Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique- Genève. L électrophorèse capillaire

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1 Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique Genève L électrophorèse capillaire EC

2 Historique 1930 Séparation de protéines sous forme de bandes contiguës dans un tube en quartz en forme de «U» Électrophorèse par zones et isotachophorèse 1960 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et SDS PAGE 1970 premier instrument d électrophorèse capillaire ( CZE et CIEF) 1980 Ère moderne de l électrophorèse capillaire (CZE, MECK et CIEF)

3 Domaines d application Analyse pharmaceutique ( formulations pharmaceutiques et fluides biologiques ) Analyse biochimique ( protéines, ADN, ) Analyse clinique et toxicologique Analyse environnementale ( pesticides, ) Analyse phytochimique ( métabolites secondaires )

4 Appareillage

5 Principe de l EC Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous s l influence d un champ électrique. Séparation s effectue dans des tubes de silice fondue de petit diamètre d (20 μm à 100 μm m d.i.). Hauts voltages (0 à 30 kv) et hauts champs électriques (100 à V/cm) sont appliqués aux extrémités du capillaire. Haute résistance du capillaire limite la génération de courant (quelques( μa) et l effet Joule. Grande efficacité (N > 10 5 à 10 6 ) et rapidité d analyse. Détection «en ligne» (pas de cellule externe). Petits volumes d injection (nl( nl) Petites quantités de solvant pour l analyse (μl).( Attention à l électrolyse du tampon! Différents modes de séparation et application. Séparation en milieu aqueux et nonaqueux. Couplage à divers détecteurs (UV, fluorimétrie,, masse). Automatisation possible.

6 Principe de l EC Capillaire en silice vierge diamètre interne: μm longueur: cm) Détecteur à barrette de diodes ( nm) Détection Anode (Pt) Injection Flacons remplis d une solution tampon (5 150 mm) + _ Cathode (Pt) V 300 μa 6 W

7 Le capillaire Tubes résistants (polyimide( polyimide) ) remplis de silice vierge, enduite ou greffée La silice est dénudée sur 5 à 10 mm pour la détection UV en ligne (longueurs total et effective) Diamètre interne de 20 μm m à 100 μm Diamètre externe de 70 μm m à 500 μm Haute constante diélectrique (isolant)

8 La cassette

9 Les tampons, les électrolytes et les additifs CE UV CE MS Tampons: Additifs: * citrate * acide formique * phosphate Aqueux * formate d ammonium * borate * acétate d ammonium * carbonate d ammonium * modificateurs * mélanges (MeOH( MeOH/MeCN) organiques Nonaqueux contenant des électrolytes volatiles * micelles (ex: SDS) * possibilité d utiliser du SDS * sélecteurs chiraux et des CDs avec remplissage (ex: Cyclodextrines) partiel du capillaire * Electrochromatographie

10 Tension appliquée et volume injecté Voltage: 0 à 30 kv!!! Courant: 0 à 300 μa Puissance: 0 à 6 W Injection: hydrodynamique pression (mbars.sec) vide gravité électromigration (voltage, courant)

11 La détection UV Abs A B Abs A B t t detection à λ 1 detection à λ 2

12 La détection par spectrométrie de masse Les avantages du couplage CEMS CE Grande efficacité Séparation rapide Faibles volumes MS Sélectivité Sensibilité Information structurale

13 La détection par spectrométrie de masse L appareillage CEESIMS: interface de type «électrospray» Capillary Nebulisation Gas Sheath liquid makeup Skimmer Octopole Drying Gaz Detector Capillaire MS Fragmentation zone («upfront» CID) Lenses Quadrupole Pression atmosphérique Vide : 1 Torr 10 2 Torr 10 5 Torr

14 La séparation en EC L électrophorèse capillaire est une méthode qui permet de séparer les constituants d un mélange en solution en se fondant sur leur différence de migration, lorsqu ils sont soumis à un champ électrique. Initialement, ce procédé s applique aux particules chargées positivement ou négativement qui se déplacent par application d un champ électrique avec des vitesses apparentes variables. Les constituants d un mélange se séparent dans le temps sous l effet de 2 facteurs principaux appelés: Mobilité électrophorétique: μ ep Mobilité électroosmotique: μ eo

15 Mobilité électrophorétique La mobilité (ou migration) électrophorétique μ ep correspond au déplacement des molécules chargées (les substances neutres n ont pas de μ ep ) dans un électrolyte «supposé immobile» vers l électrode de signe opposée. μ ep = q i / (6πη πηr i ) en m 2 V 1 s 1 et V ep = μ ep q i et r i : caractéristiques ristiques physicochimique chimique de l ion, l η : viscosité (cp) ep E La mobilité électrophorétique tique μ ep et donc la vitesse électrophorétique tique V ep dépend du milieu: ph et composition du tampon (force ionique, viscosité, )

