THÈSE. Aurélien HABRIOUX PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DE NANOPARTICULES À BASE D OR ET DE PLATINE POUR L ANODE D UNE BIOPILE GLUCOSE/DIOXYGÈNE

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1 THÈSE Pour l obtention du Grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITÉ DE POITIERS (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National Arrêté du 7 août 2006) École Doctorale : Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique Secteur de recherche : Chimie Théorique, Physique, Analytique Présentée par : Aurélien HABRIOUX **************** PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DE NANOPARTICULES À BASE D OR ET DE PLATINE POUR L ANODE D UNE BIOPILE GLUCOSE/DIOXYGÈNE **************** Directeurs de Thèse : Boniface KOKOH, Professeur Karine SERVAT, Maître de Conférences **************** Soutenue le 12 octobre 2009 **************** Jury M. G. JERKIEWICZ, Professeur Rapporteur (Queen s University (Kingston) Canada) M. D. LEECH, Professeur Rapporteur (National University of Ireland (Galway) Irlande) Mme R. BASSEGUY, Directrice de Recherches au CNRS (Université Paul Sabatier de Toulouse) Examinatrice M. T. GIRARDEAU, Professeur Examinateur (Université de Poitiers) Mme S. TINGRY, Chargée de Recherches au CNRS (Institut Européen des Membranes de Montpellier) Mme K. SERVAT, Maître de Conférences (Université de Poitiers) Examinatrice Examinatrice M. B. KOKOH, Professeur Examinateur (Université de Poitiers) M. J-M. LEGER, Directeur de Recherches au CNRS Examinateur (Université de Poitiers)

2 Je voudrais en premier lieu remercier les Professeurs Jerkiewicz et Leech à la fois pour avoir accepté de juger ce travail et pour le long déplacement qu ils ont du effectuer pour assister à la soutenance. Je remercie également Madame Régine Basséguy (Directrice de recherches au CNRS), Madame Sophie Tingry (Chargée de recherches au CNRS), Monsieur Jean-Michel Léger (Directeur de recherches au CNRS) et Monsieur Thierry Girardeau pour avoir accepté d être examinateurs lors de la soutenance de thèse. Dans un second temps je voudrais remercier Monsieur Boniface Kokoh (Professeur) pour les conseils qu il m a prodigué et je tiens à saluer les connaissances dont il fait preuve en chimie des sucres et en électrocatalyse d une manière plus générale. Je souhaite également associer à la réussite de ce travail Madame Karine Servat (Maître de Conférences) dont les connaissances en catalyse enzymatique, conception d électrodes enzymatiques et électrochimie m ont fortement aidé lors de ces trois années. Je souhaite également adresser mes remerciements à Messieurs Teko Napporn (Chargé de recherches au CNRS), Stève Baranton (Maître de conférences), Christophe Coutanceau (Professeur) et Nicolas Alonso-Vante (Professeur) avec qui les discussions scientifiques ont été pour le moins fructueuses et je souhaite également saluer leur disponibilité au sein du laboratoire. Je souhaite également remercier Monsieur Jean-Christophe Guillon, toujours disponible et prêt à aider les étudiants. Enfin, j aimerais adresser un grand merci à tout mes collègues «thésards» Cédric, Rémy, Martin, Mario, Patrick, Babette, Nourjane et Sylvain qui ont partagé tout ou partie de ces trois années avec moi et avec qui j ai passé de très bons moments. Je tiens également à remercier Monsieur Hervé Huser (Maître de conférences) m ayant permis de m initier à l enseignement au cours de cette thèse. Je tiens également à remercier le personnel de l IEM et en particulier Géraldine Merle, Sophie Tingry et Christophe Innocent qui m ont très bien accueilli au cours du stage de 2 mois que j ai effectué dans leur laboratoire. 1

3 Enfin, ce travail de thèse n aurait pas pu être effectué de la même façon si Claude Rouvier (Souffleur de verre) et Michel Chauveau n avaient pas fortement contribué à la réalisation de pièces pour les montages que j ai utilisés. Je voudrais enfin associer à cette thèse mon épouse, Vanessa, qui m a soutenu tout au long de ces trois années. 2

4 SOMMAIRE INTRODUCTION... 8 CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE I.1. La biopile glucose/o I.1.1. Historique et principe des piles à combustible basse température I.1.2 La biopile glucose/o I.2. Oxydation du glucose I.2.1 Oxydation du glucose catalysée par des nanoparticules de métaux nobles I Synthèse de nanomatériaux I La synthèse «water-in-oil microemulsion» I Synthèse de nanoparticule d or par la méthode de Slot I.2.2. Oxydation du D-glucose sur des métaux nobles I Oxydation du glucose sur l or I Oxydation du glucose sur le platine I Oxydation du glucose sur des nanomatériaux or-platine I.2.3 Techniques d immobilisation enzymatique et transfert électronique entre enzymes et électrodes I Techniques d immobilisation d enzymes à la surface d une électrode solide I Transfert électronique entre enzyme et médiateur et théorie de Marcus I.2.4. Oxydation du glucose catalysée par des enzymes I Oxydation du glucose catalysée par la GDH I Oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydase I.3 Réduction du dioxygène catalysée par des enzymes I.3.1 Réduction du dioxygène catalysée par la laccase (EC ) I.3.2 Réduction du dioxygène catalysée par la bilirubine oxydase (EC ) I.4 Conclusions et stratégie

5 CHAPITRE II : PARTIE EXPÉRIMENTALE II.1 Nettoyage de la verrerie II.2 Synthèse des nanoparticules Au et Au-Pt II.2.1 Synthèse des nanoparticules Au-Pt par méthode «water-in-oil microemulsion» II.2.3 Synthèse de nanoparticules d or par la méthode de Slot II.2.4 Préparation et dépôt des encres catalytiques II.3 Techniques électrochimiques II.3.1 Méthodes de caractérisation électrochimique II La voltammétrie cyclique à variation linéaire de potentiel II La spectroscopie infrarouge de réflexion in situ à transformée de Fourier II Test en pile II.4 Caractérisation physique des catalyseurs synthétisés II.4.1 La diffraction des rayons X en transmission II.4.2 La microscopie électronique en transmission II.4.3 La spectroscopie de dispersion d énergie des rayons X II.4.4 L analyse thermique différentielle et gravimétrique II.4.5 Spectrophotométrie UV-visible II.4.7 Conclusion CHAPITRE III : SYNTHÈSE ET CARACTÉRISATION DES NANOMATÉRIAUX OR-PLATINE III.1 Caractérisation physique des nanoparticules d or-platine III.1.1 Etude du paramètre de maille des catalyseurs bimétalliques Au-Pt III.1.2 Etude des défauts cristallins présents dans les nanoparticules Au-Pt III Simulation des diffractogrammes III Interprétation des grandeurs calculées III Observation METHR des nanoparticules de platine

