement en l exportation de l ARNm dans le cytoplasme. La transcription ADN à préarn m Premièrement, une ARN polymérase catalyse la synthèse d ARN qui se passe comme un synthèse d ADN, avec l Uracile remplaçant la Thymine. Un promoteur (séquence d ADN où l ARN polymérase se lie à l ADN) est nécessaire : c est le point de départ de la synthèse. Le enhancer est une séquence ADN qui activera la transcription. Finalement, il est nécessaire d avoir des facteurs de transcription modulant...la transcription. 1. Les Eucaryotes, étymologiquement bon noyau, est l une des deux "familles" (le mot n est pas le mieux choisi, mais c est le plus simple dans ce contexte) d être vivants. L autre est les Procaryotes, étymologiquement avant noyau, i.e. le stade "noyau" n est pas atteint. 2. Concernant les Procaryotes, l ADN est sous forme de plasmide (ADN circulaire)

13 2.2. RÔLE DE L ADN/ARN 13 Du préarn m à l ARN m mature Le passage de l ARN pré-messager à l ARN messager mature se fait lors du splicing alternatif (épissage alternatif). Des enzymes modifient les préarnm en excluant les longues séquences non-codantes nommées introns et en rassemblent les exons, créant un ARNm avec une séquence codante ininterrompue. Lors de cet épissage alternatif, une diversité peut se créer (on verra d autres manières de créer une diversité dans les chapitres suivants). Régulations post-transcriptionnelles D autres modifications peuvent se faire après l exportation dans le cytoplasme de l ARNm. Il s agit par exemple de modification de l ARNm, de localisation de l ARNm ou encore des ARN µ (micros ARN) De l ARN à la protéine Chaque protéine est codée suivant la succession de triplets (trois bases se suivant sur l ADN). La séquence de ARNm est complémentaire à un brin de l ADN que l on nomme le brin template. Durant la traduction (passage ARN à protéine), les bases d un ARNm sont lues par triplets de l extrémité 5 à 3. Ces triplets codants présent sur ARNm sont appelés codons et chaque codon représente un acide aminé (qui sont au nombre de 20). La traduction est assurée par un complexe macromoléculaire présent de le cytoplasme constitué ARN et de protéines que l on nomme ribosome. Les erreurs de traduction Sachant que 1 nucléotide sur 10 9 est mal synthétisé lors de la réplication de l ADN, il peut que des erreurs se produisent lors de la transcription et la traduction. On appelle cela des mutations (en l occurrence, des mutations spontanées). Cependant, d autres mutations peuvent survenir par exemple en présence de mutagènes (substances chimiques, rayons X, UV, etc). Régulations post-traductionnelles Les protéines peuvent être modifiées après la traduction! Certaines d entre elles devront passer par un clivage fait par une enzyme spécifique (par exemple la pro-insuline -> Insuline) et ce pour être activées. D autres subissent des modifications covalentes (par ex. une phosphorylation de Serine (Ser), Thréonine (Thr) ou Tyrosine (Tyr) par des kinases) et d autres peuvent former des complexes en se liant entre-elles (comme les protéines ribosomales).

14 14 CHAPITRE 2. INTRODUCTION 2.3 Conclusion Dans ce premier chapitre, il était question de présenter en grande lignes la génétique moléculaire. Dans le reste de ce polycopié, la plupart des chapitres reprendront des notions de cette introduction, tout en étoffant le domaine ciblé. Par exemple, nous discuterons plus en détail de ce qui est de l expression des gènes, dans la manière de "lire l ADN" (sujet du prochain chapitre) ou encore de la biotechnologie utilisant et maniant l ADN dans ses limites.

15 Chapitre 3 La manipulation de l ADN 3.1 Introduction C est bien beau de savoir ce qu est l ADN, mais la question principale reste à le comprendre et surtout à le lire d abord. Dès lors l humain, dans toute son ingéniosité, a pu trouver deux méthodes pour séquencer (et donc lire) l ADN : la méthode dite de Sanger (obsolète depuis 2007) et la méthode de séquençage à grande échelle dite Next Generation (actuellement utilisée). 3.2 Séquençage de Sanger Le séquençage de Sanger commence avec de l ADN simple brin. Commençons par noter 3 l extrémité gauche et 5 l extrémité droite de ce brin. Le principe de la méthode de Sanger est de synthétiser artificiellement une amorce ou primer qui est de l ADN simple brin ayant une longueur d environ 20 nucléotides (nt). La direction de synthèse se faisant de 5 à 3 (pour le brin synthétisé), il est nécessaire que notre amorce ait comme extrémité gauche 5 et une extrémité droite 3. Afin de synthétiser ce nouveau brin, on insère l amorce, le brin mère et l enzyme ADN-Polymérase dans un bain de bases composé 99% de précurseurs (A,T,C,G) non-terminaux et de 1% de terminaux 1 Chaque produit de Sanger a dès lors une taille variable et se termine par un précurseur terminal (terminateur). Ces produit sont séparés par électrophorèse, c est-à-dire que l on va les trier par taille. Les produits les plus courts ont une polarité négative plus forte que les produits les plus longs. Chaque terminateur étant fluorescent (présence de radioactivité), nous sommes en mesure de lire sur une plaque les différents niveaux de fluorescence, et 1. Un précurseur est dit terminal s il empêche l enzyme ADN-Polymérase de continuer de synthétiser). 15

16 16 CHAPITRE 3. LA MANIPULATION DE L ADN donc de lire base après base. Cependant, cette méthode présente un grand défaut : chaque terminateur est irréversible, c est-à-dire que l on ne peut pas le réutiliser pour les produits suivants. A ce problème, une solution est la méthode Next Generation. 3.3 Séquençage Next Generation A l inverse de la méthode Sanger, la méthode Next Generation utilise des terminateurs réversibles ; toutefois, les produits sont plus courts que ceux obtenus par la méthode Sanger. Un terminateur réversible est constitué du précurseur original (A, T, C ou G) avec en plus une partie qui peut être retirée et remplacée : cette partie est celle de la fluorescence et de la couleur. Dès lors, la méthode Next Generation se passe de la manière suivante : 1. On commence à incorporer les quatre nucléotides à chaque endroit (chacun a une couleur définie). 2. On photographie l instant et on rend les terminateurs non-terminaux (c est-à-dire qu ils n ont pas la fluorescence et l action terminatrice). 3. On recommence avec de nouveaux terminateurs. Introduisons la figure suivante afin d expliquer plus simplement le processus :

17 3.4. SÉQUENÇAGE D UN GÉNOME Séquençage d un génome Nous avons vu que nous pouvons séquencer de petits bouts d ADN : mais qu en estil d un génome tout entier? Plusieurs méthodes s offrent à nous comme par exemple la stratégie ShotGun qui consiste en la fragmentation du génome en segments qui seront aléatoirement choisis et individuellement synthétisés et remis ensemble grâce à la puissance informatique. Cependant, des problèmes surviennent lorsque une séquence de plus de 500 nt est répétée dans un même génome : les assemblages sont incorrects. De même, il se peut que certaines séquences n aient pu être représentées lors de la fragmentation aléatoire. 3.5 Phylogénie Moléculaire Le but de cette section est de déterminer de combien l individu B est proche d un individu A en comparant leurs séquences génomiques respectives. Plus il y a de différences, plus l individu B est éloigné de A ; à l inverse plus la séquence de A est similaire à celle de B, plus B est proche de A. Afin de représenter cet écart entre A et B, il est utile d introduire une matrice des distances ainsi qu un arbre représentant les distances génétiques. 3.6 Génome humain Le génome humain est composé d environ 3*10^9 paire des bases, et d environ gènes différents. Actuellement, nous avons découvert que 20% du génome code pour un des ces gènes, alors que 80% est apparemment "inutile". Parmi ces différents gènes, citons FGFR3, faisant partie de la famille des récepteurs, ou encore l insuline faisant partie des hormones (molécule signal). Plus précisément, le génome humain est composé d une grande partie de séquences répétées (50%) et de régions inter-géniques (30%). Le reste est composé d introns à 20% (cf Chapitre I) et seulement 2% sont des exons! Notons que la plupart des séquences répétées sont des transposons, séquence d ADN capable de se déplacer et de se multiplier de manière autonome dans un génome, par un mécanisme appelé transposition : la plupart du temps, leur origine est virale. Le reste des séquences répétées sont les centromères (indispensables à la division cellulaire) et les télomères (se référer au chapitre traitant la Biologie du Cancer).

18 18 CHAPITRE 3. LA MANIPULATION DE L ADN 3.7 La PCR : Polymerase Chain Reaction La PCR sert à amplifier une séquence d ADN donnée afin de l étudier d une manière plus aisée. Un exemple d application de la PCR est la délétion systématique de gènes chez la levure. On enlève des ORFs (Open Reading Frames) afin d observer l impact de ce gène en moins sur la levure. Les résultats sont impressionnants : 80 des gènes putatifs ne sont pas essentiels pour sa croissance, mais on remarque que si A et B sont deux gènes apparemment inutiles, la levure ne peut vivre sans A et B (avec A ou B, elle le peut) La réparation de l ADN Afin de réparer les lésions qui peuvent survenir sur l ADN, l être vivant dispose de plusieurs moyens : BRCA1, BRCA2 (répare les cassures de l ADN dans les cellules mammaires), qui lorsque mutés, nuisent à la cellule qui doit se débrouiller pour réparer son ADN sans leur aide. BRCA1 et BRCA2 appartiennent également à la classe suppresseurs de tumeur. Plus de détails sur le cancer surviendront dans le chapitre qui traite ce dit sujet. 2. A prendre le "ou" comme le "ou" exclusif (XOR).

