WASSELIN Thierry, BARTHELEMY Nicolas

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1 Journée des Doctorants IPHC, 12/02/ m/z WASSELIN Thierry, BARTHELEMY Nicolas Directeur: VAN DORSSELAER Alain Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-Organique Institut Pluridisciplinaire Hubert CURIEN IPHC-DSA, ULP, CNRS, UMR 7178 ECPM- 25, rue Becquerel F STRASBOURG

2 Introduction à la protéomique omique Le postulat : Genome Transcriptome Protéome ome ADN Transcription ARN Traduction Protéines On a longtemps pensé que connaitre le génome g c éc était connaitre tous les mécanismes m du vivant Course au séquens quençage des génomesg

3 Humain : environ gènes Genes Augmentation de la complexité Transcription Epissage alternatif de l ARN Traduction Modifications post traductionelles Proteines Humain : environ 1 million de protéines

4 Augmentation de la complexité après s la traduction : Modifications post-traductionelles traductionelles Processing Phosphorylations Glycosylations Et bien d autres d

5 Un génome g différents protéomes omes!

6 Etudier le protéome ome c est : Etudier l ensemble l des protéines produites par un génomeg Identifier : quelles sont les protéines? Caractériser riser : comment sont-elles modifiées? Quantifier : quelles quantités s sont exprimées es? Répondre à ces questions dans des contextes : d espace, de temps, d états physiologiques

7 Comment accéder à ces informations? Outil de choix : la spectrométrie trie de masse Spectromètre tre Source Echantillon liquide Transfert liquide/gaz Ionisation Analyse des ions Mesure m/z

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11 Acquisition données MS Analyseur de masse 1 Cellule de collision Analyseur de masse 2 Spectre MS

12 Acquisition données MS/MS Analyseur de masse 1 Cellule de collision Analyseur de masse 2 Spectre MS/MS

13 Peptide sequence : Fragmentation G D T E V S Y L V I R Masse du précurseur + Liste de masses de fragments

14 Confrontation des données expérimentales aux données théoriques Liste de masses expérimentales 546,45 789,67 876,43 987,49 999, , , , , , ,22 576,32 516,90 634,79 612,75 752,93 879,89 999, , , , , ,44 678,09 712,43 750,09 812,34 933,66 978, , , , , , , ,55 Données expérimentales Genome sequence Algorithme de prédiction des gènes Banques protéiques Données théoriques MGHIDCKMLIEDMLKPI CEKOIUDCGIEKCKIIE MGHIDCKMLIEDMLKPI CKKKEGQNLEIIUKNDS CEKOIUDCGIEKCKIIE MGHIDCKMLIEDMLKPI YCIQNZYDCSQLSDCID CKKKEGQNLEIIUKNDS CEKOIUDCGIEKCKIIE TNQCLODLCQBKKOF YCIQNZYDCSQLSDCID CKKKEGQNLEIIUKNDS TNQCLODLCQBKKOF YCIQNLYDCSQLSDCID TNQCLODLCQIKKOF Comparaison Algorithmes de recherche digestion et fragmentation In silico 546,45 789,67 876,43 987,49 999, , , , , , ,22 576,32 516,90 634,79 612,75 752,93 879,89 999, , , , , ,44 678,09 712,43 750,09 812,34 933,66 978, , , , , , , ,55 Listes de masses théoriques Identification

15 Instruments utilisés ESI Trappe (HCT) Couplage LC-MS/MS ESI Q-TOF (Synapt HDMS) Différents instruments pour différentes applications, (précision, résolution, sensibilité, rapidité) ESI Q-TOF (MicroQTOF) ESI Q-TOF (MaXis)

16 Caractérisation avec absence du génome de l espèce étudiée dans les banques Projet VTG en collaboration avec le DEPE La vitellogénine (VTG) joue un rôle dans la reproduction des espèces ovipares et peut être un indicateur du statut reproducteur de ces espèces. Il s agit de développer un test ELISA et/ou western blot pour quantifier la VTG présente dans le plasma nécessite la production d anticorps nécessite de déterminer précisément la séquence de la VTG

17 Stratégie d analyse MW Gel 1D Nano-LC-MS/MS Séparation des protéines H G F Enzymes Extraction 1. Recherche dans Banque protéique 1. Découpe au scalpel de l œuf 2. Élimination du blanc 3. Prélèvement du jaune E D C B des peptides 2. Séquençage de novo Extraction 36 A Séparation Analyses par spectrométrie de masse Identification des protéines et Détermination des séquences 1. Recherche dans banque protéique 2. Séquençage de novo VYSIEAAEYNGIGEPR GLPEPGLARAGL I G N Y E A A E I S

18 La quantification en protéomique : Etude différentielle Jeûne prolongé et réponse musculaire P1 P2 P3 P1 : Mobilisation des réserves glucidiques P2 : Forte mobilisation des lipides Body mass P3R P3 : Utilisation des protéines Days P3R : Réalimentation Identifier les étapes des voies métaboliques qui sont affectées dans ces situations

19 La quantification en protéomique : Etude différentielle FED P2 P3 P3R broyage, précipitation des protéines Séparation des protéines par gel 2D Analyse des images des gels Détermination des spots différentiels Fed P2 P3 P3R

20 La quantification en protéomique : Etude différentielle Exemple d une protéine impliquée dans le jeûne Excision du spot digestion, extraction des peptides Analyses LC-MS/MS Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 Séparation chromatographique (LC) Acquisition MS et sélection des ions à fragmenter Spectre de fragmentation d un ion sélectionné Identification de voies métaboliques affectées dans le jeûne prolongé : métabolisme des glucides, production et conversion de l énergie

21 VENEZ NOUS VOIR SI Vous voulez faire de l analyse de protéines par masse? Vous voulez faire des gels 1D et 2D de protéines? Danièle Thiersé et Chrystel Husser pourront vous aider Mesure de masse? MALDI-MS, GC-MS, ESI-MS, LC-MS Venez voir Jean-Marc Strub et Christine Schaeffer

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