16 Mobilité électroosmotique Le second paramètre qui contrôle le mouvement des solutés est appelé pelé écoulement électroosmotique μ os (ou électroosmose). La paroi interne du capillaire est tapisée de groupements silanol qui s ionisent à partir de ph2 pour former r une paroi intérieure chargée négativement. Afin d assurer la neutralité, les cations du milieu tampon viennent recouvrir la paroi ce qui donne lieu à la formation d une double couche (potentiel Zeta). Sous l influence du champ électrique, les cations de cette double couche se mettent en mouvement et migrent en direction de la cathode. Ainsi, ils entrainent la solution tampon et créent un flux appelé é écoulement électroosmotique. μ eo eo = [(εδ / 4πη4 πη) ) E ] en m 2 V 1 s 1 et V eo = μ eo ε : constante diélectrique du milieu, δ : potentiel Zeta (mv), η : viscosité (cp) L écoulement électroosmotique peut être contrôlé en modifiant la tension, le ph ou la nature du capillaire (silice greffée), e), ou en introduisant des additifs. eo E

17 Mobilité apparente et ordre d élution La mobilité apparente correspond à la vitesse réelle de migration n des molécules au sein du capillaire et correspond donc à la somme de la mobilité électrophorétique et de la mobilité électroosmotique: μ app = μ ep + μ eo et V app = V ep + V eo V eo Mais aussi: V ep + V app +

18 La séparation en EC Fonction de Charge Taille Injection ANODE N N N N CATIONS NEUTRES ANIONS + + EOF Figure 2. Principe de l électrophorèse capillaire de zone + = + ++ EOF EP EM EOF = EOF EP EM = EM Détection CATHODE _ Capillaire

19 L électrophorèse capillaire de zone (CZE) L électrophorèse capillaire de zone est basée sur la migration différentielle d des espèces chargées, sous l effet d un champ électrique. Les analytes sont séparés selon leur rapport charge effective / rayon hydrodynamique et migrent vers le pôle de signe opposé. En CZE il n est pas possible de séparer les espèces neutres. Le choix d un tampon est primordial car de sa concentration (ou de sa force ionique) ainsi que de son ph dépendront les mobilités électrophorétiques et électroosmotiques,, et donc la rapidité et les performances des séparations. La CE en milieu nonaqueux aqueux: : le tampon est constitué d un ou plusieurs solvants organiques (MeOH( MeOH, AcN) ) auxquels on ajoute un sel (acétate d ammonium, acide acétique, TFA) pour assurer la conductivité du milieu. Ce type d analyse d s accompagne généralement d un gain significatif au niveau des sélectivités s et des efficacités. Les autres avantages sont la possibilité d effectuer r des séparations rapides (<1 min) par l utilisation conjointe de capillaires courts et de champs électriques élevés, le couplage à la spectrométrie de masse, la séparation de composés peu solubles et peu stables en milieu aqueux.

20 L électrophorèse capillaire de zone (CZE) μ ep anions μ ep N (= 0) μ ep cations + _ N N _ Ecoulement électroosmotique Réponse du détecteur Composés cationiques Composés neutres Composés anioniques Temps

21 L électrophorèse capillaire micellaire (MECK) Cette méthode est principalement destinée aux molécules qui ont tendence à migrer sans séparation (analytes neutres), mais aussi pour les composés chargés difficilement séparables. En mode micellaire, on ajoute dans la phase mobile un tensioactif f cationique ou anionique, tel le dodecylsulfate de sodium (SDS). Il se forme alors dans le tampon des micelles dont la partie intérieure possède un caractère hydrophobe. Ces micelles forment une pseudophase phase stationnaire. Le séparation des composés neutres se fait selon un mécanisme de partage du type hydrophile / hydrophobe.