6 III Observation METHR des nanoparticules de composition nominale Au 70 Pt 30, Au 80 Pt 20 et Au III Taille des particules et dispersion III.2. Composition chimique des nanoparticules III.2.1 Composition chimique volumique d un échantillon III.2.2 Composition de surface des nanoparticules Au-Pt III Etude voltammétrique III Mise en évidence des structures de type cœur-coquille III Autres méthodes de quantification de la surface active de platine dans les catalyseurs bimétalliques Au-Pt III.3 Mise en évidence d une structure alliée Au-Pt III.4 Conclusion CHAPITRE IV : OXYDATION ENZYMATIQUE ET NON-ENZYMATIQUE DE LA MOLÉCULE DE D-(+)-GLUCOSE IV.I. Oxydation du D-(+)-glucose catalysée par la glucose oxydase IV.1.1 Présentation du médiateur électrochimique utilisé IV.1.2 Réalisation d électrodes GOD/HQS en vue de leur application dans une biopile glucose/o IV Méthodes d immobilisation de l enzyme IV Immobilisation de l enzyme et du médiateur par adsorption IV Immobilisation de la GOD par greffage covalent IV.2. Oxydation du glucose sur nanocatalyseurs bimétalliques Au-Pt IV.2.1. Influence de la composition du catalyseur. Etude de l oxydation du D-(+)-glucose en milieu NaOH 0,1 M (ph 12,8) IV Corrélation entre composition de surface et allure des voltammogrammes IV Effet du taux de charge du catalyseur IV Allure des voltammogrammes

7 IV Etude chronoampérométrique IV Effet de la température sur l oxydation du D-(+)-glucose IV Effet de la concentration en D-(+)-glucose IV.3. Conclusion du chapitre IV CHAPITRE V : RÉDUCTION ENZYMATIQUE DU DIOXYGÈNE DISSOUS ET RÉALISATION D UNE BIOPILE GLUCOSE/O V.1 Réduction du dioxygène catalysée par la BOD V.1.1 Etude voltammétrique de l acide 2,2 -azinobis-3-ethylbenzothiazoline-5-sulfonique (ABTS) V.1.2 Immobilisation de l enzyme et du médiateur dans une matrice de polypyrrole V Effet de l épaisseur du film de polypyrrole V Effet de la réticulation du film de polypyrrole V Stabilité des électrodes réalisées par immobilisation de l enzyme et du médiateur dans une matrice de polypyrrole V.1.3. Immobilisation de la BOD par greffage covalent V Effet de la longueur de l espaceur V Stabilité des électrodes BOD/ABTS préparées par greffage covalent de l enzyme 141 V.1.4. Immobilisation du système BOD/ABTS dans une matrice de Nafion V La méthode d immobilisation employée V Caractérisation électrochimique des bioélectrodes V Intérêt de l EDT V Etude des performances électrochimiques des biocathodes BOD/ABTS V.2. Réalisation de biopiles glucose/o V.2.1 Etude des biopiles glucose/o 2 utilisant uniquement des enzymes comme catalyseurs V Tests en pile réalisés avec des électrodes élaborées par adsorption des enzymes et des médiateurs à la surface des tubes carbonés puis immobilisation du système enzyme/médiateur dans une matrice de polypyrrole

8 V Tests en pile réalisés avec des électrodes préparées par greffage covalent des enzymes à la surface des tubes carbonés V.2.2 Etude des biopiles glucose/o 2 utilisant des nanoparticules Au-Pt et le système BOD/ABTS comme catalyseurs V.3. Conclusion du chapitre V CONCLUSION GÉNÉRALE RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

9 INTRODUCTION 8

10 Ces dernières années de nombreuses études ont été menées sur le développement de nouveaux systèmes de conversion d énergie tels que les batteries primaires au lithium et les piles à combustible. Pour permettre un approvisionnement en énergie de dispositifs implantables, sans qu une recharge extérieure en combustible soit nécessaire, et sans nécessité de changer régulièrement les batteries, la pile à combustible glucose/oxygène constitue une voie très prometteuse. Bien que d autres molécules telles que le méthanol et l éthanol aient énormément été étudiées, le glucose reste le combustible idéal pour des applications médicales : il est un sucre du sang, non toxique et très disponible car issu de la biomasse. Le développement d une telle technologie de pile dans laquelle le combustible est le glucose et le comburant, l oxygène moléculaire, permettrait une avancée majeure dans la détection du diabète, l alimentation de pacemakers et celle d appareils auditifs, oculaires Par définition, une biopile est une pile à combustible dont une au moins des électrodes est d origine biologique. Ainsi, les études sur les biopiles font apparaître trois types de piles à combustible : - la biopile à catalyseurs bactériens : c est la pile microbienne ou Microbial Fuel Cell (MFC). Dans ce type de pile, les catalyseurs biologiques utilisés sont des enzymes qui peuvent exercer leur activité catalytique à l intérieur du micro-organisme. Le transfert électronique a lieu entre le micro-organisme et la surface de l électrode. - la biopile à combustible dans laquelle les deux catalyseurs sont enzymatiques. (BFC). Ces deux types de biopiles (MFC et BFC) mettent en application les concepts développés dans les domaines des biocapteurs et de la biocatalyse d une manière générale. L intérêt d utiliser des catalyseurs enzymatiques réside dans leur capacité à oxyder ou réduire des molécules organiques de manière spécifique. Le second intérêt des catalyseurs enzymatiques est d exploiter leurs performances catalytiques à basse température dans des milieux électrolytiques de type physiologique. Dans le cas des biopiles enzymatiques, deux problèmes sont à résoudre pour permettre le développement de ces sources d énergie. La première étape consiste à augmenter la puissance des biopiles actuelles en améliorant les techniques d immobilisation d enzyme, en modifiant la structure chimique des enzymes utilisées ou bien encore en substituant ces molécules par d autres catalyseurs. - la biopile hybride issue de la combinaison d un catalyseur abiotique (électrode métallique ou bioinspirée, par exemple) et d un catalyseur enzymatique. 9

