UNIVERSITE BORDEAUX 1 ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DU VIVANT, GEOSCIENCES ET SCIENCES DE L ENVIRONNEMENT. Pour obtenir le grade de DOCTEUR

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1 N d ordre : 3265 THESE UNIVERSITE BORDEAUX 1 ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DU VIVANT, GEOSCIENCES ET SCIENCES DE L ENVIRONNEMENT Présentée par Kévin CAILLEAUD Pour obtenir le grade de DOCTEUR Spécialité : ECOTOXICOLOGIE Utilisation du copépode Eurytemora affinis pour étudier l écodynamique et les effets biologiques des principaux contaminants organiques (PCB, HAP, Alkylphénols ) en estuaire de Seine Soutenue le 22 Novembre 2006 Après avis de : M Laurent. LAGADIC, Directeur de recherche, INRA Mme Claude CASELLAS, Professeur, Université Montpellier2 Devant la Commission d examen formée de : M Laurent LAGADIC, Directeur de Recherche, INRA Rapporteur Mme Claude CASELLAS, Professeur, Université Montpellier2 Rapporteur M Alain BOUDOU, Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur M Louis Alexandre ROMANA, Directeur de Recherche, IFREMER Examinateur Mme Hélène BUDZINSKI, Directeur de Recherche CNRS, Bordeaux 1 Directeur de thèse Mme Joëlle FORGET-LERAY, Maître de Conférence, Université du Havre Responsable scientifique M Sami SOUISSI, Maître de Conférence, Université Lille 1 Responsable scientifique

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3 "Soyez réalistes : demandez l impossible" Ernesto Rafael Guevara de la Serna I

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5 Avant propos Bien que ce genre d exercice n est probablement pas celui dans lequel je suis le plus à l aise je tiens néanmoins à écrire ces quelques mots pour remercier tous les gens que j ai eu la chance de rencontrer avant ou bien au cours de cette thèse et qui m ont permis d atteindre mes objectifs. Pour commencer, j aimerai remercier l ensemble des personnes qui ont accepté de participer à ce jury de thèse. Je remercie Madame Claude Casellas, Professeure à l Université Montpellier 2, et Monsieur Laurent Lagadic, Directeur de recherche à l INRA, pour m avoir fait l honneur d accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs et de l avoir fait dans un délai de temps très réduit. Je tiens également à remercier Messieurs Alain Boudou, Professeur à l Université Bordeaux I et Louis Alexandre Romana, Directeur de recherche à Ifremer de m avoir accordé un peu de leur temps pour participer à ce jury de thèse. Merci également à monsieur Romana qui est à l origine de cette thèse puisqu il a défendu notre projet et qu il a accepté de le financer lorsqu il dirigeait le programme Seine-Aval. J aimerai remercier les différents directeurs de laboratoire qui ont accepté de m accueillir dans leur laboratoire : le Professeur François Leboulenger du LEMA, le Professeur Jean-Claude Dauvin de la station marine de Wimereux, Philippe Garrigues, Directeur de recherche CNRS puis Hélène Budzinski, Directeur de recherche CNRS au LPTC. Pendant ces quatre années, j ai eu la chance de travailler avec des spécialistes dans différentes thématiques de recherche et dans des atmosphères très variées. A ce titre, je tiens à remercier Hélène Budzinski, Sami Souissi et Joëlle Forget-Leray, qui ont codirigé ces travaux de thèse, pour m avoir permis d explorer un champ de recherche si riche. En premier lieu, je te remercie Hélène de m avoir fait confiance en acceptant de m encadrer d abord en DEA puis en thèse, à un moment où pas grand monde aurait misé quelque chose sur moi. C est avec toi que j ai réellement découvert le monde de la recherche scientifique. C est également toi qui m as transmis la rigueur nécessaire pour mener à bien une étude scientifique. Pour toutes ces choses je te remercie sincèrement. J aimerai associer à ces remerciements les "indispensables" du LPTC Karine LeMenach Laurent "Lolo" Peluhet et Jacqueline Bellocq qui a depuis pris sa retraite, pour leurs conseils et leur aide très précieuse. Je tenais également à remercier Sylvie Augagneur et Sophie Lardy pour leur aide. Merci Sami pour ton accueil à la station marine et pour ton soutien tout au long de ma thèse. Cela aura été un véritable plaisir de travailler ensemble aussi bien du point de vue scientifique que du point de vue humain. Mon séjour à la station marine restera inoubliable, pas tellement pour les longues soirées d hiver, mais plutôt pour les rencontres avec les chercheurs du monde entier et pour les échanges pas seulement scientifiques mais également culturels qu elles ont suscité. Merci également au docteur François Schmitt pour son aide et ses conseils sur l analyse des séquences vidéo pour le comportement natatoire des copépodes. Enfin, je voulais terminer en remerciant celle qui est à l origine de cette thèse, Joëlle Forget-Leray. Nous travaillons ensemble depuis la fin de mon DEA et pendant toutes ces années tu m as toujours fait confiance, tu m as toujours soutenu et à mes yeux c est vraiment quelque chose d important. Pendant ma thèse, tu as été très présente tout en me laissant une grande liberté d action ce qui tu le sais est vraiment important pour moi. Tu m as également donner la chance de beaucoup voyager en m envoyant dans de nombreux congrès. Au cours de toutes nos discussions, scientifiques et autres, nous avons toujours été très honnêtes et je pense que c est l une des raisons pour lesquelles nous nous sommes si bien entendu. J ai fait III

