La Concentration d Échantillons de Grands Volumes Directement dans les Petites Fioles avec le Minimum de Perte d Échantillon.
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- Pierre-Antoine Rousseau
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1 La Concentration d Échantillons de Grands Volumes Directement dans les Petites Fioles avec le Minimum de Perte d Échantillon. Beaucoup de laboratoires sont au courant du problème de la perte significative d'échantillon une fois confrontés à la concentration d échantillons de grand volume et au transfère du résidu dans un format spécifique de soutien d analyse ou de stockage, tel qu'une fiole. Dans cet article nous rapportons sur un développement innovateur qui a permis «l automatisation» de l'étape de transfert dans un système d évaporation de Genevac évitant de ce fait des pertes coûteuses. Les avantages de la technologie de SampleGenie sont illustrés avec 4 études de cas. Le SampleGenie comporte un entonnoir/flacon en verre spécifiquement conçu qui scelle solidement dans une fiole de stockage augmentant de ce fait considérablement sa capacité - effectivement créant un seul volume, récipient de 2 étapes - et permettant à un échantillon pure ou de grand volume d être évaporé directement dans la fiole et éliminant l'étape de transfert. Cette assemblage peut être chargé dans un système d'évaporation de Genevac et l échantillon peut être concentré suivant une méthode stockée. Si une poudre anhydre amorphe est exigée à la fin de cette étape, un évaporateur de la série HT avec LyoSpeed peut être employé pour concentrer le grand volume dans la fiole, et lyophiliser alors automatiquement le volume restant pour laisser une poudre dans la fiole. Une version seulement de concentration est également disponible pour les utilisateurs qui ont besoin d'un échantillon humide de petit volume. Schéma 1 SampleGenie Une sélection des systèmes montrés avec le croquis de montage à droite. Légende Bleu foncé flacon Rouge joint Bleu clair fiole Vert adaptateur Les applications qui peuvent tirer bénéfice de la technologie de SampleGenie incluent : La chimie médicinale Entre la synthèse et le stockage des composés, le transfert dans la fiole de stockage a été fait en raclant le composé sec dans la fiole de stockage ou en passant par un processus de redissolution et transfert utilisant un poste de travail de manipulation liquide et encore une autre étape d'évaporation. Tous les deux sont longs et ont des rendements potentiellement mauvais. Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 1 sur 7
2 Au centre de ces dernières approches ont été les systèmes HT et EZ-2 Genevac d'évaporation en parallèle. Utilisant une commande précise ils sèchent bien les composés mais n ont pas facilité leur transfert dans la fiole désirée de stockage. Métabolisme Dans des études de métabolisme, de grands volumes de solution contenant un échantillon d'essai marqué radioactivement sont souvent générés et doivent être séchés et transférés dans une petite fiole avant le compte pour déterminer la quantité de témoin présent. Analyse environnementale Dans l'analyse environnementale la concentration de l'échantillon est généralement basse, quelques milligrammes (mg) d'échantillon pour 100 millilitres (ml) de solution, tandis qu'un échantillon pure peut avoir une concentration jusqu à 10mg/ml, ou davantage. Pendant la concentration des échantillons environnementaux, les scientifiques observent souvent que leurs échantillons sortant de la solution et se collent aux parois du flacon avant que le volume soit assez petit pour transférer dans une fiole. C'est parce qu'une fois que le solvant organique s'est évaporé, une molécule environnementale non polaire ne voudra pas rester dissoute dans le soluté restant, et précipitera dehors. ÉTUDE DE CAS 1 : Groupe de métabolisme des drogues chez Servier Research Le but de cette étude de cas était de réduire le nombre d'étapes manuelles de concentration d'échantillon avant l'évaluation de la performance des drogues à l'essai. Méthodes Deux méthodes ont été employées. 