L hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeur comme marqueur en cancérologie

Transcription

1 L hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeur comme marqueur en cancérologie Florence de Fraipont UF Cancérologie Biologique et Biothérapie, pôle de Biologie, CHU Grenoble

2 Définitions Méthodes d analyse Application à la cancérologie

3 Altérations épigénétiques Modifications transmises au cours des divisions cellulaires, modulant l activité du génome sans affecter sa séquence nucléotidique. Ces modifications sont en général reprogrammables selon le type cellulaire Il existe deux grands types de modifications épigénétiques: - au niveau des histones: acétylation, méthylation, phosphorylation (code des histones) - au niveau de l ADN: méthylation des cytosines

4 Méthylation de l ADN au niveau des cytosines des dinucléotides CpG S-Adenosyl-Méthionine Déméthylase

5 ADN-méthyltransférases de mammifères : le tandem Dnmt1/Dnmt3 N NLS TS I III V VII II maintenance IV VI VIII IX X C Dnmt1 N C Dnmt3a/b de novo NLS: Séquence de localisation nucléaire PBHD: Polybromo-domaine TS: Séquence d adressage aux fourches de réplication

6 Les dinucléotides CpG 20% des dinucléotides CpG statistiquement attendus sont réellement présents dans le génome des mammifères des régions de quelques centaines de paires de bases échappent à cette déplétion: il s agit de régions riches en CpG appelées îlots CpG. Les îlots CpG ne sont pas répartis au hasard dans les génomes mais se trouvent préférentiellement dans les régions promotrices et/ou au niveau du 1 er exon de 60% des gènes

7 Méthylation de l ADN et régulation de la transcription Répression directe de la transcription Promoteur Séquence codante Ilot CpG Cytosine Méthylation Pas de méthylation Facteurs de transcription

8 Répression indirecte de la transcription via les MBD (Methyl-Binding Proteins) La liaison des MBD sur l ADN méthylé permet de recruter les HDAC, entraînant la désacétylation des histones et par conséquent le maintien d une structure condensée de la chromatine réprimant la transcription

9 Définitions Méthodes d analyse: - directes -après traitement au bisulfite de sodium Application à la cancérologie

10 Méthodes directes d analyse de la méthylation Anticorps anti-5méthylcytosine donnant un image du taux de méthylation au niveau tissulaire Par digestion enzymatique avec des enzymes de restriction sensibles à la méthylation comme les enzymes HhaI, HpaII et MspI et analyse par southern-blot ou PCR...ATAGCGCTA... HhaI... ATAGCG + CTA......ATAGmeCGCTA... HhaI... ATAGmeCGCTA...

11 X? HhaI X 1) Southern Couper X+HhaI,hybrider 2) PCR Couper HhaI,amplifier Non Mixte Non meth. Mixte

12 1 ère méthode mise au point Relativement rapide Nécessitant de grandes quantités d ADN pour l analyse par southern-blot Seuls les CpG localisés au niveau de sites de restriction peuvent être analysés

13 Par traitement au bisulfite de sodium suivi d une analyse par PCR ou séquençage Principe du traitement au bisulfite de sodium: Cytosine Uracil Déamination 5-meCytosine 5-meCytosine Non réactif

14 MSP (Methylation-Specific-PCR) 5 -CCCGCGCATCCAGCTTCG-3 Bisulfite de Sodium (1) Si ADN méthylé (2) Si ADN non méthylé 5 -UUCGCGUATUUAGUTTCG-3 Amplification PCR Couple d amorces spécifiques (M) 5 -UUUGUGUATUUAGUTTUG-3 Amplification PCR Couple d amorces spécifiques (U)

15 Méthode rapide, sensible Amorces choisies dans une régions avec plusieurs CpG pour avoir une hybridation spécifique Méthode qualitative sans information pour chaque cytosine. Il existe une variante quantitative en utilisant deux amorces fluorescentes de type TAQMAN en une analyse par PCR quantitative en temps réel (MethylLight) Ne permet pas de vérifier si le traitement au bisulfite de sodium est complet

16 Séquençage Après traitement au bisulfite de sodium, l ADN de la région à analyser est amplifié par PCR et le produit de l amplification est purifié puis séquencé

17 Technique relativement longue à mettre en œuvre Sensible Donnant une information qualitative pour chaque cytosine susceptible d être méthylée

18 Pyroséquençage (4 grandes étapes) Amplification par PCR de la région à analyser en présence d une amorce biotinylée purification des brins biotinylés grâce à des billes recouvertes de streptavidine hybridation d une amorce de séquençage