11 La dernière catégorie constitue notre projet d étude dans ce travail. Récemment l utilisation de nanomatériaux a permis d augmenter très fortement les surfaces d électrodes permettant ainsi l augmentation des performances des biopiles. La mise au point de nouvelles techniques d immobilisation est en outre à l origine de l amélioration de la stabilité (actuellement de quelques jours) des performances obtenues, ce qui constitue le second défi scientifique pour le développement des biopiles. La problématique peut alors se résumer en deux mots que sont performance et stabilité. Au cours de cette thèse, nous étudierons uniquement la biopile glucose/o 2 qui constituera l application des études menées. Cette source d énergie peut trouver des applications dans le domaine de la nanorobotique ou bien encore dans le domaine médical, de par son caractère implantable. Pour ce type d applications, des enzymes appartenant à la classe des «multicopper oxidase» sont utilisées pour catalyser la réduction du dioxygène. L intérêt de telles enzymes réside dans leur faculté à réduire le dioxygène en eau sans produire de peroxyde d hydrogène au cours du processus catalytique. La glucose oxydase (parfois substituée par la glucose déshydrogénase) est quant à elle classiquement utilisée pour catalyser l oxydation du glucose en acide gluconique. Cependant les performances de la glucose oxydase sont inhibées en présence d oxygène. Cela est dû à la formation de peroxyde d hydrogène lors du processus catalytique d oxydation du glucose. Pour cette raison, le travail qui suit consistera en une étude de nouveaux catalyseurs métalliques électroactifs vis-à-vis de l oxydation du glucose. Ces catalyseurs permettent aussi d augmenter les performances de biopiles glucose/o 2. Cette étude va donc s appuyer sur les travaux précédemment réalisés dans le domaine des biopiles classiques et des piles à combustible, le but étant de concilier le meilleur du savoir-faire dans le domaine des biopiles avec celui des piles à combustible dont le laboratoire a l expertise. Les matériaux métalliques utilisés pour constituer l anode de la biopile sont le platine et l or, ce qui permet de maintenir la biocompatibilité de l application. Ce choix de matériaux s appuie également sur des études précédemment réalisées dans le domaine de l électrosynthèse organique qui ont montré que le platine permet l oxydation de la molécule de glucose à très bas potentiel, i.e. inférieur à 0,4 V vs. ERH et que l or présente une bonne activité en ce qui concerne l oxydation des composés hemiacétaliques. Des matériaux bimétalliques de type or-platine seront donc synthétisés dans le but d allier les propriétés catalytiques de ces deux métaux. Ils seront synthétisés sous forme de nanoparticules afin de diminuer les quantités de matière utilisées tout en augmentant la surface électroactive des électrodes. Le deuxième intérêt d utiliser 10

12 ces catalyseurs abiotiques sous forme nanodivisée réside dans la possibilité d exploiter les effets catalytiques singuliers observés sur des catalyseurs de taille nanométrique. Dans un premier temps différentes compositions de catalyseurs bimétalliques seront étudiées afin de déterminer électrochimiquement celles présentant le meilleur effet de composition dans l activation du glucose. De plus il faut noter que la performance d un matériau dans une activation catalytique est étroitement liée à sa structure cristalline, sa morphologie, à la distribution des sites actifs, le niveau d énergie de la bande de valence des matériaux utilisés et donc à l interaction entre sa surface et la molécule électroréactive. Pour ce faire, la compréhension de la structure et des défauts présentés par les différents matériaux synthétisés a semblé nécessaire au cours de cette thèse. A cette fin, les différents matériaux bimétalliques ont été caractérisés par des méthodes physiques. Nous avons aussi développé de nouvelles techniques d immobilisation d enzymes (glucose oxydase et bilirubine oxydase) à la surface d électrodes afin d augmenter les performances des électrodes enzymatiques. Enfin nous avons conçu deux types de biopiles glucose/o 2 possédant un design innovant, concentrique, sans membrane. Tout d abord nous présenterons les résultats obtenus avec la biopile «hybride» dont l anode est constituée de nanoparticules or-platine et la cathode, la bilirubine oxydase. Enfin nous présenterons une application avec des catalyseurs enzymatiques où l oxydation du glucose sera catalysée par la glucose oxydase et la réduction du dioxygène par la bilirubine oxydase. 11

13 CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE 12

14 I.1. La biopile glucose/o 2 Le but de cette première partie est de comprendre les différences observées entre les piles à combustible classiques et la biopile glucose/o 2. La discussion sera bien évidemment orientée sur les puissances obtenues avec les deux systèmes mais aussi sur les différences de conception. I.1.1. Historique et principe des piles à combustible basse température Le concept de la pile à combustible fut développé par W. Grove [1] au XIX ème siècle. Après avoir étudié l électrolyse de l eau, il eut l idée d inverser ce processus afin de produire de l énergie électrique. En effet, il imagina convertir directement l énergie chimique de combustion du dihydrogène en énergie électrique. Plus tard, au cours du XX ème siècle, la technologie «pile à combustible» fut développée et utilisée pour alimenter des systèmes nécessitant de grandes densités de puissance. C est dans ce cadre que la NASA (National Aeronautics and Space Administration) développa, au cours des années soixante, des piles servant de source d énergie dans les navettes spatiales du programme APOLLO destinées à l exploration lunaire. Les recherches effectuées ont abouti à une classification des piles à combustible en cinq grandes familles selon la puissance qu elles sont capables de délivrer (Tableau 1). Types de piles à combustible Piles à acide phosphorique (PAFC) Piles à carbonate fondu (MCFC) Piles alcalines (AFC) Piles à oxyde solide (SOFC) Piles à membrane échangeuse de protons (PEMFC) Puissance potentiellement accessible 10 MW 1 MW 100 kw 100 kw 50 kw Tableau 1 : Puissance potentiellement délivrable par les différents types de piles à combustible. Plus récemment l industrie automobile s est lancée dans le développement de prototypes utilisant uniquement le dihydrogène comme source d énergie afin de proposer des véhicules ne produisant que peu ou pas de polluants, ni de gaz à effet de serre. Dans ces PEMFC, deux 13