6 ce métier par ce que je l avais choisi et pour toutes les raisons que j ai cité précédemment si j ai encore envie de continuer c est en partie grâce à toi, merci joëlle. J aimerai également remercier mamie Agnès, une autre "indispensable" du LEMA. Je tiens également à remercier ici le docteur Pascal Cosette du laboratoire PBM UMR 6522 de l Université de Rouen pour son aide et ses conseils concernant la protéomique et plus particulièrement l identification des protéines. Merci à tous mes amis qui m ont soutenu pendant ces années : Stéphane et Julie et leurs deux petits, Hina et Téau. Merci à Outman et à Vivier. Merci à mes cousins Sandie et François qui ont facilité mon adaptation à la vie bordelaise et qui m ont permis de me changer les idées. Merci également à tous mes amis rencontrés dans les différents labo dans lesquels je suis passés : Jérome le roi de la mauvaise foi (merci pour le jus d orange!), Géraldine et Hélène de feue la copépode team, Périnne (championne de France c est pas rien), Xavier (pas encore champion de France), Céline, Matthieu et Rich (la vérole) pour le LEMA, David, Annabelle, Gaëtan, Catherine, Juan, Fernando et Gaël pour Wimereux et Emilie, Pipa, Pipo, Ana au LPTC. Merci à Pierre, un jour j espère nous travaillerons ensemble en France. Merci à ceux avec qui j ai partagé le bureau pendant ces quelques années, Joëlle, Fab et Julie. Merci à tous les occupants actuels ou passés du mythique bureau B004, Christophe, Renaud, Jérome Ca. et Jérome Co. Enfin je terminerai en remerciant ma famille et plus particulièrement mes parents et ma sœur parce qu ils ont été là à tous les moments et qu ils seront toujours là quoi qu il arrive et c est probablement ce qui compte le plus. J associe bien évidemment Greg à ces remerciements qui avec ma sœur nous ont apporté notre petit Elouan. IV

7 Sommaire Sommaire Liste des abréviations...ix Liste des figures...xi Liste des tableaux... XV Introduction...1 Chapitre 1 : Synthèse bibliographique...9 I. La qualité de l eau I.1. Les critères de qualité I.2. La contamination chimique II. Les contaminants organiques étudiés II.1. Les Polychlorobiphényles II.1.1. Réaction de synthèse et structure chimique II.1.2. Propriétés physico-chimiques et utilisation des PCB II Les PCB dans l environnement II.1.4. Toxicité II.1.5.Réglementation II.2. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques II.2.1. Structure chimique et source des HAP II.2.2. Propriétés physico-chimiques II.2.3. Les HAP dans l environnement II.2.4. Toxicité II.2.5. Réglementation II.3. Les alkylphénols polyéthoxylés II.3.1. Réaction de synthèse et structure chimique II.3.2. Propriétés physico-chimiques II.3.3. Les alkylphénols dans l environnement II.3.4. Toxicité V

8 Sommaire II.3.5. Réglementation II.4. Les Pesticides II.4.1. Structure chimique II.4.2. Propriétés physico-chimiques II.4.3. Les pesticides dans l environnement II.4.4. Toxicité II.4.5. Réglementation II.5. Les composés pharmaceutiques II.5.1. Définition et généralités II.5.2. Structure chimique et propriétés physico-chimiques II.5.3. Les substances pharmaceutiques dans l environnement II.5.4. Toxicité III. L utilisation des copépodes comme espèce modèle en écotoxicologie III.1. Biologie des copépodes III.2. Tests de toxicité aiguë (DL 50) III.3. Tests de toxicité chronique IV. L utilisation de biomarqueurs en écotoxicologie IV.1. Généralités IV.2. L activité acétylcholinestérase IV.3. L activité glutathion-s-transférase V. Etude protéomique et recherche de nouveaux biomarqueurs V.1. Définitions et généralités V.2. L utilisation de l outil protéomique Chapitre 2 : Matériels et méthodes I. La zone de l étude et l échantillonnage I.1. L estuaire de Seine I.2. Les campagnes de prélèvements I.3. Préparation des échantillons II. L organisme modèle : Eurytemora affinis II.1. E. affinis en estuaire de Seine II.2. Technique de tri VI