1. Évaporation de 40ml d'eau à sec (y compris la concentration et ensuite la lyophilisation de l'échantillon), 2. Évaporation de 40 ml d'acétonitrile à sec. Le rendement a été évalué pour l'évaporation d'une molécule de drogue marquée par le 14 C dissoute dans l'eau et l acétonitrile. Rendement de l'eau 40ml d'eau ont été piquée avec approximativement dpm de la molécule de drogue marquée par le 14 C. Cette solution a été placée dans la partie supérieure d'un support de SampleGenie et la méthode correcte de Genevac a été lancée. L'échantillon, sec après 12 heures, a été reconstitué dans 2ml d eau. Le rendement a été alors évalué. Rendement d'acétonitrile 40ml d'acétonitrile ont été piquée avec approximativement dpm de la molécule de drogue marquée par le 14 C et a été séché comme avant. L'échantillon, sec après 4 heures, a été reconstitué dans 1ml de méthanol et le rendement évalué. Résultats Le rendement de 40ml eau était 92% Le rendement de 40ml acetonitrile était 93% Dans une expérience visuelle finale, 50ml d eau ont été piquée avec 100µl le colorant alimentaire vert (voir le schéma 2) qui a été alors évaporé à sec en utilisant la méthode `eau'. Tout le colorant vert semble être capturé dans le fond de la fiole de collection. Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 2 sur 7
3 Schéma 2 Colorant alimentaire vert dans l'eau avant la concentration (à gauche), et alors concentré dans la fiole (à droite) Conclusions Le rendement de >90% réalisé par Servier Research utilisant SampleGenie rivalise très favorablement avec des méthodes standard. En outre, l'intervention manuelle et l'évaporation supplémentaire exigées pour le transfert dans la fiole de stockage ont été éliminé réduisant ainsi le temps de processus par jour dans le laboratoire typique de purification. Bien qu'il n'y ait eu aucune programmation du type XYZ impliquée, SampleGenie a effectivement automatisé la manipulation des liquides! ÉTUDE DE CAS 2 : Leochimica Laboratories, Laboratoire de Validation, Italie En évaluant SampleGenie - Leochimica Laboratories ont cherché à améliorer leur méthodologie de concentration d'échantillon avant l'analyse environnementale. Leochimica Laboratories ont un programme de développement continu pour développer de nouvelles méthodes pour l'analyse environnementale, couvrant la toxicologie alimentaire, les boissons, l'hygiène du travail et la sécurité. Un projet de ce type était d'évaluer la convenance de la technologie de SampleGenie pour concentrer de grands volumes directement dans une fiole de 2ml de la CG, pour aider à éliminer des sources possibles de perte. Utilisation du SampleGenie Dans la méthode analytique à l'étude, Leochimica met typiquement ses échantillons à concentrer dans des flacons de volume 60ml, 120ml, et 200ml. Puisque les flacons sont à plusieurs reprises réutilisés, les considérations principales étaient le nettoyage des flacons entre les différentes concentrations, et le matériel élastomère qui forme le joint entre le flacon et la fiole. Cette étude considère ces problèmes, et évalue les rendements d'un certain nombre d'analytes en employant le système de SampleGenie. Évaluation dusamplegenie Le SampleGenie a été évalué utilisant un système d'évaporation EZ-2 de Genevac pour déterminer le rendement des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) des analytes de pesticide après concentration d'un grand volume du solvant. Les rendements ont été comparés aux méthodes courantes. Des effets de «mémoire» de la réutilisation des composants du SampleGenie ont été également évalués. Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 3 sur 7
4 Méthodologie Des étalons du mélange HAP, de pentachlorobenzène et d'hexachlorobenzène, ont été préparés dans deux solvants différents, hexane et dichlorométhane (DCM). La concentration de ces analytes (une fois concentrés de 50ml à 1ml) a été calculée pour être 0,1 mg/l HAP, mg/l pentachlorobenzène et mg/l hexachlorobenzène. Une aliquote de 50ml de chaque solution a été transférée dans des récipients SampleGenie de 60ml et dans des fioles ASE en verre de 60ml. Concentration de solution d'hexane Le système a été programmé pour donner des échantillons fortement concentrés, mais non secs, dans des fioles ASE. Concentration de solution de DCM Des échantillons ont été concentrés utilisant la pression en croissance progressive puis stabilisés jusqu'à ce qu'un résultat fortement concentré ait été réalisé. Les rendements dans chaque fiole ont été déterminés par analyse de