15 électrodes de métaux nobles (métaux dispersés sur un poudre carbonée) séparées par une membrane échangeuse de protons sont utilisées. L anode est le siège de l oxydation du combustible (dihydrogène) et à la cathode se produit la réduction du comburant (dioxygène). Les protons produits à l anode traversent la membrane échangeuse d ions pour réagir le dioxygène qui subira une réduction. Le second intérêt de la membrane est de prévenir un éventuel «crossover» du combustible et/ou du comburant d un compartiment vers l autre. Les électrons passent par le circuit électrique externe (Figure 1). Figure 1: Schéma de principe d une PEMFC D autres systèmes utilisant d autres combustibles (éthanol, méthanol, diméthoxyméthane ) ont été développés. Cependant, la température de fonctionnement de la plupart des piles à combustible (PAFC, SOFC, MCFC) rend ces systèmes inexploitables pour des applications portables. De plus, il semble difficile d utiliser les PEMFC pour des applications potentiellement implantables et de taille micrométrique du fait de la difficulté à miniaturiser ces systèmes et de la nature des combustibles utilisés (dihydrogène, méthanol ). En effet, il est difficile de réduire la taille d éléments tels que la membrane ou le réservoir de combustible [2]. Il a donc été nécessaire de développer un nouveau convertisseur d énergie capable d alimenter ces microsystèmes. Parmi ces nouvelles piles à combustible, nous pouvons citer les piles utilisant des catalyseurs d origine 14

16 biologique. Ces piles opèrent dans des conditions de ph plus ou moins proche de celui des milieux physiologiques et utilisent des combustibles issus de la biomasse tels que le glucose et l éthanol. Ces nouveaux convertisseurs d énergie portent le nom de biopiles. Cette dénomination peut être attribuée à toute pile à combustible utilisant au moins un catalyseur d origine biologique. I.1.2 La biopile glucose/o 2 L étude des biopiles glucose/o 2 est en plein essor comme en témoigne la figure 2 qui présente le nombre d articles recensés ces dernières années Nombre de publications Année Figure 2: Nombre d'articles recensés concernant l'étude des biopiles glucose/o 2 au cours de ces dix dernières années. Souce INIST. L objet des premières études réalisées sur les biopiles glucose/o 2 ne correspond plus aux objectifs visés actuellement. En effet les études menées dans les années 60 visaient le développement d un nouveau convertisseur d énergie pouvant alimenter les stimulateurs cardiaques ou bien encore les appareils de stimulation nerveuse. Il a cependant rapidement été 15

17 montré que les puissances obtenues avec des catalyseurs enzymatiques ainsi que la durée de vie de ces piles [2] étaient telles qu il était impossible de faire rivaliser la biopile glucose/o 2 avec des batteries Li/ion (alimentant les pacemakers) ou Li/SOCl 2 (alimentant les appareils de stimulation nerveuse). A titre d exemple, les batteries Li/ion classiquement utilisées délivrent 1 µw pendant dix ans [3]. Une biopile glucose/o 2 ne peut fournir une telle énergie que pendant quatre jours [4]. Un autre objectif de ces biopiles développées dans les années 80, était de produire des convertisseurs d énergie «propres» [2]. Seulement les densités de puissance obtenues étaient mille fois inférieures à celles des générateurs conventionnels. Aujourd hui, les travaux scientifiques sur les biopiles glucose/o 2 se font selon trois objectifs [4] : - développer des biopiles microbiennes (commencé depuis la fin des années 1950) utilisant des carbohydrates comme combustibles. Le fonctionnement de ce type de piles met en jeu une cascade de réactions enzymatiques à l intérieur du microorganisme. Lors des premières études, l utilisation de médiateurs redox permettait le transfert électronique entre le métabolite et l électrode [4]. Au cours des années 2000, une nouvelle étape fut franchie avec la réalisation de transferts directs (sans médiateur externe) entre le micro-organisme et l électrode. Ce type de convertisseur d énergie est principalement développé pour le traitement des eaux usées. Dans la suite de ce travail, nous n étudierons pas ce type de source d énergie. - élaborer des convertisseurs d énergie pouvant être implantées dans des tissus cellulaires ou des vaisseaux sanguins où le glucose et l oxygène sont naturellement présents. Pour ce type d application, la source d énergie doit être miniaturisée. Cela passe par la non-utilisation d une membrane échangeuse d ions, ainsi que par le non-confinement de l électrolyte et des réactifs. Ceci est rendu possible par la connexion d enzymes sélectives, capables d évoluer en milieu physiologique, sur l anode et la cathode [2]. L utilisation d enzymes isolées de leur microorganisme permet de s affranchir des problèmes de diffusion des espèces au travers des membranes cellulaires. - fabriquer des micro-convertisseurs d énergie portables (micropiles) utilisant le glucose comme combustible. Dans ce type d applications, il est possible de jouer sur les conditions de fonctionnement de la pile (ph, concentration des réactifs ). Il est également possible d éliminer 16

18 du milieu électrolytique toutes les espèces capables d empoisonner et/ou d inhiber les catalyseurs. En outre, il est possible de s affranchir du critère de spécificité, ce qui permet d utiliser dans un système compartimenté des catalyseurs métalliques offrant des qualités de stabilité supérieures aux enzymes [4-6]. Dans une biopile glucose/o 2 l oxydation totale du glucose peut théoriquement mettre en jeu 24 électrons permettant sa transformation en dioxyde de carbone (CO 2 ) selon la réaction suivante : C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO H 2 O Cependant cette oxydation directe n a jamais été observée [5, 6]. En général l oxydation du glucose conduit à la formation d acide gluconique quelle que soit la nature du catalyseur utilisé (glucose oxydase, glucose déshydrogénase, catalyseurs abiotiques). L oxydation du glucose en gluconolactone se fait selon la réaction suivante : C 6 H 12 O 6 C 6 H 10 O 6 + 2H + + 2e - La réaction ayant lieu à la cathode de la pile est la réduction du dioxygène en H 2 O. Lors de notre étude, cette réaction sera catalysée par une enzyme, la bilirubine oxydase. L équation de la réaction est : ½ O 2 + 2H + + 2e - H 2 O La réaction globale associée au fonctionnement de la pile est donc : C 6 H 12 O 6 + ½ O 2 C 6 H 10 O 6 + H 2 O L enthalpie de Gibbs associée à la réaction globale est r G 0 = -251 kj.mol -1 [6], ce qui permet de calculer la force électromotrice théorique (E 0 ) de la pile à l aide de l équation 1 : (Eq. 1) avec n = 2 le nombre d électrons échangés au cours de la réaction et F la constante de Faraday. Cette relation permet d obtenir une valeur de 1,3 V [6] pour E 0. De plus, lorsque la pile débite un 17

