Diversité génétique, variation antigénique, polymorphisme, échappement, enkystement au sein du monde bactérien

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1 L2-L3- Enseignements intégrés UE de l agent infectieux à l hôte Diversité génétique, variation antigénique, polymorphisme, échappement, enkystement au sein du monde bactérien Dr Sylvain Godreuil Département de Bactériologie-Virologie, Hôpital Arnaud de Villeneuve, CHU Montpellier 1 INSERM U1058 : «Infection par le VIH et par agents à tropisme cutanéo-muqueux: de la pathogenèse à la prévention» Faculté de Médecine de Montpellier

2 Objectifs : 1. Comprendre les différents aspect de la diversité phénotypique et génétique du monde bactérien 2. Savoir expliquer comment les mécanismes qui génèrent cette diversité chez les bactéries 3. Décrire comment cette diversité chez les bactéries a été exploitée pour lutter contre les maladies infectieuses bactériennes

3 PLAN: I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.1 Diversité phénotypique bactérienne I.2 Diversité génétiques des bactéries I.3 Polymorphisme des génomes et gènes conservés/auxiliaires I.4 Mécanisme à l origine de la diversité génétique bactérienne II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 1 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des bactéries pathogènes dans les prélèvement clinique II. 2 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des mécanismes de résistances aux antibiotiques II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire III. Points importants à retenir

4 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.1 Diversité phénotypique bactérienne Les progrès de l'analyse bactériologique et biochimique démontrèrent dans les années , l'existence de variations chez les bactéries: - aspect de la colonie - pigmentation de la culture - perte de la capsule (virulence) chez le pneumocoque - caractère de fermentation (lactose) -acquisition de la résistance à un antibiotique...

5 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.2 diversité génétiques des bactéries - L ensemble du polymorphisme phénotypique est liée à expression de l information contenue dans les gènes bactériens situé sur le chromosome et le/les plasmides.

6 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.2 diversité génétiques des bactéries L information génétique n a pu être que décrypté que grâce à la génomique et au séquençage des génomes bactériens Double hélice d ADN 1953 Code génétique 1966 Séquences nucléotidiques de gènes -séquence du bactériophage phix174 -virus singe SV40 -cytomégalovirus CMV Développement et projet politique de séquençage -projet de séquençage du génome humain - Europe : Saccharomyces cerevisiae / Bacillus subtilis -1 bactérie pathogène : Haemophilus influenzae

7 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.2 diversité génétiques des bactéries L information génétique n a pu être que décrypté que grâce à la génomique et au séquençage des génomes bactériens Séquenceur Séquence de l ensemble du gènome

8 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.2 diversité génétiques des bactéries - Comparer les différents génomes bactériens (> 500 génomes disponibles): Bactéries des humains, animaux, plantes, environnements Bactéries chez l home; espèces commensales vs pathogènes; différents isolats au sein d une même espèce Diversité génétique +++ Support de Diversité phénotypique -Pouvoir pathogènes -Virulence -Résistance aux antibiotiques -Variation de la réponse immunitaire de l hôtes envers la bactérie -..

9 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.3 Polymorphisme des génomes et gènes conservés/auxiliaires Absence de corrélation taille/virulence Chlamydia trachomatis 1040 kb Pseudomonas aeruginosas 6265 kb Taille génome corrélée à la niche écologique: -Certains bactéries se sont spécialisées dans une niche écologiques spécifique ex: Chlamydia trachomatis (1040 kb) : pathogène humain stricte = garder que les gènes adapté pour l homme - Certains bactéries des pathogènes opportunistes car Pseudomonas aeruginosas (6265 kb) ont une niche écologique environnementale donc la nécessité d avoir des gènes de survie en milieux extérieur + les gènes nécessaires à la pathogènicité chez l homme Taille génome corrélée nb de gènes codant Chlamydia trachomatis 1000 gènes Pseudomonas aeruginosas 5000 gènes