19 Chapitre 4 L expression des gènes 4.1 Introduction Chaque cellule somatique contient la même information génétique (ADN), et pourtant elles ne sont pas toutes pareilles. 1. Alors qu est-ce qui rend les uns et les autres différents entre eux? De plus, chaque cellule a une fonction et une structure précise qu elle se doit d acquérir : cette étape de son développement est la différenciation cellulaire. Finalement certains gènes auront comme fonction de réguler les gènes, afin de palier à chaque problème. Par exemple, une cellule du pancréas exprimera le gène codant l insuline alors que la cellule osseuse n exprimera pas ce gène. Le contrôle de l expression du gène se fait majoritairement au niveau de la transcription (c est-à-dire au passage ADN-ARNm). 4.2 Généralités sur les protéines Une protéine est une longue chaîne d acide aminés. Les acides aminés, comme nous l avons vu au premier chapitre, sont au nombre de 20. Plus précisément, on appelle "acide aminé" à cause de la présence d un groupement amine NH 2 ou NH + 3 ainsi qu un groupement carboxyle COOH ou COO. Chaque acide aminé a une taille propre, par ex. la Glycine (Gly) étant assez petite comparé à une Lysine (Lys). Les liaisons peptidiques formées par réaction de condensation (émission d un H 2 O) unissent le groupement carboxyle d un acide aminé au groupement amine de l autre. Le polypeptide (ou protéine) possède une structure répétitive complétée par les chaînes 1. Les cellules somatiques, ou soma, sont toutes les cellules animales (uniquement chez les Bilatériens) qui ne seront jamais à l origine de gamètes (spermatozoïdes et ovules), par opposition aux cellules germinales qui constituent le germen. Source : Wikipedia 19

20 20 CHAPITRE 4. L EXPRESSION DES GÈNES latérales R des acides aminés appelées parties variables de la molécule (spécifiques à chaque acide aminé). Une protéine admet plusieurs structures : 1. La structure Primaire : Séquence d acides aminés liés par covalence dans le polypeptide. 2. La structure Secondaire : La structure secondaire comprend les conformations d une chaîne polypeptidique, en hélice α ou en feuillets plissés β par exemple, maintenues en place par les effets de courbure et par les liaisons hydrogène. 3. La structure Ternaire : C est la conformation globale d un polypeptide, renforcée par les interactions en radicaux R des acides aminés. 4. La structure Quaternaire : Elle réside dans la relation entre les deux ou plusieurs polypeptides qui composent une protéine (dans le cas de l hémoglobine, il s agit de quatre polypeptides). Chaque acide aminé est codé par une séquence spécifique (cf Chapitre I). Les protéines portent la plupart des fonctions cellulaires : ARN Polymérase, facteurs de transcriptions, FGFR3, récepteurs membranaires, ribosomes, insuline ou histones sont tous des protéines!

21 4.3. DE L ADN À LA PROTÉINE De l ADN à la protéine Nous avons vu d une manière générale au premier chapitre comment l on passe de l ADN à la protéine. Intéressons-nous d une manière plus précise à ce processus. L ADN est une molécule enroulée autour de nucléosomes (octamère d histones). Afin de transcrire l ADN en ARN, il est nécessaire d ouvrir les chromatines présentes dans les chromosomes (macrostructure de l ADN). Pour y parvenir, la cellule utilise HAT 2 dont le rôle est d ajouter un groupement acétyle aux histones présentes pour forcer l ouverture de la chromatine. A l inverse, pour la fermer, il suffit d enlever ce groupement acétyle à l aide de HDAC La transcription La transcription se fait grâce à la complétion des bases, c est-à-dire que l on va synthétiser un brin d ARN qui est complémentaire au brin d ADN que l on nomme brin template. Notons que chaque nucléotide T est remplacé par U, et que la transcription se fait de 3 à 5 (pour le brin template) ou de 5 à 3 pour le brin synthétisé. Nous avons déjà rencontré l ADN polymérase, cette enzyme capable de répliquer l ADN. Pour l ARN, de tels types d enzymes existent également : il s agit de l ARN Polymérase I (qui transcrit l ARN présent dans le ribosome), de l ARN Polymérase II (précurseur des ARNm et ARN µ (microarn)) ainsi que de l ARN Polymérase III (responsables de la synthèse d ARN courts comme ARN t (ARN de transfert), ARNs (small ARN) et ARNr 5S (ARN ribosomique)) 4. Nous allons surtout nous intéresser au travail de l ARN Polymérase II : catalyser la synthèse de l ARN grâce à un Promoteur (séquence ADN où ARN PolII se place) et un Enhancer 5 (séquence ADN stimulant la transcription). De l ADN à l ARN pré-messager : pas à pas Premièrement il est nécessaire d avoir une chromatine ouverte afin de commencer la transcription. Dès lors, on fait appel à HAT ; le premier complexe d initiation est recruté et placé à l endroit où on a ouvert la chromatine Après l initiation, on peut commencer à synthétiser le nouvel ARN. A un moment donné, l ARN Pol II s arrête afin de récupérer un des messages sous formes de Phosphates (P) pour enfin reprendre son élongation. Finalement, le complexe est libéré, et l ARN pré-messager fini. Afin d obtenir un ARN messager fonctionnel il nous faut encore quelques étapes détaillées ultérieurement. 2. Histone acetyl-transferase 3. Histone deacetylase 4. Il y a également un quatrième type d ARN Polymérase mais nous n en parlerons pas dans ce polycopié. 5. On peut traduire ce mot en français par "amplificateur" et en allemand par "Verstärker".

22 22 CHAPITRE 4. L EXPRESSION DES GÈNES Les facteurs de transcription La plupart des facteurs de transcription eucaryotes sont des activateurs, c est-à-dire qu il vont agir au niveau de l initiation de la transcription. Leur rôle est divers et varié et nous vous donnons une liste non-exhaustive : 1. Ils recrutent des enzymes modificatrices qui ouvrent localement la chromatine (comme HAT). 2. Ils "reboot" l ARN Pol II après qu elle a fait sa pause. 3. Ils recrutent des co-activateurs, c est-à-dire des facteurs qui ne vont pas se lier directement à l ADN mais qui recruteront les modificateurs d histone. 4. Ils peuvent se lier directement au complexe de transcription. Cependant, il existe également des facteurs de transcriptions qui sont des répresseurs, agissant également au niveau de la transcription. Par exemple, ces derniers recruteront HDAC afin de fermer la chromatine, ou ils recruteront des co-répresseurs qui "annuleront" les actions des co-activateurs. Du pré-arn m au ARN m Maintenant que l on a un ARN pré-messager, il est nécessaire de le modifier pour que le ribosome puisse le "lire" correctement et faire la traduction. Le passage de pré-arnm à ARNm se fait en trois étapes : 1. Ajout d une 7-methylguanosine à l extrémité 5 du pré-arnm (appelez-le chapeautage, ou capping). 2. Splicing (épissage) (épissage du pré-arnm). 3. Polyadénylation (ajout d une queue poly-a en 3 terminale du ARN m ) Le capping se fait afin de protéger le futur ARNm des enzyme de "destruction" de type ARN (les ARNases). Le splicing se fait grâce au splicéosome, un complexe d ARN et de protéines qui catalyse cette réaction d épissage. De plus un épissage alternatif peut avoir lieu, c est-à-dire qu à partir d un même gène on peut obtenir différents ARNm si on a "épissé" le pré-arnm d une manière différente (et on obtient alors d autres protéines). L épissage alternatif consiste à sauter des exons, couper des exons et n en prendre qu une partie, couper au site 5, etc etc. Finalement la polyadénylation est un processus visant à stabiliser le ARNm obtenu.

23 4.3. DE L ADN À LA PROTÉINE 23 Structure de l ARN m mature L ARNm a une structure simple : 1. En 5, il y a le chapeau 2. En 5 une UTR 6 3. Une région codante (avec un codon Start qui est une Méthionine : AUG en langage ARN et ATG en langage ADN). 4. Un codon stop. 5. Une région 3 UTR. 6. Et finalement la queue Poly(A) et 3 terminale. Les ARN µ ou microsarns Les ARN µ sont des régulateurs des ARNm mais ne sont pas des messagers pour autant. Leur rôle est souvent post-transcriptionnel, c est-à-dire qu ils ne vont agir que lorsque l ARNm a été entièrement synthétisé. Un ARN µ est un ARN simple brin et cible toutes les régions des ARNm dont il est le complémentaire. Lors de la traduction, le ribosome va "bloquer" sur le ARN µ ; c est l un des rôles des ARN µ. Il peut également servir comme sécurité pour éviter qu une partie de l ARNm ne se dégrade de quelque manière La traduction La traduction est l action de passer d un ARNm à une protéine fonctionnelle (ou presque dans certains cas). Pour ce faire, il est nécessaire d avoir à disposition des ARNm, des ARNr (ARN ribosomal), des ARN t (ARN de transfert), de l ATP 7, des enzymes, et bien sûr le ribosome. Les acteurs principaux Un ARN t sert à apporter les différents acides aminés nécessaires à la fabrication de la protéine. On appelle anti-codons le triplet de bases présentent sur un ARN t qui est complémentaire au codon, triplet sur un ARNm. Un ribosome est un organite composé de deux unités (une grosse et une petite) qui coordonne l activité entre ARNm et ARN t ; il est composé de protéines et de ARNr. 6. UTR signifie Untranslated region, i.e. région non-traduite. 7. L ATP est l acronyme de Adénosine triphosphate, son rôle principal étant de fournir de l énergie lors des différents processus

24 24 CHAPITRE 4. L EXPRESSION DES GÈNES La traduction : pas à pas La traduction est divisée en trois phases : initiation, élongation et terminaison. L initiation a pour but de rassembler l ARNm, le codon start (Met) attaché à un ARN t placé ultérieurement sur le site P du ribosome, ainsi que les deux sous-unités du ribosome. L élongation elle se subdivise encore en trois phases : 1. Reconnaissance du codon, i.e. recherche de l anti-codon spécifique et placement de l ARN t sur le site A du ribosome. 2. Liaison peptidique entre l acide aminé présent sur le site P et celui sur le A. 3. Libération de l ARN t, libération du site A, déplacement relatif du ribosome et recherche de l anti-codon suivant. Illustrons nos propos par la figure suivante :

25 4.3. DE L ADN À LA PROTÉINE 25 La terminaison de la synthèse quant à elle se produit dès que le premier codon stop a atteint le site A. Le complexe ribosome-arnm se dissocie, le polypeptide est relâché et le ribosome se reprend sa forme d origine (deux sous-unités liées). La figure suivante résume les étapes de l ADN à la protéine.