19 courant d intensité I, la différence de potentiel E(I) aux bornes de la pile s écarte de la valeur obtenue à l équilibre E eq. Cet écart est dû à deux phénomènes : - Les réactions aux électrodes ont une vitesse finie, ce qui induit l apparition de surtensions. - La résistance de l électrolyte, R e, induit une chute ohmique. Ainsi la grandeur E(I) peut être décrite par l équation 2 : E(I) = E eq - η a - η c - R e I (Eq. 2) avec: η a la surtension anodique et η c la surtension cathodique. Récemment, différentes biopiles glucose/o 2 ont été développées. Le concept que nous examinerons ici à titre d exemple est celui développé dans une série d articles [7-10] par le groupe du Professeur Heller. L innovation consiste en l immobilisation d enzymes dans une matrice électrochimiquement active contenant un complexe d osmium utilisé comme médiateur électrochimique. Les auteurs ont décrit un système opérant dans un milieu de type tampon physiologique (contenant 140 mm de chlorure de sodium et 20 mm de phosphate) dont le ph est fixé à 7,2 et la température, à 37 C. Cette biopile est constituée de deux fibres en carbone de 7 µm de diamètre recouvertes de l hydrogel redox contenant les enzymes. Pour une concentration en glucose de 15 mm ce système leur a permis d obtenir une densité de puissance de 431 µw.cm -2 pour une tension de cellule de 0,52 V [8]. De plus après une semaine de fonctionnement continu la densité de puissance de cette pile fut encore de 227 µw.cm -2. Mano et col.[9] ont aussi montré que cette pile pouvait être insérée dans un système biologique tout en restant opérationnelle. En effet, en implantant les deux fibres de carbone constituant la biopile dans un grain de raisin (contenant plus de 30 mm de glucose) ils obtiennent une densité de puissance dépendant de la profondeur d implantation dans le grain. Au centre du grain, la densité de puissance est seulement de 47 µw.cm -2 alors qu elle est de 240 µw.cm -2 lorsque les fibres sont insérées à la proximité de la peau du grain de raisin. Ceci est expliqué par des différences de concentration en oxygène au centre et à la périphérie du grain de raisin. 18

20 I.2. Oxydation du glucose I.2.1 Oxydation du glucose catalysée par des nanoparticules de métaux nobles Les propriétés structurales (taille des particules, composition de surface, défauts cristallins) et catalytiques de nanomatériaux sont bien évidemment extrêmement dépendantes des matériaux utilisés mais aussi de la méthode avec laquelle ils ont été synthétisés. Dans cette partie, nous examinerons la synthèse dite «water-in-oil microemulsion» et la méthode dite de Slot, synthèses que nous utiliserons au cours de ce travail. Nous nous restreindrons à ces deux méthodes car elles présentent l avantage d être des méthodes «à froid» qui ne nécessitent pas la mise en place d une étape de calcination après la réduction des sels précurseurs. D autre part dans le cas de la synthèse des nanoparticules Au-Pt, la réduction des sels métalliques à température modérée permet d éviter tout phénomène de migration des atomes d or vers la surface des particules et ainsi d éviter tout enrichissement de la surface des particules en or. I Synthèse de nanomatériaux I La synthèse «water-in-oil microemulsion» Le terme microémulsion peut être défini comme une fine émulsion obtenue par agitation de deux liquides non-miscibles dont la stabilité thermodynamique est assurée par la présence d un tensioactif. Selon Capek [11], lorsque la concentration en tensioactif dépasse la concentration micellaire critique, les molécules de tensioactif forment des micelles inverses (Figure 3) permettant la «solubilisation» de composés hydrophiles dans la phase organique. Il y a stabilisation de nanogouttes d eau dans la phase organique. A plus faible concentration en tensioactif la formation de micelles permettant la solubilisation de composés lipophiles est observée [12]. Dans le premier cas, le mélange de deux microémulsions, l une contenant un agent réducteur dans sa phase aqueuse et l autre ayant dans sa phase aqueuse un ou plusieurs sels précurseurs, permet par collision des gouttelettes d eau, la formation de nanoparticules 19

21 métalliques au sein de micelles inverses (Figure 3). La première synthèse de nanoparticules de platine, par cette méthode, a été ainsi réalisée en 1982 par Boutonnet et col. [13]. Micelle directe Micelle inverse Figure 3 : Formation de nanoparticules métalliques par la méthode «water in oil microemulsion» [11] (à gauche) et représentation schématique d une micelle directe et d une micelle inverse (à droite) Les processus de nucléation et de croissance des nanoparticules sont réalisés au sein des micelles. Il paraît donc évident que les propriétés de la micelle vont conditionner les propriétés des nanoparticules. Pour expliquer les mécanismes de formation des nanoparticules dans les microémulsions, deux modèles ont été supposés [14]. Le premier est basé sur le diagramme de LaMer [15] représentant la concentration en espèce dissoute en fonction du temps lors de la formation des cristaux. Ce modèle suppose que le premier stade de formation des nanoparticules est la nucléation. Dans un deuxième temps, seule la croissance des nanoparticules aurait lieu. 20