10 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.3 Polymorphisme des génomes et gènes conservés/auxiliaires La comparaison de génomes de bactéries d espèces différentes a mise en évidence: -des gènes conservés tout au long des générations «gènes de ménage» = nécessaire à survie et l évolution des espèce bactérienne ex: gène codant l ARNr 16S = traduction++ gène rpob, qui code pour la sous-unité bêta de la ARN-polymérase ADN-dépendante= transcrition+++ Gyrase;.. -Gènes variable: présent/absent avec des mutations une mutations = gènes Concept «espèce genomique» (Lan et Reeves) gènes conservés (gène core) gènes variables (gènes auxiliaires): Gènes transferts Phénotypiques Adaptation à une niche écologique

11 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien I.4 Mécanisme à l origine de la diversité génétique bactérienne? La comparaison des génomes bactériens d isolats d espèces différentes ou d une même espèce met en évidence un grand polymorphisme génétique entre ces isolats. 2 grands mécanismes sont à l origine de ce polymorphisme génétique: -Mutation génétique -Transfert latéral de matériel génétique exogène Mutation: Spontanée : pré-existante dans une population bactérienne Induite : rayonnements de type UV, substances chimiques Discontinue: apparait selon la loi du tout ou rien Stable : héréditaire. Rare : le taux moyen étant de l'ordre de Spécificité - Indépendance : la probabilité pour une bactérie : de subir simultanément deux mutations distinctes est le produit des probabilités individuelles de ces mutations. Modification de la structure du gène : silencieux ou modification de fonction Conclusion: Il s'agit d'un mécanisme mineur d'évolution bactérienne,

12 I. Généralités sur la diversité et polymorphisme phénotypique et génétique bactérien Transfert latéral de matériel génétique exogène: 4 mécanismes principaux -Transduction -Transformation -Conjugaison plasmidique -Transposons -Intégrons

13 Transduction 1 2

14 Transformation bactérienne Streptocoque commensal Streptococcus pneumoniae Pneumocoque à sensibilité diminuée au ATB protéines de paroi gènes codant pour protéines de paroi antibiotique (pénicilline)

15 D R Conjugaison plasmidique D bactérie donatrice R bactérie réceptrice chromosome plasmide

16 Transposon Gènes R T T Chromosome Plasmide Plasmide Gènes de résistance T transposases

17 Intégrons I P ADN Intégron Cassette de résistance

18 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 1 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des bactéries pathogènes dans les prélèvement clinique Patient avec signes d infection: quels bactéries est en cause? Prélèvements d échantillons cliniques: Ex: expectoration, liquide broncho-alvéolaire Envoie des échantillons aux laboratoire de microbiologie

19 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 1 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des bactéries pathogènes dans les prélèvement clinique Utiliser la diversité des caractéristiques phénotypiques des bactéries pour les identifier -Utilisation de la diversité de ces propriétés: - Identifier la forme de la bactérie: cocci ou bacille - fixation de colorant: Gram + ou Gram - Diversité de la composition de la paroi détermine: - forme bactérie - fixation de colorant

20 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 1 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des bactéries pathogènes dans les prélèvement clinique Utiliser la diversité des caractéristiques phénotypiques des bactéries pour les identifier Utilisation de la diversité de ces propriétés: - Orientation d identification d espèce bactérienne sur milieu de culture: -capacité d hydrolyser le lactose ex: E.coli, Enterobacter - Hydrolyse des globules rouges sur milieux au sang ex: Staphylocoque doré -Identification définitive d espèces basée sur un profil biochimique spécifique d une espèces bactérienne, ex: Api20E = galerie biochimique permettant d identification des entérobactéries Diversité des propriétés biochimique des bactérie: - Capacité à hydrolyses des sucres, des acides aminés

21 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 1 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des bactéries pathogènes dans les prélèvement clinique Utiliser la polymorphisme spécifiques d espèce au sein des gènes conservé pour l identification moléculaire d espèces bactérienne Définition d une espèce bactérienne: -Sur la séquence des gènes codant pour ARNr 16S - Gènes présents chez tous les micro-organismes -Séquence d ADN de ce gène est très conservée au sein des espèces (plus de 99 %) - Cette conservation de séquence permet d utiliser cette région pour la détermination des espèces bactériennes -Selon les différents auteurs, le degré d homologie entre deux bactéries pour qu elles appartiennent à la même espèce doit être supérieur à 97 %, voire 99 %.

