UNIVERSITE PARIS XII VAL DE MARNE FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNOLOGIE LICENCE SVT/SCB TRAVAUX DIRIGES CINETIQUE ENZYMATIQUE ANNÉE

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1 UNIVERITE PARI XII VAL DE MARNE FACULTÉ DE CIENCE ET TECHNOLOGIE LICENCE VT/CB TRAVAUX DIRIGE CINETIQUE ENZYMATIQUE ANNÉE Partie I : Etudes expérimentales Exercice 1 On considère la réaction -----> P catalysée par une enzyme E. le K M correspondant est égal à environ 0,5 mm. Le produit formé P absorbe la lumière à 460 nm (ε = mol/l/cm) On dispose d une préparation d enzyme contenant environ 200 U/mg et d une solution mère de substrat de concentration mol/l. Proposez un protocole complet pour mesurer avec précision le K M de cette enzyme ainsi que l activité par ml de préparation. Exercice 2 L APP (Amyloid Precursor Proteine) est une protéine membranaire exprimée par les neurones. En cas de maladie d Alzheimer, cette protéine est anormalement coupée par la β-secrétase pour donner un fragment toxique qui s agrège dans le cerveau sous forme des plaques amyloïdes. On cherche à étudier l hydrolyse de l APP par la β-sécrétase à fin de pouvoir l inhiber et développer des nouveaux agents anti-alzheimer. Le K M de référence de cette enzyme par l APP est d environ 0,4 mmol/l. On dispose de solutions-mères de APP 100 mmol/l et d une préparation d enzyme contenant 200 nat/ml (activité spécifique théorique de référence). I. Mesure de l activité par la technique du phstat On souhaite étudier la cette réaction enzymatique par la technique du phstat. I.1) Rappelez le principe de cette méthode. On dispose d une cuve de volume utile 30 ml et d une micro-burette permettant d introduire au maximum 1 ml de réactif de dosage (HCl 10 mm) au cours d un essai. I.2) Quelle activité β-sécrétase devez-vous introduire dans la cuve? 1

2 I.3) Pour mesurer KM APP expérimentale, indiquez combien de mesures d activité il faudrait réaliser en indiquant à chaque fois les concentrations et les volumes des solutions mères des deux substrats et de l enzyme à introduire dans les cuves de mesure. I.4) Quelles graphes proposez vous de tracer pour déterminer avec précision le K M, APP? II. Mesure de l activité par radioactivité On utilise un substrat marqué sur son carboné (radio-activité spécifique 10 9 cpm /mmol), on sépare le produit formé à différents temps et mesure sa radioactivité. Cette technique est une technique en continu ou en discontinu. II.1) Quelle activité β-sécrétase devez-vous introduire dans la cuve de 1 ml si l activité avait été déterminée par mesure de la radioactivité du produit après extraction? (Limite de sensibilité du compteur de radioactivité : 100 cpm). 11.2) Pour mesurer KM, APP indiquez combien de mesures d activité il faudrait réaliser en indiquant à chaque fois les concentrations et les volumes des solutions mères des deux substrats et de l enzyme à introduire dans les cuves de mesure. IV. Inhibition par Pep-AD Pep-AD est un peptide, inhibiteur compétitif de protéases, de constante K i environ 10 mmol/l. On veut mesurer K i en effectuant des mesures d activité de pour 5 concentrations de APP et 5 concentrations de Pep-AD. 4-1) Donnez les valeurs de concentration de ces deux composés que vous proposez d utiliser. 4-2) Donnez à l échelle les courbes a =f([app]) que vous obtiendrez en absence et présence de Pep-AD à 10 mmol/l. 4-3) Quel réseau de courbes faut-il tracer pour mesurer K i. Donnez celles correspondant à APP en excès et [APP] = 2 mmol/l. Exercice 3 Une enzyme de masse molaire 60 Da a une activité spécifique moléculaire égale à 10 3 s -1 pour un substrat X. Une préparation de cette enzyme contient 100 U/mg. Quel est son degré de pureté? (celui-ci sera défini comme le pourcentage d enzyme active par rapport aux protéines totales.) Exercice 4 On étudie l oxydation du propionaldéhyde (CH 3 CH 2 CHO) par une AldDH NADH dépendante dont les constantes caractéristiques sont les suivantes : Masse molaire: g/mol. cat = 110 min -1 K M,NAD = 78 µm K M,ald = 0,15 µm On dispose de 800 mg d un extrait non purifié contenant 0,025 U/mg. 1) Protocole de mesure de l activité L activité de cette enzyme peut être mesurée en suivant par colorimètre, la production de NADH. 1-1) Quelles concentrations minimales d aldéhyde et de NAD + faut-il introduire dans la cuve pour que l AldDH travaille à saturation? 1-2) Quelle activité AldDH proposez-vous d introduire dans une cuve de mesure de volume utile 3 ml? achant que cette activité sera introduite par une injection de 40 µl de solutionmère, quelle masse de préparation initiale d AldDH devra être dissoute pour préparer 1 ml de celle-ci? 2