26 26 CHAPITRE 4. L EXPRESSION DES GÈNES

27 Chapitre 5 Généralités sur les cellules 5.1 Introduction Le but de ce chapitre est de comprendre comment une cellule arrive à se multiplier, à se reproduire, bref de comprendre ce que l on nomme communément le cycle cellulaire. Pour cela, nous allons nous intéresser à deux processus essentiels dans la vie d un être vivant : la mitose et la méiose. Le corps humain se compose d environ cellules, diverses et variées, malades ou saines. Dès lors, essayons de comprendre comment et pourquoi elle sont dans leur état actuel. 5.2 Le cycle cellulaire Le cycle cellulaire typique d une cellule humaine consiste en deux grandes phases : L interphase (I) que l on peut subdiviser en trois étapes : la Phase G 1, la Phase S ainsi que la Phase G 2 et la phase mitotique (M). Nous reviendrons en détail sur cette dernière ultérieurement L Interphase Typiquement, l Interphase prend 90% du temps du cycle cellulaire, ceci étant dû qu elle est avant tout une phase d accroissement et de réplication de l ADN (qui se fait en S). Mais le problème suivant se pose : comment faire pour étudier la progression du cycle cellulaire? Certaines protéines étant spécifiques à un certain moment clé du cycle cellulaire, il suffit de les suivre à la trace afin de reconstruire le trajet suivi par la cellule du début à la 27

28 28 CHAPITRE 5. GÉNÉRALITÉS SUR LES CELLULES fin. Pour ce faire nous les marquons d une manière fluorescente et nous suivons cette fluorescence grâce à une FACS. L immunofluorescence et FACS Si nous nous intéressons à une protéine comme par exemple l α-tubuline qui est importante pour les µ-tubules, il va nous falloir la marquer. La méthode pour le faire est la suivante : 1. Premièrement nous attachons un anticorps primaire à la protéine. 2. Puis nous rajoutons sur un anticorps secondaire un marqueur de fluorescence. 3. Finalement nous attachons le premier produit à cet anticorps secondaire qui sera le traceur. L analyse FACS consiste à mesure l intensité de fluorescence de cet anticorps secondaire avec un machinerie assez complexe que nous ne détaillerons pas ici (se référer aux slides du cours traitant le cycle cellulaire). La protéine, n ayant pas la même importance à chaque étape du cycle cellulaire, on peut voir sur un graphique des pics se déplaçant au fil du temps, ayant une plus ou moins grande intensité suivant l importance de la protéine. Comme nous savons quand cette protéine est importante (par exemple à une phase A), nous pouvons noter qu au pic le plus grand, nous entrons dans la phase A Les phases de l interphase Comme annoncé plus haut, il y a trois phases dans l interphase. Les chromosomes sont répliqués durant la phase S et tout au long du parcous, la progression est régulée par un système de contrôle. De plus, chaque cellule a une vitesse spécifique pour son cycle cellulaire. Penchons-nous sur un complexe régissant la progression : Cyclin/Cdk. Régulation du cycle Les cyclines (Cyclin) et les cycline-dependent kinases (Cdks) sont des enzymes qui vont réguler le cycle cellulaire en agissant directement sur ce dernier. Pour information, les kinases sont des enzymes qui vont phosphoryler, c est-à-dire qui rajouteront des Phosphates (P). Différentes complexes (Cyclin/Cdks) vont régir les transitions du cycle cellulaire comme la transition de G 1 à S ou celle de G 2 à M. Intéressons-nous au complexe (Cyclin B/Cdk1) qui régit la transition G 2 à M, c est-à-dire la transition (Interphase-Mitose).

29 5.2. LE CYCLE CELLULAIRE 29 Le complexe Cyclin B/Cdk1 Ce complexe est composé de deux sous-unités : une cycline B et un Cdk1 (une kinase). L activation de ce complexe va phosphoryler les substrats-clés de la mitose (i.e. il régulera leur activité). A la fin de la phase S, Cdk1 est seule (et est inactivée). La cycline B est synthétisée durant la phase G 2 et est associée à Cdk1 afin de créer le complexe (Cyclin B/Cdk1) (inactif). Lors de l association, on a ajouté un P activant et un P inactivant sur Cdk1 grâce à CAK (Cdk-Activating-Kinase : apporte le P activant) et Wee1 (Cdk-Inibitory Kinase : apporte le P désactivant). Afin de passer du stade "Inactif" à celui d "Actif", il est nécessaire de recourir à l aide d une autre enzyme : Cdc25 qui aura comme but de désactiver (de retirer) le P inactivant. Cdc25 est ce que l on appelle une phosphatase. Finalement, le complexe servira à réguler le fuseau mitotique, ou la condensation des chromosomes. A la fin de la phase M, la cycline B est dégradée et Cdk1 devient automatiquement inactive.

30 30 CHAPITRE 5. GÉNÉRALITÉS SUR LES CELLULES Checkpoints du cycle cellulaire Le cycle cellulaire est régulé extérieurement et intérieurement (par exemple par l attachement des chromosomes). Plusieurs checkpoints placés tout au long du parcours doivent assurer un cycle de cellulaire sans accrochages. Si la cellule n arrive pas à passer un checkpoint, alors le cycle est arrêté. Les différents checkpoints sont dans la phase G 1, la phase M (on appelle ce checkpoint SAC) et finalement dans la phase G 2. Chacun des ces checkpoints a un rôle bien précis que nous allons maintenant détailler. Checkpoint G 1 (G 1 /S transition) Pour la plupart des cellules, ce checkpoint est le plus important. Son rôle est de vérifier si la cellule a assez d aliments (donc de l énergie) pour entrer en réplication (puis division) ainsi que l environnement et la qualité de l ADN. Usuellement, une cellule qui passe ce checkpoint termine son cycle cellulaire normalement. Cependant, s il y a un quelconque problème, la cellule est immédiatement envoyée en phase G 1 0. Si la cellule passe le checkpoint, elle émet un signal comme par exemple un growth factor (facteur d accroissement) qui, s il n est pas émis, entraîne le passage en G 0. Autres checkpoints Nous avons également le checkpoint en G 2 (S/M transition) qui vérifie l intégrité de l ADN (après réplication) ainsi que le checkpoint en M (SAC) qui vérifie si les chromatides sont correctement orientées. Un non-attachement des chromosomes aux faisceaux des microtubules entraînera un arrêt du cycle cellulaire à cet endroit. D autres signaux de contrôle sont émis lors du cycle cellulaire. Par exemple, il est nécessaire que les cellules soient attachées à un substrat si elles désirent continuer leur cycle cellulaire (anchorage dependence), ou il est également nécessaire que les cellules aient assez de place (après division) (contact inhibition). Ces contrôles sont effectués lors du passage au checkpoint G 1. Notez que les cellules cancéreuses n exhibent ni la dépendance de l ancrage (anchorage dependence) ni le contact inhibition. Nous discuterons de la biologie du cancer dans un autre chapitre. 1. Cette phase est une phase terminale et usuellement non-réversible. Nos neurones, par exemple, sont en phase G 0, impliquant qu ils ne se répliqueront plus jamais. Néanmoins, les hépatocytes (cellules du foie) peuvent sortir de leur phase G 0, d où la possibilité que le foie a à se régénérer.

31 5.2. LE CYCLE CELLULAIRE La division cellulaire La division cellulaire d un eucaryote se divise en deux phases : la mitose et la cytokinèse (cytokinesis), c est-à-dire la division du cytoplasme. Le but primaire de la mitose est de transmettre un matériel génétique d une cellule mère à deux cellules filles avec le moins de perte possible (pour le cas de S. cerevisiae, une levure, une erreur survient toute les 10 5 divisions). Une instabilité mitotique peut causer des instabilités génomiques comme les tumeurs. Conventionnellement on divise la mitose en cinq étapes : 1. Prophase 2. Prométaphase 3. Métaphase 4. Anaphase 5. Télophase La cytokinèse peut être vue comme une télophase "tardive" La division cellulaire : pas à pas En prophase, le centrosome se dédouble et les microtubules se développent autour des centromères. Les chromosomes apparaissent par accentuation de leur condensation. Les deux centrosomes, entourés de microtubules en étoile, migrent vers les pôles opposés de la cellule. Les chromosomes se fissurent et l on aperçoit les deux chromatides qui constituent ces derniers. Fragmentation puis disparation de l enveloppe nucléaire et disparition graduelle des nucléoles. Les microtubules s allongent autour des chromosomes pour former finalement un fuseau mitotique entre les centrosomes. Au terme de la prophase, les chromosomes ont achevé leur raccourcissement ; chaque chromosome est formé de deux chromatides réunies en un point : le centromère. En prométaphase, les chromosomes sont fixés par leur centromère à un microtubule du fuseau. Dans la métaphase, la traction des microtubules amène les centromères à se disposer au niveau équatorial du fuseau : les chromosomes sont disposés sur une plaque équatoriale. L anaphase consiste en le dédoublement du centromères. La traction des microtubules sur les centromères sépare alors les deux chromatides soeurs. Chacune des deux chromatides de de chaque chromosome migre vers l un des pôles du fuseau. En fin d anaphase, une chromatide de chaque chromosome se trouve à chaque pôle de la cellule. La télophase consiste en l amincissement des chromosomes et de leur allongement, créant ainsi un nouveau réseau de chromatine. Un étranglement se produit au niveau équatorial du fuseau tandis que ce dernier disparaît progressivement.