22 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 1 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des bactéries pathogènes dans les prélèvement clinique Utiliser la polymorphimse spécifiques d espèce au sein des gènes conservé pour l identifation moléculaire d espèces bactérienne Gène ARNr 16S Région conservée chez Région conservée spécifique d espèce toutes espèces bactériennes Application du gène ARNr 16S par PCR avec des amorces universelles Espèces bactérienne???? Homologie de séquence > 99% avec E.coli = bactérie = E.coli Séquençage de la région conservée spécifique et comparaison au banques de séquence ex : GenBank

23 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 2 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des mécanismes de résistances aux antibiotiques Rappelle de la structure des bactéries Gram + Mode action de 2 familles antibiotiques majeurs actifs contre les bactéries à Gram+ Mécanismes de résistance développés par les bactéries pour échapper aux antibiotiques: -Résistance à toutes les beta-lactamines chez le Staphylocoque doré = méticillinorésistance -Résistance en glycopeptides chez les enterocoques Utilisation de la diversité phénotypique pour détecter les bactéries résistantes = antibiogramme Utilisation la diversité génétique pour détecter les gènes conférant à la résistance aux antibiotiques

24 Structure de la paroi bactérienne Porine Peptidoglycane Lipopolysacharides Phospholipides Periplasme Membrane cytoplasmique Cytoplasme GRAM + GRAM -

25 NacGlc Pyruvyltransférase Mode action des antibiotiques D-alanine Carboxypeptidase UDP D-Ala D-Ala ligase UDP Transpeptidase Gly(5) Gly(5) Protéines liant les pénicilline (PLP) Gly(5) Glycotransférase Cytosol Membrane Paroi

26 NacGlc Mode action des antibiotiques des béta-lactamines Pyruvyltransférase D-alanine UDP D-Ala D-Ala ligase UDP Gly(5) Protéines liant les pénicilline (PLP) Gly(5) Gly(5) Béta-lactamines Cytosol Membrane Paroi Synthèse par le gène meca acquis de nouvelles PLP non reconnues par béta-lactamines

27 NacGlc Pyruvyltransférase Mode action des glycopeptides D-alanine Carboxypeptidase UDP D-Ala D-Ala ligase UDP Transpeptidase Gly(5) Gly(5) Gly(5) Glycopeptides Glycotransférase Cytosol Membrane Paroi

28 Pyruvate VanH D-lactate VanB Acquisition d un nouveau gènes (vana, B, C ) qui détermine la synthèse de nouveaux monomères de peptidoglycane non reconnus par les glycopeptides Ddi VanX Carboxypeptidase UDP UDP Transpeptidase VanY Gly(5) Gly(5) Glycotransférase D-lactate D-alanine Acide aminé Pentaglycine Glycopeptides N-acéthylglucosamine Cytosol Membrane Paroi Acide muramique

29 Détection diversité phénotypique S.aureus pour la résistance aux beta-lactamines OXA-R hétérogène OXA-S OXA-R homogène R contact au disque d oxacilline 5 μg

30 Vancomycine VA (30 μg) Teicoplanine TE (30 μg) Phénotype Génotype VA : S réduite TE : S vanc1/c2-3 VA : R TE : S vanb VA : R TE : R vana Détection de la diversité phénotypique chez enterococcus pour la résistance aux glycopeptides

31 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II. 2 Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique pour l identification des mécanismes de résistances aux antibiotiques Utilisation la diversité génétique pour détecter les gènes conférant à la résistance aux antibiotiques

32 Méthodes de détection des SARM - Milieux de culture sélectifs (OXA, FOX) +/- chromogènes mais vérifications souvent nécessaires Ex : MRSA ID (biomérieux) Céfoxitine 4 mg/l MEE α-glucosidase S. aureus - Détection rapide de la PLP2a : technique agglutination (particules sensibilisées AC anti-plp2a) ou immunochromatographique Contrôle Test Ex : Clearview Exact PBP2a (Alere) - Approche moléculaire : T+ M T- amplification du gène meca par PCR (sur culture ou directement sur échantillons biologiques - couplée à l identification)