3 2) Inactivation On étudie l inactivation irréversible de cette enzyme par l iodoacétamide. Pour cela on incube une aliquote d enzyme en présence d une concentration de 4 mm d iodoacétamide. On mesure l activité résiduelle en fonction du temps. Les résultats sont les suivants : Temps (min) Activ. résiduelle (%) , , , , ,44 Déterminez graphiquement la constante d inactivation obs correspondant à cette concentration d iodoacétamide. 2-3) La constante obs a été mesurée pour diverses concentrations d iodoacétamide Iodoacétamide (mm) obs min -1 0,3 7, ,5 1, ,9 1, ,5 1, , Reportez la valeur calculée cidessus Le mécanisme d inhibition de AldDH par l iodoacétamide (IR) est le suivant : K i E + IR E IR ER (inactif) i I - Déterminez graphiquement les constantes i- et K i caractérisant cette inactivation. Exercice 5 La G6PDH catalyse la réaction d oxydation du glucose-6p en gluconolactone-6p par le NADP + I. Activation thermique de la G6PDH On souhaite étudier l'activation thermique la G6PDH et déterminer son énergie d'activation (Ea). Proposer un protocole expérimental pour cette étude. I.1) Quelle concentration de substrat faut-il utiliser? I.2) Quels graphes faut-il tracer pour obtenir Ea? II. tructures du site actif et mécanisme de la G6PDH Levy et Coll. ont proposé le mécanisme de fixation et transformation du G6P suivant, à partir d expériences de mutagenèse dirigée (schéma fourni séparément). 3

4 L étude cristallographique de la structure du site actif montre que les deux histidines désignées par (a) et (b) portent les numéros 178 et 240. Levy a remplacé successivement chacune de ces histidines par de l asparagine (mutants H178N et H240N) et mesuré les constantes caractéristiques de l enzyme sauvage et des enzymes mutées : cat (min -1 ) K M,G6P (µmol/l) Rapport des K m,g6p Enz. mutée- Enz. native K M,NADP (µmol/l) Rapport des K m,nadp Enz. mutée- Enz. native Enzyme sauvage H178N ,6 H240N ,2 a) Indiquez quel est le numéro dans la chaîne protéique des histidines (a) et (b) (Justifiez). b) À partir du schéma proposé pour le mécanisme, pouvez-vous justifier la différence d effet des deux mutants sur le K M,G6P correspondant. Partie 2 : Modèles cinétiques et loi de vitesses Exercice 6 On considère l hydrolyse d un ester RCOOR catalysée par une sérine protéase telle que la trypsine. Le mécanisme de cette enzyme, en tenant compte de l influence du produit, est le suivant : RCOOR' R'OH RCOO - E E RCOOR' RCOOE R'OH RCOOE E RCOO - E K 1 2 K 3 4 K 5 Les étapes correspondant à l association/dissociation sont caractérisées par la constante de dissociation K i ; celles qui sont irréversibles par leur constante cinétique i. La vitesse de la réaction peut s exprimer selon : d[r' OH] V = = d[rcoo ] = dt dt 2 [E RCOOR' ]= 4 [RCOOE] [RCOOE] Il en résulte que : [E RCOOR' ] = K 4 1) Établissez la loi de vitesse correspondant à ce modèle. 2) Donnez les expressions des constantes vrais cat et K M caractérisant cette enzyme. 3) Donnez les expressions des constantes apparentes cat,app et K M,app en fonction des concentrations des produits RCOO - et R OH. 4) Dans le cas où la concentration de RCOO - est nulle, donnez l expression des constantes apparentes cat, (R OH) et K M (R OH). Quel est le type d inhibition provoqué par R OH? Quelle est l expression de la constante d inhibition. 5) Dans le cas où la concentration de R OH est nulle, donnez l expression des constantes apparentes cat, (RCOO - ) et K M (RCOO - ). Quel est le type d inhibition provoqué par R OH? Quelle est l expression de la constante d inhibition. 4