22 L électrophorèse capillaire micellaire (MECK) m MC m MC m MC + EOF t 0 t R t MC

23 L électrophorèse capillaire chirale La séparation énantiomérique en CE Mode direct Séparation des énantiomères par addition d un sélecteur chiral dans l électrolyte Sélecteurs chiraux utilisés en CE Antibiotiques (rifamicine( rifamicine, vancomycine, teicoplanine,,...) Protéines (α( 1 AGP, BSA,...) A B C Sélecteur Chiral C A B C Enantiomères A B μ S μ R Formation de diastéréomères «insitu» Capillaire Ethers de couronne Cyclodextrines (CD) natives (αcd,( βcd, γcd) dérivées (2hydroxypropyl hydroxypropylβcd) chargées (sulfobutyléther( sulfobutylétherβcd) 1. Inclusion Cavité hydrophobe * O C CH CH O OH OH CH CH 3 N O C CH OH O 2. Interactions secondaires avec les substituants * N CH CH3

24 Les autres modes de l électrophorèse capillaire Electrochromatographie capillaire: : capillaire rempli d une phase e stationnaire chromatographique. Focalisation isoélectrique capillaire: : création au sein du capillaire d un gradient de ph croissant de l anode à la cathode à l aide d un mélange m d ampholytes. Electrophorèse capillaire sur gel: : le capilaire est rempli avec un électrolyte contenant un gel qui stabilise le milieu contre le phénomène de convection, limite la diffusion et joue le rôle d un tamis permettant aussi une séparation des molécules en fonction de leur taille. Isotachophorèse capillaire: : le capillaire est rempli avec plusieurs tampons de conductivités variables.

25 Applications 1. Identification et quantification des éphédrines dans l urine CH OH CH CH 3 N H CH 3 OH CH CH CH 3 N H CH 3 1: Ephedrine 2: Pseudoephedrine mau CH OH CH CH 3 NH 2 3: Norephedrine (phenylpropanolamine) N OH CH CH CH 3 NH 2 4: Norpseudoephedrine (cathine) CH min O OOCCH CH OH 2 Conditions: 260 mm Trisphosphate, ph=3.5, 13.3 mm DMβCD 30 kv (I=61 μa), 25 C, capillaire: 48.5 cm, 75 μm m i.d. UV directe à 195 nm 5: Scopolamine (SI)

26 Applications 2. Dosage des CDT (transférine déficiente en glucose) La transferrine déficiente en hydrate de carbone (CDT) Marqueur de l abus d alcool

27 Applications 2. Dosage des CDT (transférine déficiente en glucose) CDT Isoformes Val. réf. (#) Analyse d un échantillon de sérum d un patient par électrophorèse capillaire (CE) UV. Valeur des CDT : 8.7 % : mau Asialo ND (< 0.5 %) Monosialo ND (<0.9%) Disialo < 2.5 % Trisialo % Tétrasialo % Pentasialo % Hexasialo 1 3 % asialo disialo trisialo tetrasialo pentasialo hexasialo Heptasialo < 1.5 % 50 Octasialo ND Conditions: kit Ceofix CDT (Analis( Analis) 28 kv, 20 C, capillaire: 40 cm, 50 μm m i.d. UV indirecte à 200 nm Time [min]

28 Applications 3. Purification du GHB urinaire CH CH 2 CH 2 O OH mau DAD1 A, Sig=300,80 Ref=214,10 (050310\MK D) OH Gammahydroxybutyric Acid GHB min Conditions: 4 mm acide nicotique et 3mM Spermine,, ph= kv (I=61 μa), 25 C, capillaire: 48.5 cm, 75 μm m i.d. UV indirecte à 214 nm

29 Applications 4. Analyse des hémoglobines (humaine et synthétique) mau DAD1 A, Sig=415,30 Ref=off (050422\MK D) Hb A Globules rouges 40 Hb A min Conditions: kit Ceofix HbA 2 (Analis) 29 kv (I=80 μa), 25 C, capillaire: 36 cm, 25 μm m i.d. UV indirecte à 415 nm Hémoglobine humaine Oxyglobine (tétramère)

30 Applications 4. Analyse des hémoglobines (humaine et synthétique) mau DAD1 A, Sig=415,30 Ref=off (050422\MK D) Hb A 1 mau DAD1 A, Sig=415,30 Ref=off (070607\JB D) Hb A Oxyglobin 40 Hb A min min Conditions: kit Ceofix HbA 2 (Analis) 29 kv (I=80 μa), 25 C, capillaire: 36 cm, 25 μm m i.d. UV indirecte à 415 nm

31 Applications 5. Analyse chirale des amphétamines Amphétamine (A) Metamphétamine (MA) 3,4methylenedioxyamphétamine (MDA) 3,4 methylenedioxymetamphétamine (MDMA) Conditions: 100 mm Trisphosphate, ph=2.5, 25 mg/ml (2hydroxy hydroxy)propylβcd 30 kv, 25 C, capillaire: 64.5 cm, 50 μm m i.d. UV directe à 200 nm