33 Enterococcus faecalis vana Milieu MH Amplification des gènes ddl et van par multiplexpcr E. faecalis vana vanb E. faecium CMI Vanco : >256 CMI Teico : 128

34 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Qu est ce que l épidémiologie moléculaire: -consiste à intégrer des techniques de biologie moléculaire aux approches épidémiologiques conventionnelles basées sur les enquêtes autour des cas. -comprendre la dynamique de transmission et améliorer le contrôle de cette maladie -Epidémiologie moléculaire donne une «carte d identité» pour chaque isolat bactérien = différencier les souches entre elles. -Lutter contre les maladies infectieuses : en identifiant et suivant la source de l infection -L épidémiologie moléculaire permet d'identifier des facteurs de risque liés à la transmission -Surveiller l émergence, la dissémination, et d'identifier l origine de l émergence de souches ayant des propriétés infectieuses spécifiques, de transmissibilité et de virulence ou de résistance aux antibiotiques.

35 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Quels sont les outils en épidémiologie moléculaire = «carte d identité» génétique de chaque isolats Quels sont les qualités requises d un marqueur d épidémiologie moléculaire: -La typabilité: est la capacité à obtenir un résultat positif, non-ambigu pour chaque souche ; -La reproductibilité est la capacité de la méthode à donner le même résultat lorsque la même souche est testée plusieurs fois -Le pouvoir discriminant est la capacité à différencier différentes souches non apparentées. Idéalement, une méthode de typage identifiera chaque souche comme unique. Pratiquement, la méthode peut être considérée comme utile lorsque la probabilité que deux souches non apparentées appartiennent au même type soit inférieure à 5 %. Plus le pouvoir discriminant augmente, plus la méthode est capable, par définition, de détecter des variations minimes ou moins fréquentes.

36 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Sur quel polymorphisme génétique s appuie les différents outils d épidémiologie moléculaire Séquençage complet du génome: le plus discriminant +++, impossible encore car trop cher (si nombre d isolats +++) Séquence du Séquençage d un gène = comparaison des séquences gène X de la souche 1 ACTGGTCATTGA - très fiable et reproductible IIII IIII II - n étudie qu une partie réduite du génome ACTG-TCATCGA - de moins en moins coûteux Profils de fragments d ADN (enzymes de restriction / PCR) Séquence du gène X de la souche 2 -Principe général: générer un profil de bandes d ADN spécifique du génome d une souche comme «code barre» = «carte d identité génétique permettant la comparaison de profils entre souches. - A et B : profil identique B et C : profil différent + A B C

37 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Profils de fragments d ADN (enzymes de restriction / PCR): - Ex: le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) -Ex: l'électrophorèse en champ pulsé

38 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses RFLP-IS6110 pour Mycobacterium tuberculosis - Basée la polymorphisme d une séquence insersion en nombre et en localisation variable dans le génome IS6110 Digestion de l ADN par enzyme de restriction Souches A B C Hybridation : sonde spécifique IS6110 marquée Souches A B C Dépôt de l ADN restreint + séparation par électrophorèse

39 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses l'électrophorèse en champ pulsé Digestion de l ADN l par des enzymes de restriction à sites de coupure rares bactérie à faible GC% peu de fragments d ADN d mais de haut poids moléculaire choix de l enzyme l en fonction de ll espèce (GC% du génome g de la bactérie) Migration par des pulses électriques alternatifs (matériel spécialisé) Intérêts : Fragments de 20 à > 1000 kb Profils faciles à lire (10-20 bandes) et reproductibles Comparaison inter-laboratoires possible Standardisation (systèmes automatisés) s) Evaluation du degré de parenté entre souches (analyse de la diversité génétique d une d population bactérienne) Comme beaucoup de technique d épidémiologie moléculaire, on utilise la diversité du génome des différèrent isolats bactériens pour comparer «le code barre = carte d identité génétique» de chaque isolats entre eux

40 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses MIRU-VNTR (Mycobacterium Interspersed Repetitive Unit- Variable number of Tandem Repeat) Identification d espèce au sein CMTB Banque SpolDB4 :Beijing, Haarlem, LAM, T, X, CAS, EAI