9 Sommaire III. Expériences au laboratoire III.1. Exposition des copépodes à des variations de température et de salinité III.2. Exposition des copépodes à des contaminants organiques en flux continu IV. Analyse des contaminants organiques IV.1. Protocoles expérimentaux IV.1.1. Extraction des PCB et des HAP IV.1.2. Extractions des alkylphénols polyéthoxylés IV.1.3. Extraction des hormones stéroïdiennes IV.1.4. Extraction des pesticides (Carbamates et Triazines) IV.2. Analyse des contaminants IV.2.1. Chromatographie gazeuse en phase gazeuse (CPG) IV.2.2. Chromatographie en phase liquide (CPL) IV.3. Quantification des contaminants IV.3.1. Etalonnage interne IV.3.2. Etalonnage externe V. Mesure de deux biomarqueurs enzymatiques V.1. Extraction des protéines V.2. Dosage des protéines totales V.3. Dosage de l activité acétylcholinestérase (AChE) V.4. Dosage de l activité glutathion-s-transferase (GST) VI. Analyse de l empreinte protéique VI.1. Préparation et purification des échantillons VI.2. Séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle VI.3. Révélation des protéines VI.4. Analyse des gels et sélection des protéines d intérêts VI.5. Identification et séquençage des protéines VII. Etude du comportement natatoire de E. affinis en tant que biomarqueur d exposition à des contaminants organiques VII.1. Le principe VII.2. Mode opératoire VII.3. Etude de la vitesse de nage VII.4. Etude de la trajectoire VII

10 Sommaire Chapitre 3 : Synthèse des travaux I. Etude in situ des cycles biogéochimiques d une sélection de contaminants organiques présents en estuaire de Seine I.1. Cycle biogéochimique des PCB et des HAP en estuaire de Seine I.2. Cycle biogéochimique des alkylphénols polyéthoxylés en estuaire de Seine I.3. Variations saisonnières de la concentration en triazines et carbamates en estuaire de Seine II. Effets des variations des paramètres physico-chimiques sur la biodisponibilité des contaminants organiques et sur l expression de deux biomarqueurs enzymatiques II.1. Variations de la biodisponibilité et de la toxicité des PCB et des HAP pendant un cycle de marée II.2. Effets des variations de la température et de la salinité sur les activités acétylcholinestérase et glutathion-s-transférase chez E. affinis III. Etudes expérimentales pour évaluer la capacité de E. affinis à bioconcentrer et à éliminer des contaminants organiques III.1. Transferts de contaminants hydrophobes de la phase dissoute vers E. affinis III.2. Transferts de contaminants de type perturbateur endocrinien de la phase dissoute vers E. affinis IV. Effets biologiques des contaminants organiques chez E. affinis et recherche de nouveaux biomarqueurs IV.1. Modification de l expression protéique de E. affinis en réponse à des stress chimiques IV.2. Altération du comportement natatoire de E. affinis en réponse à l injection de contaminants dans son milieu Conclusions & perspectives Bibliographie Annexes Publications VIII

11 Liste des abréviations Chapitre 1 4NP: 4 nonylphénol ACh: acétylcholine AChE: acétylcholinestérase AFSSA: Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments AFSSAPS: L Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé AP: alkylphnéols APEO: alkylphénols polyéthoxylés BaA: benzo(a)anthracène BaP: benzo[a]pyrène BbF: benzo(b)fluoranthène BCR-CEE : Bureau Communautaire de Référence des communautés Européennes BuChE: butylcholinestérase Commission OSPAR: Commission pour la protection du milieu marin de l Atlantique Nord- Est CSAH: Comité Scientifique de l Alimentation Humaine DaA: dibenz[a,h]anthracène DAR: rapport dééthylatrazine sur atrazine DCE: Directive Cadre Eau DIREN: Directions régionales de l environnement DJA: Dose journalière admissible DL 50: Dose létale 50% DREES: Direction de la Recherche, des Etudes, de l'evaluation et des Statistiques EPA: Environmental Protection Agency ERL: effect range-low ERM: effect range-median Fluo: fluoranthène GST: glutathion-s-transférase HAP: Hydrocarbure aromatique polycyclique IARC: International Agency for Research on Cancer IFEN: Institut Français de l'environnement INERIS: Institut National de l'environnement Industriel et des Risques IP: indénopyrène NP: nonylphénols NP1EC: acide phénoxy acétique NP1EO et NP2EO: 4 nonylphénol mono- et diéthoxylé NP2EC: acide phénoxy éthoxy acétique NPE: nonylphénols polyéthoxylés OCDE: Organisation de coopération et de développement économique OMS: Organisation mondiale de la santé PBDE: polybromodiphényléther PCB: Polychlorobiphényle PEC: Predicted Environnemental Concentration PNEC : Predicted No Effect Concentration Pyr: pyrène IX