22 Cela suppose que la taille des particules augmente continuellement avec la concentration en sel métallique au sein des micelles. Le second modèle est basé sur la stabilisation thermodynamique des nanoparticules par l intermédiaire du tensioactif. Ce modèle suppose que la taille des particules reste constante lorsque la concentration en sel métallique et la taille des micelles varient. La nucléation continuerait à avoir lieu lors de la croissasnce des particules. Lors d une simulation de la cinétique de la formation des nanoparticules par microémulsion, Tojo et col.[16] montrent l existence de deux mécanismes selon les concentrations en réactif utilisé. Pour des grandes concentrations en réactifs, l étape de nucléation aurait lieu avant l étape de croissance, alors que pour de très faibles concentrations, nucléation et croissance se dérouleraient de manière simultanée. Ils ont également montré que la croissance des particules se fait tout d abord grâce à un effet autocatalytique du noyau existant puis grâce au mécanisme nommé «Ostwald ripening», c est-à-dire par échange de noyaux entre micelles. Dans une revue bibliographique sur la synthèse de matériaux catalytiques par microémulsion, Eriksson et col. [12] identifient les différents paramètres qui affectent la structure des micelles. Par exemple, le ratio eau/tensioactif a un effet considérable sur la taille des micelles. En effet, une augmentation de la quantité d eau induit une augmentation de la taille des micelles. Par contre, une augmentation de la quantité de tensioactif entraîne la formation d un grand nombre de micelles, ce qui implique une diminution de leur taille. La nature du tensioactif utilisé est un autre facteur clé qui détermine la taille des micelles. En effet, l utilisation d un tensioactif ionique tel que le sodium bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate (AOT) peut entraîner des répulsions électrostatiques entre les réactifs contenus dans la micelle et la surface de celle-ci. Ce type d interaction peut engendrer des modifications de concentration locale en réactifs induisant une modification de la vitesse de nucléation. Pour éviter ces inconvénients, il est possible d utiliser un tensioactif non-ionique tel que le Brij 30. Il est, en outre, nécessaire de préciser que la nature du tensioactif et celle de l oléfine utilisée influent sur la flexibilité du film micellaire, déterminante dans la solubilisation de l eau dans le système micellaire [17]. Il est alors possible de jouer sur les échanges intermicellaires. En effet, un film rigide défavorise les échanges intermicellaires. Par contre, l utilisation d un film flexible augmentera la vitesse de la communication intermicellaire [16]. De plus, la nature de l agent réducteur utilisé influe sur la vitesse de l étape de nucléation. Les agents réducteurs les plus communément utilisés sont l hydrazine [13] et le borohydrure de sodium [18]. 21

23 Par le passé, différentes nanoparticules monométalliques [11] (Pt, Pd, Ag, ) et bimétalliques (Pt-Ru [18], Pt-Pd [19], Pt-Au [20] ) ont été synthétisées. Concernant l utilisation de nanoparticules supportées et synthétisées par microémulsion en électrocatalyse, le problème majoritairement rencontré est la séparation des particules et du tensioactif capable de bloquer tout ou partie des sites actifs des particules [12]. Des nettoyages par traitement thermique et chimique [19, 21] ont été entrepris pour résoudre ce problème. Cependant il a été montré que le nettoyage du tensioactif (Brij 30) par traitement thermique conduisait à un frittage des particules et par conséquent, à une perte de surface active des électrocatalyseurs [21]. I Synthèse de nanoparticule d or par la méthode de Slot Une des synthèses de nanoparticules d or est celle proposée par Slot et col. [22]. Les auteurs indiquent, après études par microscopie électronique de plusieurs centaines de nanoparticules sur plusieurs échantillons, que la monodispersion en terme de taille (dans le domaine allant de 3 à 17 nm) des nanoparticules est très supérieure à celle obtenue par d autres méthodes de synthèse. Cette synthèse est basée sur l utilisation de deux solutions : l une contenant un sel d'or, HAuCl 4, l autre contenant de l acide tannique et du citrate de trisodium qui sont deux agents réducteurs. De plus, l acide tannique joue probablement un rôle dans la stabilisation des nanoparticules d or. En effet, il semble que ces dernières «s enroulent» dans la longue chaîne carbonée du tannin. Les auteurs soulignent que les paramètres importants à maîtriser pour synthétiser des nanoparticules de tailles contrôlées, sont le ph, la température et la concentration en acide tannique dans la solution réductrice. Lorsque les deux premiers paramètres sont fixés à des valeurs (7,5 < ph < 8 et température de 60 C) permettant d obtenir une monodispersion de la taille des nanoparticules, le seul paramètre permettant de moduler cette dernière dans le domaine 3-17 nm est la concentration en acide tannique. La formation de la solution colloïdale est due à une sursaturation de la solution en or au cours de la réduction du sel métallique. La concentration en or augmente jusqu à ce que la nucléation commence. La croissance des nanoparticules obtenues est inversement proportionnelle à la racine cubique du nombre de noyaux formés. La concentration de la solution réductrice en acide tannique est alors le paramètre influant (Figure 4) 22

24 sur le nombre de noyaux formés. En effet, la cinétique de réduction de HAuCl 4 par le citrate de trisodium est lente. Taille des particules / nm Volume d'acide tannique à 1% massique ajouté / ml Figure 4 : Effet de la concentration en acide tannique dans la solution réductrice sur la taille des nanoparticules d or synthétisées [22]. I.2.2. Oxydation du D-glucose sur des métaux nobles Dans cette partie, nous effectuerons tout d abord une revue bibliographique des différents matériaux d électrodes utilisés pour oxyder le glucose puis nous détaillerons leur performance catalytique. Dans un second temps, nous étudierons plus précisément l oxydation du glucose sur des électrodes d or et de platine. L oxydation électrocatalytique du glucose a fait l objet de nombreuses études. Le platine est le matériau d électrode le plus étudié [23-25]. En effet l oxydation du glucose sur des électrodes de platine a lieu à très bas potentiels (i.e. inférieur à 0,3 V vs. ERH). Il est aussi très connu que le platine est très sensible à l empoisonnement par les intermédiaires chimisorbés lors de l oxydation du glucose [26, 27]. Pour résoudre ce problème, différents métaux lourds (Tl, Pb, Bi et W) ont été utilisés sous forme d adatomes pour modifier la surface des électrodes de platine. En effet, l activité électrochimique des catalyseurs tels que le 23