41 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèces bactérienne: l épidémiologie moléculaire Utilisation de la diversité génétique pour l épidémiologie moléculaire 1. Banque de données internationales de génotypes («carte d identité génétique» d isolats bactériens permettent: - Etudier la circulation des pathogènes dans les différentes partie du monde - Dépister l émergence de nouveaux clones ou la réémergence d anciens clones de pathogènes bactériens - Mettre en évidence des facteurs de risques associées à la transmission ou à l infection par des pathogènes bactériens 2. Au niveau régionale ou locale l épidémiologie génétique des isolats bactériens permets: - Identifier une épidémie dans un pays - Identifier une épidémie nosocomiale dans une structure de soins (ex: épidémie nosocomiale à Pseudomonas aeruginosa associée à un fibroscope pulmonaire défectueux - Identifier une contamination intrafamiliale (transmission père/fille d une tuberculose à Mycobacterium bovis

42 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Illustration de l utilisation de la diversité phénotypique et génotypiques bactérienne pour identifie une épidémie nosocomiale à Pseudomonas aerugina Entre Janvier et Avril 2003, une augmentation soudaine des infection respiratoires à Pseudomonas aeruginosa a été observée dans une unité de soins intensifs de l'hôpital Universitaire de Montpellier Les souches ont été cultivées à partir d'échantillons issus liquide de lavage bronchoalvéolaire (LBA) suggérant que les procédures endoscopiques pourraient être impliqués dans l infection. les relations entre les isolats bactérien ont été étudiés par un marqueur phénotypique (antibiogramme) et moléculaire (électrophorèse en champ pulsé) Les deux marqueurs phénotypiques et moléculaires ont permis d'identifier 2 épidémies nosocomiales consécutifs d'infections respiratoires liée à deux bronchoscopes différents. L'inspection des deux bronchoscopes a montré des défaut de pince à biopsie générant une mauvaise désinfection de ces derniers ayant permis aux P. aeruginosa de se developper et contaminer chaque patient au moment de leur fibroscopie. Cette exemple montre l intérêt d utiliser de la diversité phénotypique et moléculaire des bactéries pour faciliter la détection des épidémies et la source de ces épidémies.

43 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Confirmation par l épidemiologie moléculaire d une contamination intrafamiliale par Mycobacterium bovis En 2004, un homme de 50 ans, développe une tuberculose pulmonaire liée à Mycobacterium bovis agent la tuberculose bovine qui peut se transmettre à l homme. L homme travaille dans des abattoirs en contact avec des bovins potentiellement contaminés par M.bovis En 2007 la fille de l homme de 50 ans développe à son tour une tuberculose pulmonaire liée M.bovis Les 2 souches de Mbovis (l homme et de sa fille) sont comparées pour 2 méthodes d épidémiologie moléculaire spécifiques pour les bacilles de la tuberculose (spoligotyping et les mycobacterial interspersed repetitive units containing variable-number tandem repeats (MIRU-VNTR). Sur la base des deux marqueurs, les 2 souches bactériennes présentent les mêmes «cartes d identité génétique» confirmant la transmission interhumaine entre le père et la fille. Cette exemple montre l intérêt d utiliser de la diversité génétique des bactéries pour faciliter la détection de la transmission et la source de ces épidémies.

44 II. Utilisation de la diversité phénotypique et génotypique bactérienne dans la lutte contre les maladie infectieuses II.3 Utilisation de la diversité génétique pour comparer des isolats du même espèce bactérienne: l épidémiologie moléculaire Confirmation par l épidemiologie moléculaire d une contamination intrafamiliale par Mycobacterium bovis

45 III. Points importants à retenir Connaître les mécanismes génétiques qui génèrent la diversité bactérienne: mutation et transfert génétique horizontaux (transduction, conjugaison, transformation) Savoir décrire comment la diversité bactérienne a été utilisé pour améliorer la lutte contre les maladie infectieuse: identification espèces, des résistance aux antibiotique et les base l épidémiologie moléculaire 2 articles illustrant l intérêts de l épidémiologie moléculaire sont sur le site du LIPCOM