12 SAGE: Schémas d Aménagement et de Gestion des Eaux SDAGE: Schémas Directeurs d Aménagement et de Gestion des Eaux SEQ-eau: Seuils d Evaluation de la Qualité physico-chimique des eaux TBT: tributyle étain TCDD: 2, 3, 7, 8 tétrachlorodibenzo-p-dioxine TEF: facteur de toxicité équivalente TEQ: Toxic Equivalent Quantity UE: Union Européenne UIPP: Union des industries de la protection des plantes Chapitre 2 ACTC: acétylthiocholine iodide CDNB: 1 chloro-2,4-dinitrobenzene CL HP: chromatographie en phase liquide haute performance CPG DCE: chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à capture d électrons CPG SM: couplage de la chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de masse CPG/SM: chromatographie gazeuse couplée à un spectre de masse CPL SM: couplage de la chromatographie en phase liquide à la spectrométrie de masse DTE: dithioerythritol DTNB: 5,5 -Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) DTT: DL-Dithiothreitol à 1 mm E. affinis: Eurytemora affinis EDTA: ethylenediamine tetra-acetic acid GSH: glutathion réduit HPLC: High Performance Liquid Chromatography IEF: focalisation iso électrique MSTFA: N-méthyl-N(triméthylsilyl)trifluoroacétamide PSU: Practical Salinity Units SDS: sodium dodecyl sulfate SPE: extraction sur phase solide TFA: trifuoro acetic acid Chapitre 3 MES : matières en suspension PD: phase dissoute CE: colonne d eau FBC: facteurs de bioconcentration BbF/BkF: benzo[b]fluranthène/ benzo(k)fluoranthene EE2: 17α-éthynyloestradiol NADPH: reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate HSP: Heat-Shock Proteins PDFs: Profils de Distribution des Fréquences X

13 Liste des figures Liste des Figures Chapitre 1 Figure 1.1 : Structure générique des PCB et positions des substitutions des atomes de Cl...14 Figure 1.2 : Réaction de synthèse des polychlorobiphényles...15 Figure 1.3 : Nomenclature des PCB selon Ballschmitter et Zell...15 Figure 1.4 : Liste des 7 PCB prioritaires...18 Figure 1.5 : Liste des HAP étudiés et leur facteur d équivalence toxique (FET) pour des effets cancérigènes...24 Figure 1.6 : Métabolisation du BaP en Bap 7,8-diol-9,10-époxide...26 Figure 1.7 : Procédé de fabrication du nonylphénol...28 Figure 1.8 : Voies de dégradation des alkylphénols polyéthoxylés...30 Figure 1.9 : Orientation technico-économique des communes en Haute Normandie en Figure 1.10 : Liste des différents pesticides étudiés...34 Figure 1.11 : Détection des substances actives dans les eaux superficielles (a.) et les eaux souterraines (b.) de Haute Normandie en Figure 1.12 : Devenir des substances pharmaceutiques et voies d entrée dans l environnement...43 Figure 1.13 : Les différentes classes de copépodes...45 Figure 1.14 : Forme générale des calanoïdes...46 Figure 1.15 : Facteurs déterminants la production et la perception de signaux chimiques par des organismes aquatiques...48 Figure 1.15 : Effets des contaminants à différents niveaux d organisation biologique...50 Figure 1.16 : Hiérarchisation de la réponse biologique des organismes à des expositions à des contaminants...51 Figure 1.17 : Les différents facteurs de stress influençant les réponses biologiques...52 Figure 1.18 : Cycle de synthèse et d élimination de l acétylcholine et rôle de l acétylcholinestérase...54 Figure 1.19 : Métabolisme du glutathion...55 Chapitre 2 Figure 2.1 : Carte de la zone d étude et des sites de prélèvement...63 Figure 2.2. : Photographies de copépodes prises à la loupe binocculaire Figure 2.3. : Stades de développement de Eurytemora affinis adapté de Katona (1970a, b) par Souissi. N : stade nauplien, C : stade copépodite...69 Figure 2.4. : Etapes successives du tri des échantillons de plancton...70 Figure 2.5. : Composition des échantillons de copépodes avant et après le tri au laboratoire...71 Figure 2.6. : Dispositif expérimental...75 Figure 2.7: Protocoles d extraction simultanée des PCB et des HAP en phase dissoute et en phase particulaire...79 XI