GC-MS. Observations L'EZ2 et le SampleGenie ont réalisé une concentration tout à fait cohérente et reproductible de la solution étalon dans l hexane. La comparaison des tubes de SampleGenie et d'ase prouve que tous les deux conviennent aux méthodes d'évaporation au bas volume final. Cependant, le SampleGenie permet l utilisation du système automatique de déterminaison de la fin du cycle sur l évaporateur Genevac, laissant l'échantillon dans la fiole analytique prêt pour l'injection d'analyse de GC-MS, ce qui représente une économie considérable de travail. SampleGenie n'a pas montré d effets de contamination croisée ni de mémoire. Évaluation à long terme Les échantillons ci-dessus ont été employés encore pour vérifier la reproductibilité intra-cycle après une période de 2 mois. Méthodologie Les étalons ont été préparées comme avant dans l'hexane et DCM et six échantillons ont été placés dans le SampleGenie et évaporés comme avant, utilisant l'arrêt automatique. Les échantillons d'hexane ont pris environ 1 heure 20 minutes pour s'arrêter, laissant approximativement 1ml dans la fiole. La solution de DCM a pris approximativement 3 heures pour s'arrêter, encore laissant approximativement 1ml dans la fiole. Les échantillons ont été analysés par GC-MS. Conclusions Les rendements de l'ez-2 et du SampleGenie étaient tout à fait cohérents et reproductibles, aussi pour les analytes très volatiles. La comparaison «de cycle en cycle» de l'évaporation de la solution étalon d'hexane confirme d'excellentes reproductibilité et exécution de l'ez-2 utilisant le SampleGenie, même dans différentes saisons (hiver et printemps). La comparaison des tubes de SampleGenie et d'ase prouvent que ces deux récipients conviennent aux méthodes d'évaporation au bas volume final. Le SampleGenie offre un avantage additionnel parce qu'il permet l'utilisation de paramètres de contrôle automatique de la fin du cycle de l évaporateur Genevac, et laisse l'échantillon dans la fiole analytique prêt pour l'injection dans le GC-MS. Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 4 sur 7
5 La cadence de traitement des échantillons du système comportant l'ez-2 et le SampleGenie est inférieure à celle réalisée en utilisant des tubes d'ase : 8 contre 12 et de plus longs temps de concentration. Néanmoins le SampleGenie offre l'avantage de l'élimination de la nécessité de transférer le volume résiduel du tube dans la fiole. Cette étape sensible a besoin de temps de travail et peut diminuer le rendement. Tout bien pesé, SampleGenie est favorisé, en particulier pour l'usage avec des analytes sensibles. ÉTUDE DE CAS 3. Laboratoire Départemental d Analyses de la Drôme, Valence, France Le Laboratoire Départemental d Analyses de la Drôme a évalué SampleGenie comme technique préparatoire des échantillons par évaporation de larges volumes contenant les analytes volatiles. L'impact d'un nouvel instrument sur des méthodes d'essai doit être entièrement compris et les méthodes d'essai revalidés au besoin. En ce qui concerne la concentration d'échantillon et la technologie d'évaporation la question la plus importante est le rendement d'échantillon, particulièrement pour les analytes très volatiles. Le Laboratoire d'analyses Départemental de la Drôme (LDA26) a évalué le système d'évaporation Rocket de Genevac et sa capacité à préparer les échantillons de large volume contenant les analytes volatiles. Système d'évaporation Rocket Le système d'évaporation Rocket est un nouveau system d'évaporation en parallèle qui évapore jusqu'à six flacons en parallèle, où chacun peut contenir jusqu'à 400ml, et peut traiter les flacons de SampleGenie. Évaluation du Rocket et le Comparaison à l'équipement Existant Les échantillons des analytes environnementales volatiles étaient piqués (50mg/litre) dans 100ml d'un mélange 50:50 en volume de DCM et d'acétone. Les échantillons ont été évaporés dans des flacons du SampleGenie dans l'ensemble du Genevac Rocket à 35 C utilisant la méthode de préréglage, pour laisser juste la goutte de pentanol. Le Rocket est conçu pour arrêter l'évaporation automatiquement à ce moment. Suite à l'évaporation, les échantillons ont été recomposés à 1ml avec un mélange 50:50 en volume d'eau et d'acétonitrile qui a été ajusté à ph 2 et injecté dans un système d analyse HPLC à gradient