32 32 CHAPITRE 5. GÉNÉRALITÉS SUR LES CELLULES Finalement la cytokinèse est le fait de séparer le cytoplasme de la cellule mère : les noyaux des cellules filles se reconstruisent, une enveloppe nucléaire et un nucléole apparaissant. La cellule se partage et chaque cellule fille reconstruit sa propre membrane. Centrosomes et fuseaux mitotiques Les centrosomes ne sont nécessaires que dans une division cellulaire non-méiotique ou végétale. Ils sont gérés par des protéines motrices qui hydrolysent l ATP le long des microtubules. L assemblement en fuseau est régulé par BimC/Eg5, un kinase tétramérique, agissant à l extrémité positive. Notons que la dynéine contribue également à ce mouvement, en agissant à l extrémité négative. Durant la prométaphase, des microtubules s attachent aux kinétochores (également dits centromères) afin de créer un mouvement des chromosomes. A M checkpoint, un complexe Sécurine-Séparine a été placée sur le chromosome afin d éviter la dégradation de la cohésine qui assure la non-séparation des chromatines. Cependant, il est nécessaire de les séparer pendant l anaphase. Dès lors, sachant que la séparine dégrade la cohésine mais que la sécurine inhibe son action, il nous faut inhiber l action de la sécurine. Dès lors, la séparine dégrade la cohésine et les deux chromatides soeurs sont libérées. 5.3 La Méiose La méiose est un processus particulier de division cellulaire qui ne se déroule que dans les organes reproducteurs et qui permet de transformer des cellules normales à 2n chromosomes (diploïdes) en gamètes à n chromosomes (haploïdes). Une cellule-souche à 2n chromosomes donne 4 gamètes à n chromosomes. La méiose se déroule en deux étapes correspondant à deux divisions successives. 1. Une division réductionnelle qui réduit le nombre total de chromosomes : c est la plus atypique des deux divisions. 2. Une division équationnelle qui partage en deux chaque chromosome. Dans chaque division, on trouve les mêmes étapes que dans la mitose classique et pour distingues les deux divisions successives on utilise les chiffres romains I et II. Par exemple, une métaphase I = métaphase de méiose I. La fertilisation est l union d un spermatozoïde et d un ovule, générant un zygote ayant reçu un chromosome de chaque parent.

33 5.3. LA MÉIOSE Meiose I Durant la méiose I les chromosomes homologues sont séparés. D une cellule 2n on passe à deux cellules n (dès lors haploïdes). La méiose I se compose d une Prophase I, Métaphase I, Anaphase I, Télophase I et cytokinèse. Le principe est le suivant : Durant la prophase I, les chromosomes se spiralisent et un fuseau apparaît. La membre nucléaire disparaît, tout comme le nucléole. Les chromosomes homologues (tétrades de chromatides) s apparient ensemble. Des échanges de segments peuvent se produire entre chromosomes homologues : c est ce qu on appelle crossing-over. En Métaphase I, les chromosomes appariés se fixent par leur centromère au fuseau. Lors de l Anaphase I, les chromosomes homologues se séparent par ascension polaire. Durant cette phase, il se peut qu une non-disjonction des chromosomes homologues se fasse, c est-à-dire qu à la fin, il y aura possibilité de monosomie ou trisomie. Finalement, lors de la télophase I, les chromosomes restent spiralisés et la cellule peut entrer en cytokinèse. La méiose I est spéciale car elle contient trois événements uniques. Le crossing-over, le fait que les chromosomes sont sous forme de tétrades sur la plaque métaphasique et que finalement ce sont les chromosomes homologues que l on sépare en Anaphase I et non les chromatides Méiose II La méiose II se fait comme un mitose simple. Notons juste qu il y aussi une possibilité de non-disjonction en Anaphase II. Cependant, la plupart des non-disjonctions se fait durant l anaphase I Variation génétique Trois mécanismes contribuent à la diversité génétique. Le crossing-over, l assortiment indépendant des chromosomes et la fertilisation -aléatoire. Cela implique que chaque zygote est unique. Lors de l assortiment indépendant des chromosomes, les pairs de chromosomes homologues s orientent aléatoirement lors de la métaphase de méiose I. Chaque paire de chromosome donne le maternel et le paternel à une cellule fille, sans tenir compte du choix des autres. Il y a plus de 8 millions de combinaisons possibles des chromosomes (2 23, où 23 = n pour les humains) en écartant les crossing-over. La fertilisation aléatoire ajoute de la diversité génétique car n importe quel spermatozoïde peut féconder n importe quel ovocyte.

34 34 CHAPITRE 5. GÉNÉRALITÉS SUR LES CELLULES

35 Chapitre 6 Télomères et Réplication 6.1 Introduction Rappelons ici quelques notions concernant l ADN et sa réplication. Nous savons que l ADN est composé de quatre bases azotées qui sont l Adénine, la Guanine, la Thymine et la Cytosine. Les deux premières sont classées dans les purines alors que les deux sont ce qu on appelle des pyrimidines. Chaque purine est associée à une pyrimidine (AT et CG). Concernant la réplication de l ADN, nous allons la revoir d une manière plus détaillée, ce à l aide des schémas suivants : 35

36 36 CHAPITRE 6. TÉLOMÈRES ET RÉPLICATION 6.2 La réplication Fork Proteins Les "DNA Replication Fork Proteins" sont une famille de protéines qui agissent lors de la réplication de l ADN. Citons-en une liste non-exhaustive que l on complétera en ajoutant chacune des fonctions. 1. Polα/primase : A la base c est une ADN-polymérase-alpha-primase. Elle sert à la synthèse de l ADN sur le brin tardif (là où se trouveront les fragments d Okazaki). 2. Polδ : ADN polymérase delta, elle est, avec l ADN polyméraseɛ, a la même fonction que la Polα/primase mais agit sur le brin précoce (brin continu). 3. DNA ligase I : Sert à "coller" les fragments d Okazaki ensemble ; en gros les enzymes sont les ciseaux (ADN endonucléase par exemple) et la colle c est l ADN ligase. Pour avoir une idée d autres protéines, vous pouvez vous référer aux figures suivantes (malheureusement en anglais) :

37 6.3. TÉLOMÈRES Origines de réplication La réplication commence pour chaque être vivant à un endroit. Cependant, cet endroit, suivant le type d être vivant peut différer de place. Pour ce qui est d E.Coli, un procaryote, il n y a qu une seule origine de réplication. Une levure eucaryote, elle, en possède dans les 300, alors que l être humain en a plus de ! 6.3 Télomères Les télomères désignent les extrémités des chromosomes. Etant difficile à répliquer, chaque chromosome a une extrémité 3 simple brin (ceci étant dû aussi au fait que la réplication est semi-conservative). Une des questions que l on se pose c est : existe-t-il une enzyme qui peut résoudre ce problème de réplication terminale? La réponse à cette question est oui, il existe une telle enzyme : il s agit de la télomérase qui va ajouter une séquence d ADN "poubelle" qui servira à prévenir un raccourcissement des télomères. La figure suivante vous illustre le processus. Dans cette séquence située à la fin, on remarque une extrémité 3 simple brin. A chaque réplication, on perdra un bout de cette extrémité. Dès lors la télomérase ajoutera

38 38 CHAPITRE 6. TÉLOMÈRES ET RÉPLICATION des séquences inutiles pour que ce soit ces séquences qui sont détruites lors de la réplication et non la séquence originelle! Structure de la télomérase 1 La composition protéique de la télomérase humaine a été identifiée en 2007 par le Dr Scott Cohen et son équipe de recherche médicale du Children s Institute en Australie. Elle se compose de deux sous-unités : La sous-unité protéique ou TERT (Telomerase reverse transcriptase). La région codante du gène TERT a 3396 bp, et se traduit par une protéine de 1131 acides aminés. C est une enzyme à activité transcriptase inverse, un ADN polymérase ARN-dépendante qui assure la synthèse de la séquence télomérique en utilisant l autre sous-unité ARN comme matrice. TERT permet de catalyser la transcription inverse. La sous-unité ARN ou TERC (Telomerase RNA component). C est un ARN structuré de 451 nucléotides comportant plusieurs régions en tige et boucles et un pseudo-nœud. Une des boucles de ce pseudo-nœud contient la séquence qui sert de matrice à la synthèse de la répétition télomérique Fonctionnement de la télomérase En utilisant le pseudo-nœud du TERC comme modèle, le TERT ajoute une séquence répétée de six nucléotides : 5 -TTAGGG (chez tous les vertébrés, la séquence est différente chez d autres organismes) à l extrémité 3 des chromosomes. Ces répétitions TTAGGG (avec les différentes protéines partenaires associées) sont appelées télomères. La région modèle de TERC est 3 - CAAUCCCAAUC Rôle de la télomérase Dans les cellules normales, la télomérase n est plus exprimée. Cela induit inévitablement un raccourcissement des chromosomes. Lorsque les télomères ont une taille critique, la cellule rentre en sénescence, c est-à-dire qu elle arrête de se répliquer (sorte de "log out"). Afin d observer ce effet, nous utilisons deux marqueurs : γ-ha2x et 53BP1. De plus, à l inverse des cellules dites normales, la plupart des cellules cancereuses expriment la télomérase, les rendant ainsi immortelles. On notera que la télomérase n est pas présente dans des bactéries comme E.Coli. 1. Paragraphe pris de Wikipedia

39 6.3. TÉLOMÈRES Horloge cellulaire et rôle des télomères La télomérase, étant réprimée dans les cellules normales, les télomères se raccourcissent à chaque réplication. Lorsqu ils sont trop petits, ils envoient un message pour rentrer en sénescence cellulaire. Cependant si les facteurs de transcription p53 ou prb perdent leur fonction principale, les réplications continuent et des fusions entre les extrémités chromosomiques peuvent survenir. Lors de la mitose, les centromères se séparent, mais les deux "chromatides" obtenues sont en fait une réunion de deux chromatides de deux chromosomes différents. Dès lors, il y a un problème ; la cellule active htert (human TERT) afin de stabiliser les chromosomes. Cependant, ces chromosomes étant anormaux, cela entraîne le plus souvent un cancer. Ainsi le rôle d un télomère est non seulement d éviter la fusion des chromosomes, mais également de résoudre le problème du raccourcissement invétiable des chromosomes à chaque réplication. La télomérase est exprimée seulement durant la vie germinale, pendant l embryogenèse précoce et dans quelques cellules souches chez l adulte, afin d assurer un bagage de séquences "poubelles" Applications de la télomérase La télomérase peut-elle être réactivée afin de créer des cellules immortelles? Dans certains types de cellules (fibroblastes, cellules endothéliales et épithéliales), il est possible d immortaliser grâce à l expression de htert, sans pour autant que ces cellules soient anormales, ou acquièrent les caractéristiques d une cellule cancéreuse.