14 Liste des figures Figure 2.8 : Protocoles d extraction des PCB et des HAP chez E. affinis...80 Figure 2.9 : Protocoles d extraction des alkylphénols polyéthoxylés en phase dissoute et sur matrices solides...84 Figure 2.10 : Réaction enzymatique mise en jeu dans le dosage de l activité AChE...94 Figure 2.11 : Réaction enzymatique mise en jeu dans le dosage de l activité GST...95 Figure 2.12 : Comparaison des deux techniques de coloration pour un même échantillon Figure 2.13 : Interface utilisateur du logiciel d analyse d image Melanie Figure 2.14 : Interface du logiciel permettant d analyser les images Figure 2.15 : Schéma du déplacement d un copépode dans l espace Figure 2.16 : Schématisation des trajectoires d un copépode Chapitre 3 Figure 3.1 : Variations saisonnières de la concentration total en (a) HAP parents et en (b) PCB, dans la phase dissoute (ng.l -1 ) a.1&b.1, dans la matière en suspension (ng.g -1 ) a.2 &b.2 et chez E. affinis (ng.g -1 ) a.3&b Figure 3.2 : Résultats de l analyse en composantes principales de la teneur en (a) HAP et en (b) PCB accumulés par E. affinis en fonction de la contamination du milieu (PAH et PCB adsorbés) et des paramètres environnementaux Figure 3.3 : Empreintes de contamination moyenne par les HAP (a) observées dans la phase dissoute (PD), dans les MES et chez Eurytemora affinis (EA). Les rapports moléculaires Phe/An versus Fluo/Pyr (b) sont des indices caractéristiques de l origine des HAP dans la phase dissoute et dans la phase particulaire Figure 3.4 : Empreintes de contamination moyenne par les PCB (a) observées dans la phase dissoute (PD), dans les MES et chez Eurytemora affinis (EA). La Fig. b représente l abondance relative moyenne des principaux PCB (CBi) versus PCB 153 qui est le congénère le moins métabolisé, dans la colonne d eau (CE) et chez les copépodes Figure 3.5 : Variations saisonnières de la concentration totale en alkylphénols polyéthoxylés et profils de distribution des différents composés dans la phase dissoute (ng.l -1 ). La Figure b présente différents rapports moléculaires caractéristiques des voies de métabolisation dans la phase dissoute Figure 3.6 : Variations saisonnières de la concentration totale en alkylphénols polyéthoxylés et profils de distribution des différents composés dans la matière en suspension (ng.g -1 ) Figure 3.7 : Variations saisonnières de la concentration en atrazine et simazine et de leurs métabolites principaux en estuaire de Seine (phase dissoute) Figure 3.8 : Variations saisonnières du rapport déséthylatrazine/atrazine Figure 3.9 : Variations des activités AChE (a) et GST (b) (n = 4) chez des copépodes prélevés en surface et près du fond pendant un cycle de marée Figure 3.10 : Variations de l activité AChE chez E. affinis après exposition à différentes salinités (de 0 à 25 psu) Figure 3.11 : Variations de l activité GST chez E. affinis après exposition à différentes salinités (de 0 à 25 psu) Figure 3.12 : Variations de l activité AChE chez E. affinis après exposition à différentes températures pendant 18 heures Figure 3.13 : Variations de l activité GST chez E. affinis après exposition à différentes températures (4, 11, 18 et 25 C) XII

15 Liste des figures Figure 3.14 : Bioconcentration des PCB (a.1) et des HAP (b.1) chez Eurytemora affinis après exposition à des eaux contaminées pendant 86 heures. L élimination de chaque PCB (a.2) et de chaque HAP (b.2) chez les copépodes non exposés (témoins) est présentée depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu à la fin des expériences. Les profils de distribution des PCB (c.1) et des HAP (c.2) après 86 heures d exposition sont comparés à ceux des copépodes non exposés et à ceux de l eau à la fin de l expérience Figure 3.15 : Evolution des profils de distribution des PCB (a) et des HAP (b) chez les copépodes non exposés et chez les copépodes exposés depuis leur prélèvement dans l estuaire de Seine jusqu à la fin des expériences en comparaison avec les profils de distribution de ces contaminants dans le milieu d exposition (phase dissoute) Figure 3.16 : Expression des facteurs de bioconcentration (FBC) de chaque PCB (a) et de chaque HAP (b) chez les copépodes exposés en fonction du log K ow de chaque composé Figure 3.17 : Bioconcentration des alkylphénols (a) chez Eurytemora affinis après exposition à des eaux contaminées pendant 86 heures. L élimination du 4-NP et du NP1EC (b) chez les copépodes non exposés (témoins) est présentée depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu à la fin des expériences. Les concentrations en 4-NP et en NP1EC (c) après 86 heures d exposition sont comparées à celles des copépodes non exposés et à celles de l eau à la fin de l expérience Figure 3.18 : Expression de la concentration en 4-NP mesurée chez les copépodes non exposés depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu à la fin des expériences en fonction de la concentration en NP1EC chez ces mêmes organismes Figure 3.19 : Accumulation et élimination de l éthynyloestradiol respectivement chez les copépodes exposés et chez les non exposés depuis leur prélèvement dans le milieu jusqu à la fin des expériences Figure 3.20 : Profils d expression protéique typiques sur gels 2-DE obtenus à partir de pools d E. affinis exposés à différents contaminants organiques en flux continu. Le premier gel (A) et le second gel (B) présentent (à titre d exemple) les profils d expression protéique respectivement des copépodes exposés à un mélange 4 NP/NP1EC et des copépodes non exposés Figure 3.21 : Proportions moyennes de chaque état de nage pour les femelles et pour les mâles E. affinis, avant et après l injection de la solution de contaminants Figure 3.22 : Profils de distribution des fréquences (PDFs) des vitesses de nage (en transformation log-log) des femelles (a1) et des mâles (a2) avant et après l injection de la solution de contaminants Figure 3.23 : Profils de distribution des angles de nage cumulés (PDF) (en transformation log-log) pour les femelles (a.) et pour les mâles (b.) avant et après l injection de la solution de contaminants XIII