19 Réaction de séquençage: Light PPi ATP Time

20 Exemple de pyrogramme: analyse du gène MGMT Séquence à analyser: T/CGTTTTGT/CGTTTT/CGAT/CGTTT/CGTAGG Histogramme théorique A T C A G 5 T T G T C 10 A G T C T 15 G A T C A 20 G T C A G 25 T C G A B 9 : T / C G T T T T G T / C G T T T T / C G A T / C G T T T / C G T A G G 1% 2% 2% 1% 2% E S A T C A G 5 T T G T C 10 A G T C T 15 G A T C A 20 G T C A G 25 T C G A B 1 : T / C G T T T T G T / C G T T T T / C G A T / C G T T T / C G T A G G 97% 82% 100% 84% 100% E S A T C A G 5 T T G T C 10 A G T C T 15 G A T C A 20 G T C A G 25 T C G A

21 Technique sensible, rapide, permettant l analyse d un grand nombre d échantillons en même temps Permettant de contrôler l étape de traitement au bisulfite et donc d éliminer de faux positif dus à un traitement incomplet Plusieurs groupements CpG peuvent être analysés de façon quantitative Technique permettant de vérifier si le traitement au bisulfite de sodium est complet

22 Définitions Méthodes d analyse Application à la cancérologie: - facteur diagnostique et/ou pronostique? - pharmacogénomique - thérapie épigénétique

23 Méthylation et carcinogenèse 1 ère observation (début des années 80): diminution globale du taux de méthylcytosine dans les cellules cancéreuses. Elle est particulièrement importante au niveau des séquences satellites péricentromériques et des séquence répétées (LINE1) pouvant prédisposer l ADN à des cassures et des remaniements Hyperméthylation des îlots CpG au niveau de la région promotrice de gènes suppresseurs de tumeur. Cette hyperméthylation est corrélée à une inhibition de la transcription des gènes

24 Les gènes suppresseurs de tumeur sont impliqués dans des fonctions essentielles pour la cellules comme le contrôle du cycle cellulaire (Rb, p16, p15, p14), la réparation des dommages à l ADN (O6-MGMT, hmlh1), l apoptose (DAPK, CASP8) ou la migration (E-CAD, TIMP3) Méthylations détectées au niveau tumoral mais également dans les lésions précancéreuses: c est un évènement précoce au cours de la cancérogenèse

25 Hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeur fréquente dans de nombreux cancers D après Esteller et al., 2001

26 Méthylation et pharmacogénomique: application au traitement des gliomes Bien que rares, les tumeurs cérébrales primitives constituent la 3 ème cause la plus fréquente de mort par cancer des 15-35ans du fait de la résistance aux thérapeutiques classiques Les astrocytomes malins sont des tumeurs de très mauvais pronostic avec pour les grade IV une survie ne dépassant pas 1 an Un nouveau traitement basé sur un agent alkylant pénétrant la barrière hémato-encéphalique, le témozolomide, augmente significativement la survie de 10 à 20% des patients

27 MGMT (méthylguanine méthyltransférase) serait associée à une certaine résistance tumorale de par son effet d excision des groupes alkyles de la position O 6 de la guanine D après C. Paus et al., 2007 MGMT est fréquemment méthylé dans différents types de cancer dont les gliomes

28 Les patients porteurs d une tumeur où MGMT est réprimé par méthylation présente une survie prolongée (46% à 2 ans alors qu elle n est que de 14% lorsque MGMT n est pas méthylé) MGMT est le premier facteur moléculaire prédictif de la réponse à la chimiothérapie avec un agent alkylant

29 Thérapie épigénétique Développement de molécules inhibitrices des méthyltransférases (DNMT) et des histone-désacetylases (HDAC) La 5-azacytidine, la 5-aza-2 -desoxycytidine (decitabine) et leurs analogues sont des inhibiteurs des DNMT Analogues des pyrimidines, elles sont incorporées et l ADN et forment des complexes covalents avec les DNMTs qui sont ainsi inactivées Azacitidine et décitabine font l objet d études clinques de phase I à III essentiellement pour les tumeurs hématologiques

30 Inhibiteurs des DNMT pour le traitement des syndromes myélodysplasiques Syndrome myélodysplasique est une atteinte clonale de la cellule souche hématopoïétique qui entraîne une cytopénie Capable de se transformer en leucémie myéloïde chronique (patient à haut risque) Traitement symptomatique lié à la cytopénie Traitement avec de l azacitidine ou de la décitabine augmente significativement la survie et la qualité de vie des patients traités par rapport à ceux ne recevant qu un traitement symptomatique