40 40 CHAPITRE 6. TÉLOMÈRES ET RÉPLICATION Structure d un télomère Une structure d un télomère peut se voit comme un t-loop. C est-à-dire que le télomère. ayant une extrémité 3 simple brin, va créer une boucle afin de la protéger. Il est beaucoup plus simple de voir cette structure en t-loop sur la figure suivante : Conséquences d un raccourcissement Si tout se passe bien, une cellule entre en sénescence si ses télomères sont trop courts. S il y a un problème, alors on peut avoir affaire à un cancer, ou à des dommages aux tissus (syndromes télomériques comme la Dyskératose congénitale 2 ou anémie aplasique qui, elle, est une atteinte de la lignée des érythrocytes (globules rouges)) Le vieillissement Une question subsiste : pourquoi devons-nous vieillir? pourquoi ne pas inspirer à la jeunesse éternelle? Pour empêcher le vieillissement, il faut remonter l horloge biologique, en reprogrammant le noyau par exemple. Le vieillissement peut être vu comme un processus épigénétique. Cette question de l immortalité intéressera sûrement les générations futures. 2. On l appelle aussi le syndrome de Zinsser-Engman-Cole, qui se caractérise par un vieillissement prématuré. Ce trouble congénital progressif est cependant rare.

41 Chapitre 7 La biologie du cancer 7.1 Introduction Chaque année, près de huit millions de personnes meurent chaque année d un cancer. Mais au fait, que connaissons à propos du cancer? avons-nous développé un outil pouvant aider ces malades à vivre? On dénombre plus de cent types de cancer. Présentons une liste non-exhaustive. 1. Les carcinomes, origine épithéliale. 2. Les sarcomes, dont l origine est une tumeur au niveau des tissus connectifs. 3. Les hématopoïétiques, d origine sanguine. On dénombre dans ce genre de cancer, les lymphomes et les leucémies. Lorsque l on rajoute le préfixe "adéno" devant un de ces types (comme un adénocarcinome), cela indique un rapport à un tissu glandulaire. Un "squameux" est utilisé pour désigné un objet en forme d écaille, ou formé d écailles. 41

42 42 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER 7.2 Généralités sur les tumeurs Une tumeur n est rien d autre qu un tissu qui n est plus normal, i.e. qui ne fait plus ce qu il devrait faire normalement. L origine des tumeurs est monoclonale, c est-à-dire que les cellules tumorales proviennent d un ancêtre commun, une unique cellule qui s est transformée. Pour prouver cette théorie, les scientifiques montrèrent que chez la femme, l un des deux chromosomes X est désactivé durant l embry-développement. Les cellulesfilles maintiennent cette inactivation. La migration de l enzyme G6PD illustre un exemple de preuve : Il y a sûrement plus de types de tumeurs que l on pense, c est-à-dire beaucoup de sous-types moléculaires. Cependant, la plupart de tumeurs partagent ce que l on appelle tumor hallmarks, c est-à-dire des caractéristiques communes.

43 7.3. CARACTÉRISTIQUES COMMUNES DES TUMEURS Caractéristiques communes des tumeurs La figure suivante vous illustre ce que l on appelle ce "Tumor Hallmarks". Une cellule tumorale a besoin de plus d énergie qu une cellule normale. Rappelons comme une cellule normale obtient son énergie Production énergétique d une cellule A partir d un glucose C 6 H 12 O 6 et de l oxygène O 2, la cellule va créer de l énergie. Le bilan global est le suivant : C 6 H 12 O 6 + 6*O 2 > 6*CO 2 + 6*H 2 O + 36 ATP Schématiquement, la première étape se fait dans le cytoplasme : il s agit de la glycolyse qui vise à obtenir deux pyruvates (C 3 H 4 O 3 ). Le cycle de Krebs (2) et la formation d eau et d énergie (3) se font dans la mitochondrie (matrice de la mitochondrie pour (2) et membre interne pour (3)). Ceci est ce qui se passe pour une cellule normale.

44 44 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER Cependant, pour une cellule tumorale, il y aura, en plus du cycle de Krebs, une fermentation lactique à partir du pyruvate afin d obtenir encore plus d énergie. C est pour synthétiser des lipides (pour grandir) que la cellule tumorale va en plus faire la biosynthèse à partir d un lactate obtenu par fermentation. En conclusion, une cellule tumorale a besoin de plus de glucose qu une cellule normale afin de survivre. Si l on voulait endiguer un cancer, inventer un médicament qui bloque l entrée du glucose dans les cellules tumorales serait alors le médicament miracle. 7.4 Généralités sur les cancers Les cancers sont des maladies causées par une perturbation d un gène, souvent due à des mutations sur l ADN. Ces mutations sont le plus généralement des mutations somatiques, éventuellement germinales (par exemple pour BRCA1 et BRCA2). Pour information, notre corps est composé de cellules, et cellules seront formées dans notre vie, par croissance ou division. Ainsi, les chances de mutations et de formations de cancer augmentent avec l âge. Pour palier à une telle fin, le corps humain possède des protéines pouvant réparer l ADN, ou supprimer des tumeurs 1. Les différentes mutations sur l ADN sont dues par exemple aux erreurs survenues lors de la réplication de l ADN (erreurs inévitables), ou par des agents mutagènes (comme vu au premier chapitre). Le vieillissement, favorisant l apparition d un cancer, il n est pas étonnant de constater que la plupart des cancers surviennent tard dans la vie (lorsque l on a accumulé des mutations). 1. p53, le facteur de transcription, est également un suppresseur de tumeur. Notez que sa fonction biologique est avant tout d être un facteur de transcription

45 7.4. GÉNÉRALITÉS SUR LES CANCERS Les oncogènes et suppresseurs de tumeurs Dans un développement tumoral, il y a deux types de catégories de gènes : les (proto)oncogènes et les suppresseurs de tumeurs. On dit qu un oncogène est un proto-oncogène muté, c est-à-dire un proto-oncogène malade. A la base un proto-oncogène n est rien d autre qu un gène normal qui a une possibilité de muter et causer un cancer. Une mutation oncogénique est généralement une mutation activante, c est-à-dire un gain de fonction. L activation oncogénique aberrante (anormale) d un proto-oncogène amène un changement dans l expression de la protéine codée. Cependant, la fonction première d un oncogène n est pas d induire un cancer ; un cancer survient à cause d une activation aberrante. Dans le langage courant, cette distinction entre proto-oncogène (non muté) et oncogène (muté) est fréquemment ignorée. Le terme proto-oncogène n a pas encore été adopté dans le langage courant ; on parle d oncogène non-muté et d oncogène muté, et même simplement d oncogène (le contexte indiquant s il est muté ou non). Cependant, dans le polycopié, nous prendrons le terme de proto-oncogène pour désigner le cas non-muté, et oncogène pour le cas muté. En général une mutation oncogénique est une mutation : 1. inactivante pour les suppresseurs de tumeurs. 2. activante pour les oncogènes. L activation oncogénique (dans le cas d un oncogène) peut être due à plusieurs facteurs : 1. Une mutation 2. Une augmentation de la transcription d un ARNm 3. Augmentation de la stabilité de la protéine 4. Amplification génomique au locus 2 5. Une translocation chromosomique. 2. Le locus est la région où se situe un allèle sur un chromosome.

46 46 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER 7.5 Récepteurs tyrosines kinases (RTK) et protéine signal (Ras) Un récepteur tyrosine kinase que nous avons déjà rencontré dans ce cours est FGFR3. Un RTK est une simple protéine transmembranaire, c est-à-dire une protéine traversant de part et d autre la membrane. On compte environ 60 gènes pour l humain. Un récepteur tyrosine kinase est de base inactivé et est en deux pièces détachées. Pour activer le récepteur il faut lier les deux parties ensemble à l aide d un ligand. Cela s appelle la dimérisation ; à cela s ajoute une étape de phosphorylation (ajout de Phosphate) afin de rendre actif le récepteur. La plupart des protéines signal sont activées par phosphorylation ou par liaison GTP, c est-à-dire que dans un stade inactif une protéine n aura pas de phosphate (respectivement de GTP) alors qu en phase active, elle aura un phosphate (respectivement de GTP). Mais laissons cette figure vous expliquer le principe général :

47 7.5. RÉCEPTEURS TYROSINES KINASES (RTK) ET PROTÉINE SIGNAL (RAS) Généralités sur RAS La protéine signal Ras produite par le gène Ras se présente sous deux formes, la forme inactive Ras-GDP et la forme active Ras-GTP. La protéine Ras fait partie de la chaîne de signalisation cellulaire du récepteur-enzyme à activité tyrosine kinase. Ce récepteur est activé par l EGF, un facteur de croissance épidermique. Après fixation de l EGF à son récepteur, celui-ci se dimérise et on observe une phosphorylation des résidus tyrosines. Un adaptateur protéique SH2 lié à la protéine Grb2 vient se fixer sur une tyrosine phosphorylée. Cette protéine Grb2 permet l activation de la protéine Sos qui elle-même va activer la protéine Ras. La protéine Ras activée déclenche alors une cascade de phosphorylations (MAPK cascade). Lors d une mutation, c est cette dernière qui est maintenue constamment activée augmentant la prolifération cellulaire. Le fait que Ras soit sous forme -GDP ou -GTP signifie que c est GAP et GEF qui vont réguler son activité. GAP est une GTPase activating protein, c est-à-dire quelque chose qui va désactiver Ras, alors que GEF est une Guanine nucléotide exange factor, une enzyme qui active Ras. Les formes oncogéniques mutantes de Ras deviennent résistantes à l action de GAP ; ainsi Ras (mutée) reste dans sa forme active Ras-GTP Mutations sur RAS Les mutations sur RAS affectent un acide aminé seul. Sachant que RAS a plusieurs formes (que l on nomme isoformes)comme H-Ras ou K-Ras, intéressons-nous à la mutation suivante :

48 48 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER On remarque que la mutation sur le premier exon de H-Ras a changé un H-Ras protooncogène en H-Ras oncogène. Cette mutation illustrée est une mutation G12V, c est-àdire que l on a eu une Glycine qui s est changée en Valine. D autres mutations peuvent se produire sur les isoformes, comme par exemple G13, ou Q61. Les mutants exhibent une activité constante, c est-à-dire qu il y a eu un gain de fonction. Les mutations sur Ras participent probablement à la plupart des débuts de tumeurs en général. Une expérience a été faite sur des souris afin de voir quelles sont les conséquences de telle ou telle mutation de Ras. Ainsi, on dit que la mutation oncogénique sur Ras est une mutation activante. L activité de Ras peut être mesurée grâce à la fluorescence émise lors d un transfert d énergie (FRET). La figure suivante illustre la méthode utilisée : Peu de temps après stimulation d EGF, Ras est activée (comme vu dans Généralités sur Ras). Cependant, la plupart des tumeurs expriment soit des RTKs mutés, soit Ras muté. C est-à-dire, soit le récepteur est constamment activé, soit c est Ras qui l est. Il n est pas possible (en général) que le RTK et Ras soient mutés. Dès lors, si une mutation affecte Ras, un médicament bloquant l activité de RTK est totalement inutile (et vice-versa).