16 Liste des figures XIV

17 Liste des tableaux Liste des tableaux Chapitre 1 Tableau 1.1 : Toxicité aiguë des différents pesticides étudiés sur différents groupes d organismes Tableau 1.2 : Quantité de médicaments vendus dans différents pays européens Tableau 1.3 : Structure et propriétés physico-chimiques des médicaments étudiés Chapitre 2 Tableau 2.1 : Paramètres physico-chimiques mesurés au cours du suivi in situ Tableau 2.2. : Paramètres physico chimiques mesurés lors du cycle de marée Tableau 2.3. : Composition et concentrations nominales des solutions de contamination Tableau 2.4. : Cinétiques de saturation des aquariums pour chaque classe de contaminants.. 76 Tableau 2.5. : Plan expérimental des expériences en flux continu Tableau 2.6 : Validation des protocoles d analyse des HAP sur des matrices certifiées Tableau 2.7 : Validation des protocoles d analyse des PCB sur des matrices certifiées Tableau 2. 8: Liste des PCB et HAP étudiés et de leurs étalons internes correspondants Tableau 2.9 : Composition du tampon d extraction Tableau 2.10 : Composition du tampon de réhydratation Tableau 2.11 : Composition du tampon de rééquilibration Tableau 2.12 : Composition des gels de polyacrylamide Chapitre 3 Tableau 3.1 : Détails des différentes campagnes de prélèvement Tableau 3.2 : Variations saisonnières de la concentration totale et des concentrations individuelles en alkylphénols et en alkylphénols polyéthoxylés chez E. affinis Tableau 3.3 : Paramètres physico-chimiques mesurés lors de chaque prélèvement pendant le cycle de marée Tableau 3.4 : Distribution des différents congénères de PCB et HAP dans la phase dissoute et dans les MES (poids sec) de l estuaire de Seine pendant un cycle de marée Tableau 3.5 : Distribution des PCB et des HAP dans la colonne d eau de l estuaire de Seine et chez E. affinis pendant un cycle de marée Tableau 3.6 : Variations des activités AChE et GST chez E. affinis pendant un cycle de marée expérimental Tableau 3.7 : Nombre de protéines différentiellement exprimées (sur ou sous exprimées) pour chaque condition d exposition Tableau 3. 8 : Résultats de l identification des protéines (nanolc MSMS) différentiellement exprimées chez les copépodes exposés aux différents contaminants par homologie de séquence avec des protéines répertoriées dans les bases de données XV

18 Liste des tableaux XVI

19 Introduction Introduction 1

20 Introduction 2

21 Introduction Du fait de l inégale répartition des réserves mondiales d eau, l accès et l utilisation de cette ressource sont devenus des enjeux majeurs pour le XXI ème. Dans les régions frappées de pénurie, l utilisation comme la surexploitation des réserves sont et seront de plus en plus des sources de conflits centrées sur des considérations économiques, écologiques et politiques. En effet, outre l aspect écologique, l eau est à la base de nombreux domaines de l économie, dans l agriculture (irrigation), comme matière première dans l industrie (industrie électrique, alimentaire ), en tant que réserve d énergie (barrages hydroélectriques) et comme voies de navigation. Désormais, des réflexions de fond doivent être menées sur l efficacité de l utilisation et de la gestion de ces ressources ainsi que sur la recherche de nouvelles techniques d exploitation. En France comme dans la plupart des pays de l hémisphère Nord, les ressources potentielles en eau sont importantes et permettent largement de faire face aux besoins annuels (consommation de la population, irrigation agricole, industrie). Les réserves en eau sont donc pour l instant suffisantes et la qualité des eaux distribuées est bonne. Les préoccupations concernent essentiellement les risques liés à la sécurité alimentaire et au maintien ou à la restauration d une bonne qualité écologique des écosystèmes menacés par des stress chimiques et bactériologiques. En effet, depuis l explosion de l industrie chimique au début du XX ème siècle et l utilisation de produits de synthèse dans la vie quotidienne, des quantités croissantes de substances chimiques d origines industrielles, agricoles ou domestiques, n ont cessé d être émises dans l environnement. Quelles que soient les sources de pollution et le compartiment de l environnement dans lequel ces contaminants sont émis, les milieux aquatiques et notamment les océans constituent le réceptacle ultime de ces substances. Ces contaminants sont transférés vers les océans soit par des apports atmosphériques directs, soit par des apports provenant des écosystèmes aquatiques continentaux et notamment des fleuves. Les milieux estuariens qui assurent la transition entre les eaux douces continentales et les eaux marines sont donc particulièrement exposés aux contaminants en général. Les estuaires sont des écosystèmes complexes, caractérisés par des interactions entre le milieu marin et les milieux dulçaquicoles continentaux qui sont à l origine de variations importantes des paramètres physico-chimiques (salinité, température, ph ). Ce sont des écosystèmes écologiquement riches qui présentent une forte productivité biologique et qui 3