25 platine et l or augmente considérablement lorsque leur surface est modifiée par un adatome. Un adatome est un métal déposé en sous-tension (underpotentially deposited upd) c est-à-dire in situ, à une valeur de potentiel supérieure au potentiel thermodynamique de son dépôt massique. Ces électrodes montrent une bonne électroactivité vis-à-vis de l oxydation du glucose [28], activité augmentant avec le ph de la solution électrolytique. Dans une autre étude, Sun et col.[23] étudient l oxydation du glucose sur des alliages à base de platine. Les autres matériaux utilisés sont le plomb, l or, le rhodium ou encore le palladium. Une cartographie de l activité catalytique en fonction de la composition du catalyseur est réalisée. L électrode présentant l activité la plus élevée est celle du platine modifié par des adatomes de plomb de composition de surface Pt 2 -Pb. Sur cette électrode, l oxydation du glucose se manifeste sur le voltammogramme en milieu tampon phosphate (0,1 M, ph neutre) par un pic très large qui commence à -400 mv vs. ECS en présence de glucose 0,1 M. Dans le cas d une électrode constituée de platine pur, l oxydation du glucose commence à des potentiels proches de -200 mv vs. ECS, dans les mêmes conditions que précédemment. Le problème pointé par l utilisation de tels matériaux est la dissolution du plomb visible à 400 mv vs. ECS sur le voltammogramme en milieu support. Le résultat obtenu par Sun et col. semble être confirmé par Becerik et col.[29] qui étudient l activité d électrodes modifiées de polypyrrole par incorporation puis réduction électrochimique de sels métalliques précurseurs de platine, ruthénium, plomb, étain et bismuth. Ces auteurs mentionnent que les films de polypyrrole modifiés par Pt-Bi ou Pt-Pb sont les électrodes les plus actives pour la déshydrogénation de la molécule de glucose. Cependant la toxicité des métaux lourds employés empêchent le développement de systèmes catalytiques ainsi constitués. Par ailleurs, la synthèse de nanomatériaux alliés, permet dans certains cas, d augmenter significativement l activité catalytique des métaux pris isolément sous forme nanostructurée. Ceci est possible grâce à un effet de synergie entre les différents métaux. Prenons par exemple la synthèse de nanomatériaux Au-Ag et l étude de l oxydation électrocatalytique du glucose (5 mm) en milieu NaOH 0,1 M, effectuée sur ces nanomatériaux par Tominaga et col. [30]. Cette étude montre un effet très intéressant de synergie entre l or et l argent pour des compositions de nanomatériaux proches de Au 70 Ag 30. En effet, l oxydation du glucose commence à de très bas potentiels (i.e. -0,7 V vs. Ag/AgCl/Cl - ) comparé à ce qui est observé sur des nanoparticules d or où l oxydation commence à -0,55 V vs. Ag/AgCl/Cl -. Il est en outre bien connu que de tels effets 24

26 de synergie peuvent être rencontrés lors de l utilisation d alliages or-platine pour l oxydation de molécules organiques [31]. Nous étudierons donc dans un premier temps l oxydation du glucose sur l or et le platine afin de comprendre ce phénomène d oxydation sur des nanomatériaux alliés. I Oxydation du glucose sur l or Les premières études sur l oxydation électrocatalytique du glucose sur des électrodes d or massives ont été réalisées au cours des années 80. Ainsi Nikolaeva et col. [32] ont montré que l oxydation du glucose sur l or restait lente ou incomplète en milieu acide, appréciable en milieu neutre (de type tampon phosphate) et forte en milieu basique. Dans tous les cas, le produit de la réaction d oxydation du glucose sur l or serait l acide gluconique, produit d oxydation à deux électrons. Ces conclusions ont depuis été confirmées par Essis-Yei [33] qui propose un mécanisme d oxydation de la molécule de glucose analogue sur l or et le platine. Il semble bien établi que l oxydation du glucose sur l or a lieu grâce à la formation de sites actifs Au-OH à la surface de l électrode [34]. Ainsi le mécanisme d oxydation suivant peut être proposé : Figure 5: Mécanisme d oxydation du D-glucose sur des électrodes d or (M=Au) [34]. L étude de l oxydation du glucose sur une électrode d or nanostructurée a également été réalisée. En effet, dans un article, Tominaga et col. [35] étudient le comportement voltammétrique et 25

27 chronoampérométrique de nanoparticules d or (taille moyenne 2,3 ± 0,5 nm) en milieu neutre et alcalin, en présence de glucose. Les auteurs précisent que l allure des voltammogrammes obtenus avec ces nanoparticules est conforme à celui obtenu sur une électrode d or massive. Cependant la décroissance du courant en chronoampérométrie est beaucoup plus faible avec l électrode nanostructurée qu avec l électrode massive. Une étude chromatographique des produits d électrolyse (effectuées à 0,1 et 0,3 V vs. Ag/AgCl/Cl - ) montre que le seul produit d oxydation détecté est l acide gluconique. I Oxydation du glucose sur le platine Les premiers travaux concernant l oxydation du glucose sur des électrodes de platine ont été réalisés il y a une trentaine d années. Le but de ces travaux était de développer des électrodes pour la réalisation de piles à combustible glucose/o 2 implantables ou bien encore pour le suivi in situ de la concentration en glucose dans le sang. Rao et col [36] montrent, en milieu tampon phosphate (ph = 7,4), que le produit d oxydation majoritaire est l acide gluconique. Cette conclusion sera plus tard confirmée par Kokoh et col. [25] grâce au suivi chromatographique des produits d électrolyse d une solution de glucose en milieu neutre. De plus, dans les milieux physiologiques, Giner et col. [37] montrent que les ions chlorure ont un effet inhibiteur sur l oxydation du glucose de même que les ions phosphate [28], susceptibles de former une liaison oxygène-métal avec la surface du platine. L oxydation électrochimique du glucose sur le platine implique la déshydrogénation du carbone anomérique de la molécule de glucose [38]. Largeaud et col. montrent que la forme anomérique β-d-glucose est beaucoup plus réactive que la forme α. Cette différence de réactivité entre les deux anomères est attribuée à une orientation géométrique différente de l atome d hydrogène lié au carbone anomérique [39] (cf. figure 6). 26

28 HO HO OH o OH OH H Carbone anomérique HO HO OH o OH H OH Anomère α de la molécule de D-(+) (+)-glucose Anomère β de la molécule de D-(+)-glucose Figure 6 : Représentation des anomères α et β de la moléculde de D-(+)-glucose. Figure 7 : Voltammogrammes d une électrode de platine enregistrés à 50 mv.s -1 en milieu de type KH 2 PO 4 /NaOH (ph = 7,3) en présence de 50,6 mm (-) et en l absence (--) de D-glucose, 25 C [25]. Le voltammogramme de la figure 7, effectué en présence de glucose, montre que l oxydation du glucose sur le platine a lieu dans différentes régions de potentiel. Lors de la variation positive de potentiel, le pic situé à 0,3 V vs. ERH peut être associé à l adsorption du glucose sur la surface de platine, par l intermédiaire de l atome d hydrogène lié au carbone anomérique. Pour des potentiels compris entre 0,4 et 0,8 V vs. ERH, les molécules de glucose s adsorbent et s oxydent directement en gluconate. Les molécules de gluconate adsorbées se désorbent et passent en solution [40]. Pour des potentiels supérieurs à 0,8 V vs. ERH, l espèce adsorbée déshydrogénée 27