49 7.6. SUPPRESSEURS DE TUMEURS Suppresseurs de tumeurs Un suppresseur de tumeur, lorsqu il est correctement exprimé, est un gène qui permet de supprimer ou d inhiber l activité et le développement d une tumeur. Néanmoins, durant la progression d une tumeur, ces gènes sont fréquemment inactivés (perte de fonction) à cause d une mutation oncogénique. Une telle inactivation peut être due à plusieurs facteurs comme par exemple : 1. Une mutation. 2. Une baisse de la transcription d un ARNm (par exemple, un méthylation d un promoteur). 3. Une baisse de la stabilité de la protéine. 4. Une délétion génomique au locus (une délétion d un triplet ou d une partie du génome peut être vue comme une mutation) Généralités sur les suppresseurs de tumeurs Certains suppresseurs de tumeur agissent directement sur l activité des oncogènes en inhibant cette dernière. Par exemple, nous savons que GAP est ce qui désactive quelque chose qui a été activé par GTP. Cependant, il existe un suppresseur de tumeur : NF1. Le gène NF1 code une protéine, la neurofibromine, ou neurofibromatose (NF1), formée de plus de acides aminés et qui ferait partie de la famille des enzymes hydrolysant la GTP (Guanosine triphosphate). Le gène NF1 est localisé sur le chromosome 17 en position 17q11.2. Dès lors, elle agit comme un "booster" pour favoriser le passage de Ras Actif à Ras inactif. p53, le suppresseur muté Un autre suppresseur de tumeurs, p53, est fréquemment muté. Nous l avons déjà rencontré! souvenez-vous lors que nous parlions de la télomérase et des facteurs de transcription (sa fonction biologique première est d être un facteur de transcription). Lors d une lésion de l ADN, d une anomalie du cycle cellulaire ou d une perturbation du métabolisme cellulaire, p53 entre en jeu et décide de la suite des événements. Il peut décider de l arrêt de la division cellulaire, pouvant entraîner une phase de réparation de l ADN et finalement une reprise de la division (et donc une stabilité cellulaire et génétique), ou peut décider d une apoptose, c est-à-dire de la mort cellulaire programmée, qui conduit à l auto-destruction de la cellule endommagée. Une étude a montré également que les souris qui n ont pas de p53 développent des tumeurs et meurent rapidement. Cela montre l importance d un tel gène pour le fonctionnement de l organisme.

50 50 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER Outre le fait que p53 soit un suppresseur de tumeur, il est avant tout un facteur de transcription qui régule l expression de la plupart des gènes. On notera également sa forme tétramérique comme sur la figure suivante.

51 7.7. CANCER DU POUMON Cancer du poumon Les cancers du poumon peuvent se séparer en deux familles :les NSCLC (80%) [1] et les SCLC (20%) [2]. [1] désigne la catégorie des Non-Small cell lung cancer, c est-à-dire des cancers dont les cellules sont assez grandes, alors que [2] désigne les Small cell lung cancer, logiquement avec de petites cellules. [1] se divise en trois sections : celle à grande cellules (20%), celle à cellules squameuses (30%) ainsi que celle à adénocarinomes (50%). Ces termes ont été définis dans la section d introduction de ce chapitre. Cependant, nous avons récemment un nouvelle classification moléculaire des non-small cell lung cancer comme nous pouvons le voir sur les figures suivantes. La première figure représente la classification générale.

52 52 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER

53 7.7. CANCER DU POUMON Classification moléculaire La classification moléculaire est basée sur les lésions génétiques, principalement dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeur. Cela nous permet de penser à de nouvelles stratégie pour traiter les tumeurs et cela implique que les patients avec des tumeurs qui peuvent paraître les mêmes au microscope devront peut-être traités d une manière totalement différente EFG-R La plupart des patients avec un NSCLC doivent leur cancer à une mutation d un RTK : EFG-R. Deux inhibiteurs à ce RTK ont été trouvés : Gefitinib, et Erlotinib. Cependant, la plupart des personnes n ont aucune réponse à ces petites molécules inhibitrices, ce qui fait qu elles leur sont inutiles. On trouve néanmoins que chez 10% des personnes atteintes d un adénocarcinome, il y a une réponse. Le but est dès lors de comprendre pourquoi certaines personnes sont réactives ou pas à l action de ces inhibiteurs. Dans les laboratoires, on a démontré que le mutant EGF-R était plus sensible à Gefitinib. Ainsi, on devrait pouvoir traiter les cancers dus à cette mutation à l aide d inhibiteurs du RTK. Mais comme nous l avons vu, certains patients présentent une résistance à cette action, rendant impossible la guérison de cette manière.

54 54 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER 7.8 SDS-Page et Western Blot La méthode de Western Blot est une méthode utilisée pour détecter des protéines spécifiques après issues d une mixture, après leur séparation dans un gel. La difficulté est que chaque protéine est caractérisée par sa masse et sa charge. Cela oblige alors la migration par électrophorèse de dépendre de ces deux composantes. La méthode est expliquée sur les figures suivantes :

55 7.8. SDS-PAGE ET WESTERN BLOT 55

56 56 CHAPITRE 7. LA BIOLOGIE DU CANCER

57 Chapitre 8 Biotechnologie 8.1 Introduction Certaines personnes sont atteintes de ce que l on appelle un diabète, une maladie qui se caractérise par une non-production d un hormone essentielle à la survie du corps humain : l insuline. L insuline est une hormone peptidique 1 d environ 50 acides aminés qui est produite par le pancréas (plus précisément par les cellules des îlots de Langerhans). Son rôle est de baisser le taux de sucre dans le sang en attirant et faisant rentrer le sucre dans les cellules. Nous n entrerons pas plus en détail concernant son rôle. Les personnes insululino-dépendantes doivent s injecter de l insuline produite industriellement. Jusqu en 1982, l insuline industrielle était extraite du pancréas des porcs ou de vaches ; depuis, une bactérie travaille pour produire l insuline humaine : E.Coli. Nous reviendrons en détail sur la production d une hormone par la colibacille. 8.2 L hormone de croissance L hormone de croissance, tout comme l insuline, est une hormone peptidique d une taille d environ 191 acides aminés. Elle se nomme également somatropine ou somatrophine. La somatropine est sécrétée par l hypophyse, une glande endocrine dans la tête (nous n entrerons pas dans les détails de sa localisation). A partir du gène cdna, une préhormone de 217 acides aminés est synthétisée. Cette préhormone contient une partie de l hormone mature (191 Acides aminés) et une partie appelée peptide signal (26 acides aminés) se trouvant en N-terminus. Le peptide signal est coupé par l enzyme signal peptidase lorsque l on atteint le stade de protéine 1. Une hormone peptidique est une hormone formée d acide aminés. C est donc une protéine. Nous verrons en détail une autre hormone peptidique : l hormone de croissance. 57

58 58 CHAPITRE 8. BIOTECHNOLOGIE finale. Ce peptide signal est essentiel pour la translocation, c est-à-dire qu elle permet d expliquer le passage de la protéine dans les cavités du réticulum endoplasmique (présent seulement chez les Eucaryotes) où elle est clivée dans la lumière par une protéase (en l occurrence la signal peptidase). Chez les Procaryotes, le peptide signal est utile afin de passer le translocon, sorte de "tunnel" reliant le cytoplasme et le périplasme. La question est maintenant de savoir comment produire une hormone de croissance, que dans le cas de l hormone produite par un peptide signal humain, nous appellerons r-hu-met-gh (Recombinant human methionyl-growth hormone ou méthionyle-hormone de croissance recombinante (pas très français, mais bon)) Le peptide signal Le peptide signal de l hormone de croissance humaine se présente de la manière suivante. Comprenant une majeure partie hydrophobe (20 acides aminés environ), il a une taille totale de 26 AA. Vous remarquerez également l endroit où la protéase (l enzyme signal peptidase en l occurrence) (peut) coupe(r). 8.3 Production d une hormone de croissance E. Coli (abréviation de Escherichia coli) est une bactérie présente dans notre tube digestif. Son génome, se composant d un chromosome circulaire (une copie) et un plasmide circulaire (plusieurs copies), est relativement simple. De plus il nous est possible de manipuler le plasmide ex vivo à volonté. C est-à-dire que l on pourra insérer dans "les lignes de code" du plasmide, les lignes codant l insuline. Pour ce faire, nous utilisons un enzyme de restriction qui permet de couper le plasmide à un endroit précis : le site de restriction. On synthétise alors chimique la séquence d ADN codant l insuline que l on va insérer à ce site de restriction. A l aide d une ADN ligase, le plasmide se reforme et l on a maintenant un nouveau matériel génétique, avec un ADN humain qui code le gène recherché. En fait le site de restriction correspond à un site de résistance s appelant TetR. On l a nommé ainsi, car grâce à ce site, la bactérie est résistante à ce qu on appelle la tétracycline 2. En insérant à cet endroit-là une autre séquence ADN, E.Coli devient 2. La tétracycline agit sur les ribosomes de la bactérie en empêchant l ARN t d aller sur les codons