22 Introduction possèdent un rôle clé dans l équilibre de nombreux processus écologiques. En effet, ces milieux constituent des zones de nourricerie pour de nombreuses espèces de poissons marins. Les estuaires représentent également des lieux de transit essentiels dans les couloirs de circulation des oiseaux migrateurs. Ces zones d intérêt écologique majeur sont souvent sous l influence d activités anthropiques qui contribuent à fragiliser ces écosystèmes par des émissions conséquentes de substances chimiques de synthèse. Depuis quelques décennies, la prise de conscience générale de la dégradation des écosystèmes a conduit les scientifiques à mener des études sur les sources d émission de contaminants, sur leur devenir dans l environnement (cycles biogéochimiques) et leurs effets sur les biocénoses. Cependant, bien que les effets à court terme de nombreux contaminants sur les organismes aquatiques aient été bien documentés, les effets à long terme sont en revanche encore mal connus. Parmi les contaminants détectés dans les écosystèmes aquatiques, certaines classes sont plus préoccupantes que d autres. Ainsi, les polluants organiques persistants (POPs) sont des substances chimiques faiblement biodégradables qui possèdent des propriétés physico-chimiques qui leur confèrent un fort potentiel de bioaccumulation par les organismes. Parmi ces composés, les polychlorobiphényles (PCB) sont des molécules chlorés ubiquistes particulièrement rémanentes et bien qu interdits depuis la fin des années 1970 encore très présents à l heure actuelle dans les écosystèmes aquatiques. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont issus de la combustion de la matière organique et sont connus pour leurs propriétés cancérogènes. Des contaminants plus hydrophiles tels que des surfactants anioniques (alkylphénols polyéthoxylés) et des substances pharmaceutiques (médicaments, hormones stéroïdiennes de synthèse) sont également fréquemment détectés et ont été associés à des perturbations endocrines. Enfin, les produits phytosanitaires (insecticides : carbamates; herbicides : triazines, diuron ) sont également très présents dans les milieux aquatiques et représentent, bien que leur demie vie soit très réduite, une toxicité importante (neurotoxicité, perturbation endocrine ). Pour répondre à ces contraintes, des actions ont été menées visant à réduire les émissions de ces contaminants au niveau de toutes les sources d émission (industrielles, agricoles et domestiques). De plus un cadre politique communautaire a été instauré au sein de l Union Européenne par la directive cadre eau (2000/60/CE) afin de développer une législation commune aux états membres concernant la gestion des ressources en eau et la restauration d une bonne qualité des écosystèmes aquatiques. 4

23 Introduction Le bassin versant de la Seine abrite près de 26% de la population française et 40% de l activité agricole et économique du pays principalement représentée par l industrie pétrochimique et pharmaceutique. Le fleuve et son estuaire sont donc soumis à une pression anthropique très intense caractérisée par des apports importants de contaminants et notamment de substances organiques de synthèse. Toutefois, en dépit de la contamination élevée de l estuaire, un micro crustacé zooplanctonique, le copépode Eurytemora affinis, s y est largement développé et domine la communauté méso zooplanctonique. Ce copépode peut atteindre pendant la période maximale de production des concentrations équivalentes à dix fois celles observées dans la plupart des autres estuaires Nord Atlantiques pourtant moins pollués ( individus.m -3 ). Les travaux présentés dans ce manuscrit font partie d un programme de recherche pluridisciplinaire visant à étudier la qualité de l eau de l estuaire de Seine en se basant sur une étude in situ de deux ans couplée à des expérimentations au laboratoire afin d estimer les effets toxiques des principaux contaminants organiques détectés dans ce milieu sur E. affinis, copépode caractéristique de tous les estuaires Nord Atlantiques. A cet effet, la biodisponibilité de ces contaminants dans la colonne d eau, leur transfert (bioconcentration) ainsi que leur élimination ont été étudiés chez E. affinis. De plus, les effets de ces contaminants ont été étudiés à différents niveaux d organisation biologique chez ce copépode, depuis le niveau moléculaire jusqu à l échelle de l organisme entier. Cette étude a également pour objectif de fournir quelques éléments de réponse pour expliquer la formidable densité de cette espèce en estuaire de Seine. La première phase de ce projet qualifiée d étude de terrain a consisté à détecter les principaux contaminants organiques présents en estuaire de Seine et à caractériser leurs concentrations respectives dans les différents compartiments de la colonne d eau (phase dissoute et phase particulaire). Les transferts de ces contaminants depuis le biotope vers la biocénose ont également été étudiés par la mesure des quantités de contaminants accumulés par Eurytemora affinis. Puis les variations du cycle biogéochimique des principaux contaminants organiques de l estuaire de Seine ont été étudiées à deux échelles de temps différentes : à l échelle des saisons sur deux années ainsi qu à l échelle d un cycle de marée. Deux biomarqueurs d exposition, l acétylcholinestérase et la glutathion-s-transférase ont également été étudiés au cours d un cycle de marée et lors d expériences en laboratoire pour 5