utilisant un détecteur de fluorescence à multiples longueurs d'onde (HPLC-Fluor). Ces résultats ont été comparés aux premiers travaux effectués à LDA26, utilisant un évaporateur de type turbo. Conclusions Le Genevac Rocket avec SampleGenie a fourni un rendement augmenté au-dessus des méthodes préexistantes d'évaporation examinées. Sous vide, les solvants bouillis à une basse température gardant les échantillons au froid. Les autres méthodes avaient fonctionné avec l échantillon à 35 C. ÉTUDE DE CAS 4. Laboratoire d Applications Genevac Applications Du laboratoire central des applications de Genevac à Ipswich, au R-U, nous rapportons sur le développement d'une technique simple utilisant le SampleGenie pour automatiser le pooling des fractions d HPLC en phase inverse, l évaporation et le reformatage. Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 5 sur 7
6 SampleGenie a été mis en application avec succès où des échantillons sont purifiés par la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) à phase inverse. Normalement, ces échantillons de HPLC ou fractions seraient séchés avant la mise en commun, puis redissous dans un petit volume de solvant, tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO), transférés dans la petite fiole, et séchés pour enlever le DMSO. Les fractions des échantillons de la HPLC en phase inverse sont souvent dissoutes dans un mélange d'eau et d acétonitrile (ou parfois de méthanol), plutôt qu'un solvant organique simple, ou un mélange de solvants semblables. Pour empêcher la précipitation de l'échantillon en dehors - le 1,4-dioxane a été ajouté car il a un point d'ébullition semblable à celui de l eau afin que le tout ne se soit pas évaporé avec de l'acétonitrile et il est miscible avec de l'eau. Expériences d Addition des Co-solvants Une série d'expériences a été faite avec le Genevac Rocket (voir le schéma 3 - système d'évaporation) équipé des flacons SampleGenie. Dans cette étude trois des composés standard ont été employés - hydrocortisone, cimétidine et caféine - choisi pour fournir une gamme de solubilités différentes et une susceptibilité de les éluer dans un gradient HPLC en phase inverse: Schéma 3 Genevac Rocket Ces expériences ont été faites avec deux volumes de fraction, 100ml et 200ml, avec 100mg et 200mg des composés de norme utilisés, respectivement. La méthode de fraction de HPLC à 40 C a été choisie pour toutes les expériences. Les niveaux de recouvrement étaient entre % rassemblé dans la fiole. Conclusion Le système du Rocket avec SampleGenie fournit une façon simple de concentrer ou de sécher les échantillons de grand volume de HPLC en phase inverse directement dans de plus petites fioles. L'addition d'une quantité modérée de 1,4-dioxane est une méthode simple et efficace d'éviter l adhésion de l'échantillon sur les parois du flacon. Les rapports complets et les résultats sous forme de tableaux de chaque ensemble d'essais et de références relatives sont fournis par Genevac sur demande. Remerciements : Étude de Cas de Servier Research Dr Peter Bennett est Scientifique Confirmé de Recherche dans le groupe de Métabolisme de Drogues chez Servier Research in à Slough, UK. Ian Whitehall est Directeur de Ventes pour SP Industries, basé à Genevac, Ipswich. Ian est reconnu à travers le monde comme un expert de l industrie de l automatisation du laboratoire. Étude de Cas de Leochimica Laboratories Dr. Raffaele Faita, Chef du Laboratoire et Dr. Agostino Brunetta, Scientifique Confirmée, Laboratoire des Validations, Leochimica Laboratories, Étude de Cas de l LDA de la Drôme Mr Félix Massat est Chef du Laboratoire; Benoît Planel est Chimiste; et Antoine Venezia est Directeur de la Recherche et du Développement; tous au Laboratoire Départemental d Analyses de la Drôme, Valence BP118, 26904F-91, France Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 6 sur 7
7 Étude de Cas du Pooling des Fractions HPLC Dr Induka Abeysena est Scientifique en Applications et Rob Darrington est Directeur Marketing chez Genevac Ltd, Ipswich, IP1 5AP, UK Ce rapport a été compilé par Glenn Pickett, Fondateur d Aardvark Action Marketing et Consultant en Préparation des Échantillons. Genevac_TechArticle_ConcentratingLargeVols2SmallVials _GP Page 7 sur 7
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