59 8.3. PRODUCTION D UNE HORMONE DE CROISSANCE 59 vulnérable à la tétracyline. Un autre site de résistance est le site AmpR, pour signifier que ce site produit (tout comme TetR) des enzymes dégradant pour sa part l ampicilline 3. Dès lors, les bactéries contenant le plasmide recombiné peuvent croître en présence d ampicilline mais pas en présence de tétracyline. Ainsi, on peut sélectionner les bonnes bactéries et les cloner Production dans le cytoplasme L hormone de croissance peut se synthétiser dans le cytoplasme de la bactérie. Le cytoplasme, rappelons-le, est le contenu interne de la cellule délimité par la membrane plasmique. Pour ce faire, l ADN qui sera introduit dans le plasmide sera la séquence codant l hormone de croissance humaine. Rappelons que l hormone de croissance humaine naturelle a une taille de 191 acides aminés (vous comprendrez pourquoi cette taille est importante par la suite). Cependant, un petit souci peut se passer. Sachant que le codon start d une séquence est codé AUG (langage ARN), une enzyme, la Méthionine aminopetidase ou MAP enlève le plus souvent la méthionine présente en N-Terminus (après traduction). Dès lors, serait-ce le cas pour l hormone de croissance humaine produite dans la bactérie? Si cela l est, r-hu-met-gh commence par une Phényalanine. 3. L ampicilline agit sur la bactérie en l empêchant de créer sa paroi.

60 60 CHAPITRE 8. BIOTECHNOLOGIE MAP ou pas MAP? La figure suivante vous explique quand MAP enlève la Méthionine et quand MAP ne l enlève pas. Nous allons vous traduire la note de bas de page. "^ a<m indique que Met (Méthionine) est au N-Terminus de la protéine. [ACGPS] indique que l acide aminé qui suit est soit une Alanine, Cystésine, Glycine, Proline ou Sérine. [ ˆP] indique que la Proline ne peut se trouver comme étant le prochain acide aminé (en l occurrence en troisième position (si l on considère le codon start comme la première position))".

61 8.3. PRODUCTION D UNE HORMONE DE CROISSANCE 61 Table des Acides aminés Nous vous donnons un tableau récapitulant abréviations et symboles concernant les acides aminés. Acide Aminé Abréviation 3-Lettres Abréviation 1-Lettre Codons Alanine Ala A GCA, GCC, GCG, GCT Arginine Arg R CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG Aspartic acid a Asp D GAC, GAT Asparagine Asn N AAC, AAT Cystéine Cys C TGC, TGT Glutamic acid b Glu E GAA, GAG Glutamine Gln Q CAA, CAG Glycine Gly G GGA, GGC, GGG, GGT Histidine His H CAC, CAT Isoleucine Ile I ATA, ATC, ATT Leucine Leu L CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG Lysine Lys K AAA, AAG Méthionine Met M ATG Phénylalanine Phe F TTC, TTT Proline Pro P CCA, CCC, CCG, CCT Sérine Ser S TCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGT Thréonine Thr T ACT, ACC, ACG, ACT Tryptophane Trp W TGG Tyrosine Tyr Y TAC, TAT Valine Val V GTA, GTC, GTG, GTT STOP - - TAG, TAA, TGA a. Acide aspartique b. Acide glutamique

62 62 CHAPITRE 8. BIOTECHNOLOGIE Production dans le cytoplasme : pas à pas L ADN codant l hormone de croissance code en fait une pré-hormone de 217 acides aminés composée d un peptide signal et d une hormone mature. Comme l épissage (splicing) n existe pas chez les procaryotes, il nous faut introduire cdna dans E.Coli. cdna correspond aux exons du gène humain sans les introns (c est-à-dire que l on va laisser les exons). Afin de récupérer le cdna et l incorporer au plasmide du procaryote, il est nécessaire d enlever le peptide signal (26 AA). Cependant, nous ne pouvons pas couper immédiatement après les bases codant le peptide. Le seul moyen c est de couper plus loin, en plein dans la cdna ; de cette manière on enlèvera le peptide signal mais également 25 acides aminés (24 AA codant l hormone) essentiels au cdna. Il nous faut impérativement remplacer les 24 acides aminés et le codon start (présent au début du peptide signal) afin de pouvoir faire la production dans le cytoplasme. Mais si on compte bien, on a : Préhormone {}}{ 217 = = Peptide signal Hormone mature {}}{ {}}{ Peptide signal Séquences enlevées {}}{ {}}{ Séquences restantes {}}{ 167 Il faut ainsi synthétiser les 24 acides aminés enlevés et le codon start (afin de permettre à la bactérie de comprendre que c est là qu elle doit commencer). Outre les 191 acides aminés de départ ( ), il y a le codon start. Dès lors on se retrouve avec une séquence ADN faite de 192 acides aminés! et non plus 191 comme il se trouve dans la nature. Nous vous encourageons vivement à consulter le support de cours PDF pour la biotechnologie. En plus d expliquer la procédure, il vous donne des informations concernant les bactéries en général, ainsi que des compléments aux différents sujets qui suivront dans ce chapitre.

63 8.3. PRODUCTION D UNE HORMONE DE CROISSANCE 63 La figure suivante est un résumé concernant la production de l hormone de croissance dans le cytoplasme. La légende (bien qu en anglais) illustre nos propos.

64 64 CHAPITRE 8. BIOTECHNOLOGIE Les corps d inclusion En incluant un promoteur fort pour la synthèse de l hormone, E.Coli a changé son mode de vie. Elle s est emballée et a créé tellement d hormone que des corps d inclusion se sont formés à ses extrémités. La figure suivante illustre une présence de corps d inclusion dans le cytosol (cytoplasme). Mais au fait, qu est-ce qu un corps d inclusion? Un corps d inclusion est composé de protéines mal repliées, qui n ont dès lors aucune activité biologique. Les protéines qui se sont repliées correctement ont une activité biologique et sont solubles, c est-à-dire hydrophile. Les corps d inclusion, à l inverse, sont des parties hydrophobes, créant ainsi des problèmes locaux. Mais rassurez-vous, à chaque problème il y a une solution, ou presque. Afin d utiliser les corps d inclusion, il existe une méthode pour les rendre actifs. Cela consiste en : 1. Purification par centrifugation 2. Lavage 3. Solubilisation (Opération par laquelle on amène une substance à l état de solution, le fait de rendre soluble ou plus soluble un produit, une substance) 4. Recherche du niveau d énergie minimum. Après avoir fait ces différentes étapes, les corps d inclusion se "transforment" et peuvent être utilisés comme une hormone correctement créée. 8.4 Production dans le périplasme Le but de cette production est de remplacer le peptide signal humain par un peptide signal bactérien. Le périplasme est la région délimitée par la membrane plasmique externe et interne. Pour information, la membrane externe des bactéries Gram négatives est plus perméable à l eau que la membrane plasmique. Les protéines sécrétée par la bactérie vont passer la membrane plasmique à travers un port protéique (ou tunnel protéinique) qui s appelle le translocon. Rappelons que les protéines sécrétées dans le périplasme ont un peptide signal constitué d une vingtaine

65 8.4. PRODUCTION DANS LE PÉRIPLASME 65 d acides aminés hydrophobes en N-Terminus. Ce même peptide signal est éliminé à l entrée dans le périplasme (après translocation). Pourquoi alors avoir remplacé une production cytoplasmique par une production périplasmique? La réponse est la suivante : en changeant le peptide signal humain par un de type bactérien, la sécrétion est optimisée. Le peptide signal bactérien possède, contrairement à l humain, 23 acides aminés (contre 26). Dès lors, la protéine recombinée est formée non plus de 192 acides aminés mais de 191 acides aminés! comme au naturel. En fait, l hormone de croissance n a que 191acides aminés, car il n est plus nécessaire de rajouter le codon start vu qu il se trouve déjà dans le peptide signal bactérien. La "préhormone recombinante" produite dans le périplasme a donc 214 acides aminés (les 23 du peptide signal bactérien et les 191 acides aminés de l hormone mature naturelle) Libération hors du périplasme Afin de libérer une protéine recombinante hors du périplasme, il est nécessaire de faire deux chocs osmotiques (un choc hypertonique et un choc hypotonique). Le choc hypertonique a pour but de vider l eau ; cette étape est importante pour intensifier la réaction lors du prochain choc. Lors du choc hypotonique, l eau revient rapidement et massivement dans l espace périplasmique, créant un effet tsunami. Cette effet a pour but de faire exploser la couche externe (qui est plus perméable à l eau que la couche interne, E. Coli étant une bactérie Gram Négatives). Ainsi, seules les protéines présentes dans le périplasme sont évacuées, tandis que celle dans le cytoplasme restent bien sagement à leur place. On évite ainsi d obtenir trop de protéines (pour comparaison, seules 100 protéines différentes sont libérées, contre 3000 si l on avait préféré l explosion de la bactérie (membrane interne et externe comprises)) Résumé Une hormone de croissance humaine recombinante existe sous deux formes. Une forme 192-r-hu-Met-GH, produite dans le cytoplasme, que l on nomme somatrem et une forme 191-r-hu-GH sécrétée dans le périplasme que l on nomme somatropine. Notez que le Met n est plus présent dans la seconde forme. L hormone de croissance a longtemps été prélevée de l hypophyse des cadavres et purifiée. Cependant, depuis l aube de la biotechnologie, il n est plus nécessaire de procéder de cette manière. De plus, la maladie dite de Creutzfeld-Jakob (une vairante de la vache folle) est due à l injection d hormone de croissance non-recombinante, prélevée des cadavres.