5 Exercice 7 La 3α-hydroxystéroïde déshydrogénase (HD) catalyse à ph 7 l oxydation par le NAD + de l androstérone (qui sera par la suite désignée par AH2) : AH 2 + NAD + A + NADH + H + Les constantes de Michaélis de cette enzyme sont de l ordre de grandeur de : K M,AH2 = 50 µm K M,NAD = 800 µm Le mécanisme proposé pour cette oxydation par Penning et coll. est le suivant : NAD + AH 2 A + NADH HD HD NAD + HD NAD + AH 2 K NAD K AH2 HD 1) Par quel type de mécanisme les deux substrats se fixent -ils sur l enzyme? L indométhacine, représentée par I, se fixe sur l enzyme en formant un complexe improductif de la façon suivante : HDNAD+ +AH 2 A + NADH HD NAD HD NAD + AH 2 HD K NAD K AH2 I K I HD NAD + I 2) Montrer que l activité de l enzyme en présence de NAD +, AH 2 et I s exprime selon la loi suivante : [E] a= T [NAD + ][AH 2 ] K AH2 {K NAD +[NAD + ](1+ [I] )}+[NAD + ][AH 2 ] K I 3) On mesure l activité de l enzyme en fonction de la concentration de AH 2 dans un milieu contenant un excès de NAD + et une concentration fixée de I. a) Donnez l expression simplifiée de l activité dans ces conditions. b) Quelles sont les expressions de K M,AH2 et cat en absence de I? c) Quel est le type d inhibition provoqué par I? d) Pouviez-vous prévoir sans calcul ces résultats à partir du modèle cinétique ci-dessus? 4) On mesure maintenant l activité de l enzyme en fonction de la concentration de NAD + dans un milieu contenant des concentrations fixées de AH 2 et I. (AH 2 n est pas en excès) a) Donnez les expressions de cat (AH 2 ) et de K M,NAD (AH 2 ) en absence de I. b) Donnez les expressions de cat (AH 2,I) et de K M,NAD (AH 2,I) en présence de I. c) Quel est le type d inhibition provoqué par I? d) Pouviez-vous prévoir sans calcul le type d inhibition à par tir du modèle cinétique ci-dessus? 5

6 Exercice 8 On considère une enzyme michaélienne présentant un mécanisme à 2 étapes. E E E' E+P K a) Rappelez ce que l on appelle un mécanisme à deux étapes. b) Montrez que, à l état stationnaire : [E'] = K e Donnez l expression de K e en fonction de 2 et 3 [E] De plus un inhibiteur I se fixe sur l enzyme libre E et sur le complexe E avec la même affinité. Par contre il ne se fixe pas sur E : I E E E' E+P K K i I K i EI E'I c) Posez le système d équations permettant d établir la loi de vitesse. En résolvant ce système, on trouve la loi suivante : 2[E] T[] a= [I] [I] K 1(1+ ) + [][1+ K e(1+ )] K i Ki d) Donnez les expressions des constantes vraies K M et cat et des constantes apparentes K M (I) et cat (I). NB : Vous exprimerez cat en fonction uniquement des constantes cinétiques. I. On considère que l étape 2 est la plus lente ( 2 < 3 ). Donnez les expressions simplifiées de ces quatre constantes dans ce cas. e) Quel est le type d inhibition provoquée alors par I. II. On considère maintenant que l étape 3 est la plus lente ( 3 < 2 ). Donnez, de même, les expressions simplifiées de ces quatre constantes. f) Quel est alors le type d inhibition provoqué alors par I. g) Dans chacun des deux cas ci-dessus, construisez un modèle simplifié tenant compte de la forme du complexe enzyme substrat qui s accumule lorsque l enzyme se sature. Ceci permet t il de prévoir les types d inhibition obtenus? 6