29 s oxyde en gluconolactone qui se désorbe et se transforme en gluconate par hydrolyse [40]. Lors de la variation négative de potentiel, la lactone adsorbée s oxyde en gluconate adsorbé grâce aux hydroxyles libérés lors de la réduction des oxydes de la surface de platine [40]. L allure des voltammogrammes présentant l oxydation du glucose sur des nanoparticules de platine semble similaire à celle observée avec des électrodes massives [41]. I Oxydation du glucose sur des nanomatériaux or-platine Il est bien connu dans la littérature que l utilisation d un catalyseur Au-Pt permet d augmenter significativement les densités de courant d oxydation des molécules organiques [31]. Cette augmentation est attribuée à la présence d or. Jin et col [42] ont examiné l oxydation du glucose sur des nanoparticules Au-Pt synthétisées par coréduction de leurs sels précurseurs. L oxydation du glucose sur ce type de catalyseur commence 350 mv plus tôt que ce qui est observé sur une électrode d or. Les auteurs ajoutent que l or et le platine contribuent à la déshydrogénation de la molécule de glucose et que l or permet de prévenir l empoisonnement du platine. Dans cette même étude, les auteurs montrent qu une surface d or modifiée par un dépôt de platine ne présente pas les mêmes caractéristiques. En effet, ce type d électrode s empoisonne beaucoup plus rapidement. Au vu de cette étude, il apparaît que la structure du matériau Au-Pt semble être un paramètre très important sur la performance catalytique. Dans une autre étude, Mott et col. [43] montrent l existence d un effet de synergie entre l or et le platine, dans des nanomatériaux Au-Pt. La réactivité particulière des nanomatériaux Au-Pt peut être expliquée par une étude menée par Bus et col. [44] qui montrent que dans ces structures bimétalliques, des électrons sont échangés entre l orbitale 5d de l or et l orbitale 5d du platine. Ce transfert d électrons affecte les énergies des bandes de valence de l or et du platine. Les niveaux de Fermi de l or et du platine semblent se déplacer dans des directions opposées avec une augmentation de l énergie du seuil L 3 (transition de l orbitale 2p 3/2 vers l orbitale 5d 5/2 et de l orbitale 2p 3/2 vers l orbitale 5d 3/2 ) du Pt et une diminution de l énergie du seuil L 3 de l or. De plus, Comotti et col.[45] montrent que le taux de conversion du glucose en acide gluconique est plus important sur des catalyseurs nanostructurés Au-Pt supportés sur carbone que sur le platine seul. 28

30 Dans un second temps, nous allons nous intéresser à la réalisation d électrodes enzymatiques, à la cinétique enzymatique et aux réactions de réduction du dioxygène (catalysée par la bilirubine oxydase) et d oxydation du glucose (catalysée par la glucose oxydase). I.2.3 Techniques d immobilisation enzymatique et transfert électronique entre enzymes et électrodes Un des problèmes clés à résoudre pour la réalisation d électrodes enzymatiques stables et performantes est l amélioration des techniques d immobilisation. C est pour cette raison qu il est nécessaire de mettre au point des méthodes d immobilisation permettant d avoir un contrôle, à la fois sur l orientation de l enzyme et sur la distance entre son site actif et la surface de l électrode. Pour améliorer la stabilité de l enzyme il semble nécessaire de ne pas déformer la structure tridimensionnelle de la protéine pendant son immobilisation. Par le passé, différentes techniques d immobilisation ont été imaginées et testées. Dans cette partie nous allons effectuer une brève revue bibliographique de ces différentes techniques. I Techniques d immobilisation d enzymes à la surface d une électrode solide Plusieurs techniques d immobilisation enzymatique existent. - Immobilisation par coréticulation - Immobilisation de la biomolécule par greffage covalent entre l enzyme et la surface de l électrode - Immobilisation de l enzyme dans une matrice de polymère - Immobilisation de l enzyme par adsorption à la surface d une électrode - Immobilisation de l enzyme sous une membrane polymère (technique non détaillée ici) 29

31 La première méthode consiste bien souvent à immobiliser l enzyme dans un film de polymère obtenu par électropolymérisation. Cette technique consiste à plonger un support conducteur solide dans une solution contenant à la fois l enzyme, un éventuel médiateur et le monomère. Les molécules enzymatiques sont alors immobilisées dans la couche de polymère lors de la croissance de celle-ci. La littérature décrit l usage de différents polymères tels que le polypyrrole [46], la polyaniline [47] ou bien encore le polyphénol [48, 49]. Le polymère ainsi formé peut être ou non conducteur électronique selon les conditions d électropolymérisation. L avantage d un film de polymère tridimensionnel conducteur est la possibilité d utiliser les fibres de polymères pour le transfert des électrons. La croissance du polymère peut s effectuer selon différentes méthodes. En effet il est possible de réaliser l électropolymérisation par chronoampérométrie [50], chronopotentiométrie [46] ou bien encore par voltammétrie cyclique à variation linéaire de potentiel [46]. Cependant, Fei et col.[46] affirment que la croissance du polymère par chronoampérométrie mène à des films tridimensionnels non reproductibles du fait de la variation de la réponse en courant d une électrode à l autre [46]. En outre, il a été démontré lors d immobilisations de phtalocyanines de cobalt dans un film de polypyrrole, que l électropolymérisation du film par méthode voltammétrique mène à des films homogènes et compacts [51]. Il est important de noter que quelle que soit la méthode employée, il est possible de quantifier l épaisseur du film de polypyrrole par la relation d équivalence courant-matière [46]. De plus, cette méthode d immobilisation par électropolymérisation peut être précédée ou non d une étape d adsorption de l enzyme à la surface du support conducteur solide [52, 53]. De plus, une étape de réticulation complémentaire du film de polymère peut être réalisée à l aide d agents réticulants tels que le glutaraldéhyde [54]. Une autre technique d immobilisation consiste à «bloquer» les enzymes dans une matrice de Nafion ou de chitosan. Le Nafion est un polymère communément utilisé pour réaliser des encres catalytiques pour les piles à combustible. Le chitosan, quant à lui, est un dérivé de la chitine et est insoluble dans des solutions aqueuses de ph supérieur à 6,3 à cause de la nonprotonation de la fonction amine dans de telles solutions. Les deux polymères précédemment cités possèdent une partie hydrophile et une partie hydrophobe. En solution, ces espèces peuvent donc former des structures micellaires à l intérieur desquelles les enzymes peuvent s insérer [55]. De plus, la taille des pores peut être modifiée par traitement chimique des molécules de polymères dont le caractère hydrophobe peut être modifié. Par exemple, Thomas et col. [56] 30