66 66 CHAPITRE 8. BIOTECHNOLOGIE 8.5 Biotechnologie et société Maintenant que l on sait comment créer l hormone de croissance industriellement, à qui va-t-on devoir la prescrire? Certaines personnes souffrant de déficience idiopathique isolée en hormone de croissance 4 ont besoin de cette hormone de croissance. Les personnes souffrant d un nanisme hypophysaire (nanisme proportionné et harmonieux), cependant, n ont aucune utilité à recevoir l hormone de croissance. En fait, le récepteur pour l hormone de croissance n est pas exprimé dans une telle maladie. De même que pour les achondroplases, ayant une mutation sur FGFR3, l hormone de croissance leur serait inutile. On notera que l achondroplasie est un nanisme disproportionné. D autres personnes souffrent de ce que l on appelle l acromégalie. Cette maladie se caractérise par une surproduction d hormone de croissance commençant à l âge adulte. Les mains, les pieds et la mâchoire grandissent, mais la taille reste fixe. Cependant, le rapport 20 kda/22 kda n est pas diminué pour autant, n induisant de ce fait aucune confusion avec un quelconque dopage. L acromégalie est due à un adénome de l hypophyse, c est-à-dire à une tumeur bénigne de la glande Hormones de croissance et isoformes Deux isoformes de l hormone de croissance sont générées par épissage alternatif. L hormone de croissance recombinante vendue est l isoforme 22 kda (22 kilodalton) pure, c est-à-dire que seule le cdna codant l isoforme 22 kda a été introduit dans E. Coli. Dans notre corps, nous avons environ 90% d isoforme 22 kda et 10% d isoforme 20 kda. L hormone de croissance est sécrétée par pics, 5 à 6 pour la forme 22kDA, à raison de 1 à 5 µg/l, tandis que l isoforme 20 kda, bien que sécrétée de la même manière, n atteint jamais un pic de plus de 2.5 µg/l. Lorsque des personnes se dopent (donc avec l isoforme 22 kda), l hypophyse décide de prendre des vacances et donc l isoforme 20 kda n est plus sécrétée. Ainsi lorsque moins de 1% de la GH (Growth Hormone, ou Hormone de Croissance) totale est l isoforme de 20 kda, on peut être assuré d un dopage. Les tests de dopage se font avec l analyse du sang de la personne et sont positifs pendant 24 heures après une injection unique. 4. Idiopathique signifie inexpliquée, et isolée signifie que seule la production d hormone de croissance est diminuée.

67 Chapitre 9 Génétique mendelienne La génétique mendelienne est un sujet vaste qui nous demanderait beaucoup de temps. Nous citerons dans ce chapitre quelques exemples qui illustrent les grandes lignes de cette génétique. Pour commencer, nous allons vous présenter quelques généralités. 9.1 Généralités sur les Erythrocytes Les érythrocytes, plus communément appelés globules rouges, sont des cellules essentielles à notre corps. Chez les mammifères, c est une cellule anucléée (dépourvue de noyau donc incapable de se diviser), dont le cytoplasme est riche en hémoglobine mais pauvre en organites, assurant ainsi le transport du dioxygène (O 2 ), ce à l aide de l atome de Fer présent dans la protéine. Sur leur membrane peut se trouver la protéine transmembranaire RhD. Si les érythrocytes d une telle personne possèdent cette caractéristique, on dira d elle qu elle est Rhésus Positif, sinon elle est dite Rhésus Négatif. Le terme de Rhésus provient d expériences faites sur le Macaque Rhésus (déjà appelé avant comme cela!) par Karl Landsteiner et Alexander Solomon Wiener dans les années On peut observer les protéines transmembranaires après enlèvement du feuillet externe de la membrane par cryofracture (c est-à-dire que l on va "geler" la cellule pour la "dépecer" plus simplement) Facteur Rhésus Le facteur Rhésus se manifeste suivant l expression du gène RhD qui code les protéines transmembranaires. Ce gène est constitué de 10 exons. Chez tous les individus Rh-Négatif Caucasiens (i.e. Européens), le gène RhD est entièrement délité, ce qui veut dire que ce 67

68 68 CHAPITRE 9. GÉNÉTIQUE MENDELIENNE gène n existe pas. Cela nous amène à poser ce que l on appelle une homogénéité génétique. Nous reviendrons en détail sur ce terme dans la suite du cours. On aperçoit également que les Rh-Négatif non-caucasiens portent une délétion du gène, mais pas aussi importante que pour les Caucasiens. Cela amène donc une hétérogénéité. La figure suivante montre le cas d un Caucasien RhD-positif, d un Caucasien RhD-Négatif et d un non-caucasien RhD-Négatif. Les mutations indiquées sont des mutations non-sens (nonsense mutation), et des mutations faux-sens (missense mutations). Une mutation faux-sens est caractérisée par son action locale (réduite à un acide aminé) qui n a pas un grand effet sur la protéine codée (cependant, les conséquences sont variables suivant la position de l acide aminé touché. En début et fin de séquence, la mutation cause moins de dégâts que si elle était présente au milieu de la chaîne). Une mutation non-sens, elle, se caractérise par un effet important sur la protéine fabriquée, en général non-fonctionnelle. Pour plus de détails sur le facteur Rhésus, veuillez vous référer au support du cours présent sur le Moodle concernant le Facteur Rhésus. Vous y trouverez également des détails importants sur l Equilibre de Hardy-Weinberg. Nous avons estimé que ce support de cours était très bien et qu il y avait peu à rajouter. Les détails sur le mode de transmission héréditaire du gène RhD est également expliqué dans ce pdf. Nous vous recommandons vivement de le lire Homogénéité génétique Pourquoi les Européens rhésus négatifs présentent-ils tous une délétion du gène RhD? Une telle mutation est causée par un effet de fondateur, c est-à-dire que tous les Caucasiens RhD-Négatifs descendent de la même personne où cette délétion s est produite une fois et il y a très longtemps. Structure du RhD RhD est une protéine transmembranaire, c est-à-dire qu elle passe à travers la membrane plasmique du globule rouge. En l occurrence, elle la traverse 12 fois. On appelle domaine transmembranaire, le domaine situé dans la double couche de phospholipides que RhD traverse. Duplication du gène RhCE Sur le génome d une souris, on retrouve un unique gène RH. Cependant chez l humain, on peut trouver deux gènes RH : RhCE et RhD. Chez les RhD-Positifs, il y a la présence du RhCE et du RhD, alors que chez les RhD-Négatifs, le RhD n est pas présent comme

69 9.1. GÉNÉRALITÉS SUR LES ERYTHROCYTES 69 nous l avons vu auparavant. Cela signifie qu à un moment, il y a eu une duplication du gène RhCE qui a ensuite donné "naissance" au gène RhD. Cette duplication est représentée sur la figure suivante : L appartenance familiale Deux caractéristiques indiquant l appartenance à la même famille sont les suivants : 1. Les gènes ont le même nombre d exons 2. Les protéines ont le même nombre de domaines transmembranaires Dans le cas de la famille Rh, il y a 10 exons et 12 domaines TM. Un autre exemple d homogénéité génétique que le Rhésus négatif et l effet fondateur est la mutation récurrente chez les achondroplases. Nous vous renvoyons également au support du cours PDF qui traite également de ce sujet plus en détail.

70 70 CHAPITRE 9. GÉNÉTIQUE MENDELIENNE

71 Chapitre 10 L étude des microsatellites 10.1 Introduction Lors d une non-disjonction des chromosomes en méiose I, des anomalies chromosomiques peuvent apparaître (monosomies ou trisomies). L une des plus connues de ces anomalies est la trisomie 21, ou syndrome de Down. Cette trisomie est une trisomie sur les autosomes, c est-à-dire sur les chromosomes 1 à 22. Il y a également d autres trisomies ayant lieu sur les hétérosomes (chromosome 23). La trisomie 21 se caractérise par une déficience intellectuelle, une malformation cardiaque et une plus forte exposition aux leucémies. La fréquence est de 1/700 malades en moyenne ; néanmoins cette fréquence varie suivant l âge des parents. Aux alentours des 50 ans, il y a 1/12 d avoir un enfant atteint de cette maladie, contre 1/2000 à l âge de 20 ans. D autres trisomies existent, comme la trisomie 18 (ou syndrome d Edwards) et la trisomie 13 (syndrome de Patau) qui sont néanmoins plus rares mais également plus fatales. Les trisomies pouvant avoir lieu les hétérosomes sont les trisomies XXX (asymptomatique), XXY (sydnrome de Klinefelter), XYY (également asymptomatique) ou la monosomie X 0, dit Syndrome de Turner. Dans le cas de la trisomie 21, soit l ovocyte est disomique pour le chromosome 21 (c est-à-dire qu il contient non pas un chromosome, mais deux), soit le spermatozoïde est disomique pour le même chromosome. Un gamète (ovocyte ou spermatozoïde) est dit nullisomique pour un certain chromosome s il ne contient pas ce dernier. Il est dit monosomique s il est normal. 71

72 72 CHAPITRE 10. L ÉTUDE DES MICROSATELLITES Disomie uniparentale Deux événements de non-disjonction se compensent. C est-à-dire qu un ovocyte nullisomique et un spermatozoïde disomique pour le même chromosome ne créeront pas de maladie. Par exemple, la figure suivante vous présente un cas de disomie uniparentale dans le cas du chromosome 2 : Une question subsiste : comment alors déterminer l origine parentale des chromosomes? 10.2 L étude des microsatellites Lors de la réplication de l ADN, nous avons vu que la copie n est pas parfaitement identique à l original. Les ADN polymérases connaissent des problèmes de copie (environ 1 toutes les 10 9 ). Cependant, il existe des séquences répétitives en tandem que l on nomme microsatellites. Un exemple de microsatellite est (GATA) 12 comme nous pouvons le voir sur la figure suivante. (GATA) 12 signifie qu il y a une séquence (GATA) répétée 12 fois. Chaque personne normale possède une paire de chromosome. Chez de nombreux organismes (appelés diploïde), chaque gène est représenté à deux exemplaires (appelés allèles). Ces allèles se trouvent au même endroit (appelé locus) sur deux chromosomes homologues (i.e. de la même paire). Les deux allèles d un gène peuvent être identiques ou présenter des différences.