7 Exercice 9 Dans le cas limite d une enzyme possédant deux sous-unités identiques, le modèle MWC peut être représenté ainsi : T K T T L R R K T K T T T R R L= [T] [R] > 1 c= K T <1 Les deux conformations R et T sont dites à haute et basse affinité. 1. Précisez laquelle est à haute affinité. Ce modèle peut être simplifié en donnant le modèle ci-dessous à condition de faire une hypothèse concernant l une des constantes d équilibre. Laquelle? T L R R R R 2[E] La loi de vitesse correspondante est alors : a= T []( + [] K 2 R (L+1)+ 2[] + [] 2 2. implifiez la si L=O. Quel est alors le comportement de l enzyme. Montrez que l on peut prévoir ce résultat en simplifiant le modèle ci-dessus. 3. Donnez sur un même graphe les allures des courbes correspondant à L = 0, L = 10, L= 100. On considère un modulateur X susceptible de se fixer sur R et T à un site différent de X (Modulateur hétérotrope). 4. Calculez L X en fonction de L,,X et K T,X. L On introduit une quantité suffisante de X pour saturer R et T. 5. Quelle est la concentration minimum qu il faut introduire? T R X K T,,X X,,X TX RX L X RX et TX fixent et transforment avec la même affinité et la même activité que R et T. Dans ces conditions le modèle simplifié devient : 7

8 TX L RX RX XR RX 6. Donnez la relation d inégalité qui doit exister entre,x et K T,X. pour que X soit un activateur, un inhibiteur. 7. Quelle condition limite doit être respectée pour que en présence de X, l enzyme soit michaélienne? TRAVAUX PERONNEL Ces exercices ne seront pas obligatoirement traités en TD sauf temps disponible. Exercice A Le mécanisme de l alanine transaminase est de type ping-pong. La leucine se fixe en compétition avec l alanine : Ala Pyr αkg Glu (5) E E Ala F F αkg E (1) (2) (3) (4) Leu E Leu Montrez que [F αkg] [E Ala] = K A. Donnez l expression de K a la loi de vitesse est de la forme : 2[ET ][Ala][ αkg] a= [Leu] (1+ K a )[Ala][ αkg] + K 1[ αkg](1+ ) + K K 5 a K 3 [Ala] 1) Donnez l expression des constantes catalytiques vraies. Lors d un protocole expérimental Quelles sont les graphes que vous traceriez pour déterminer ses constantes (A chaque fois indiquez les composés utilisés). 2) Exprimez la constante apparente cat (Leu) et commentez. Quels sont les graphes que vous traceriez pour déterminer cette constante (indiquez les composés utilisés) 3) Donnez les expressions des constantes de Michaélis apparentes K M,αKG (Leu) et K M,Ala (Leu). Que pouvez-vous conclure? Quels sont les graphes que vous traceriez pour déterminer ces constantes. Indiquez les composés utilisés et l allure des courbes que vous envisagés d obtenir. 4) Pouvait-on prévoir ces résultats a priori. 8

9 Exercice B (supplémentaire) Etude de la glucoinase (GK) La GK est un dimère de masse molaire 100 Da dont les constantes de Michaélis sont les suivantes : K M,Gluc = 0,01µM K M,ATP = 0,05 mmo/l cat = min -1 On mesure l activité de la GK en fonction de la concentration d ATP pour 3 concentrations de glucose aux alentours de 0,01 µmol/l. On obtient le réseau de courbes suivant : 1/a Glucose croissant [1/ATP] 1) Montrer que l on peut interpréter ces résultats en faisant l hypothèse que le mécanisme est ordonné. 2) Écrivez le schéma de Cleland correspondant (Justifiez l ordre de fixation des substrats). On incube l enzyme seul (Témoin) ou en présence de divers substrats à une température où elle se dénature et on mesure l activité résiduelle à 25 C. On trace le réseau de courbes ci-dessous : Log ar Enzyme + Glucose 0,1µM Enzyme + Glucose Enzyme + AT P 50 mm Enzyme seul & E nzyme ATP 0,4 mm Temps d incubation 3) Comment faut-il modifier le modèle de Cleland en fonction de ce résultat? On envisage de greffer de la fluorescéine sur la GK et d étudier sa fluorescence dans les milieux suivants GK seule (témoin) GK + Glucose GK + Lyxose GK + ATP GK + Glucose + ATP GK +Lyxose + ATP 4) Quelle hypothèse veut-on tester? 5) Quels seront les résultats si elle est exacte? 9