24 Introduction déterminer les effets des facteurs abiotiques (salinité et température) sur les variations de ces activités enzymatiques chez E. affinis. La deuxième phase du projet qualifiée d étude expérimentale a été consacrée à l étude des transferts de contaminants organiques représentatifs de la contamination de l estuaire de Seine, depuis la phase dissoute vers Eurytemora affinis. Les contaminants sélectionnés ainsi que les concentrations retenues pour les expositions ont été définies à partir des résultats obtenus au cours de la première phase du projet afin de réaliser les expériences d exposition dans des conditions environnementales les plus réalistes. Ces expositions ont été réalisées en flux continu à l aide d un protocole expérimental développé spécialement pour cette étude. Enfin, au cours de la troisième et dernière partie du projet, des travaux ont été menés à l aide de nouvelles techniques d analyse innovantes dans le but d identifier et de proposer de nouveaux biomarqueurs d exposition à des contaminants organiques pour des concentrations sub-létales. Pour cela, lors des expositions en flux continu, les effets des contaminants organiques sur le protéome d Eurytemora affinis ont été analysés. En effet, les techniques d électrophorèses bidimensionnelles couplées à des techniques de chimie analytique permettent d observer les variations d expression protéiques impliquées dans des cascades de réactions biochimiques en réponse à un stress chimique et permettent de ce fait de sélectionner et d identifier des marqueurs d intérêts. Par ailleurs, le comportement natatoire de ce copépode a été étudié en réponse à des injections de contaminants organiques dans leur milieu. L objectif de cette expérience est de valider l utilisation du comportement natatoire comme indicateur sensible de la contamination de l eau. La présentation de ces travaux s articule selon le plan détaillé ci après. Le chapitre 1 présente dans un premier temps les critères de l analyse de la qualité de l eau fixés par la Directive Cadre Eau. Les intérêts de l utilisation d études écotoxicologiques dans cette démarche sont également présentés. Dans un deuxième temps, une synthèse bibliographique présente l état des connaissances actuelles sur les différents contaminants étudiés ainsi que sur les biomarqueurs biochimiques utilisés au cours de cette étude. Les différentes techniques analytiques et biochimiques utilisées au cours de ces travaux, ainsi que le site de l étude et l organisme modèle, E. affinis, sont présentés dans le chapitre 2. Enfin, la synthèse des différents résultats obtenus au cours de ces travaux est présentée dans le chapitre 3. Ce chapitre reprend les résultats présentés dans une série d articles soumis (acceptés ou 6

25 Introduction actuellement reviewés) ou en préparation qui sont intégrés dans les annexes de ce manuscrit. Dans ce chapitre 3, les cycles biogéochimiques saisonniers des PCB, des HAP (publication n 1), ainsi que des alkylphénols polyéthoxylés (publication n 2) observés en estuaire de Seine sont présentés. Une note présentant les variations saisonnières des concentrations en triazines et en carbamates en estuaire de Seine est également détaillée. Les effets des paramètres physicochimiques sur la biodisponibilité ainsi que sur l expression de biomarqueurs biochimiques sont également détaillés dans de 2 publications. L article n 3 présente les variations de la biodisponibilité des PCB et des HAP et leurs effets sur deux biomarqueurs d exposition, l activité acétylcholinestérase (AChE) et la glutathion-s-transférase (GST), au cours d un cycle de marée. La publication n 4 concerne l étude expérimentale des effets des variations de la salinité et de la température sur l expression des activités enzymatiques AChE et GST. Le chapitre 3 reprend également les résultats de l étude expérimentale de la bioconcentration et de l élimination des contaminants organiques chez Eurytemora affinis, contaminants hydrophobes persistants dans le cadre de la publication n 5 et contaminants oestrogéno-mimétiques dans le cadre de la publication n 6. Enfin, la dernière partie de ce chapitre présente la recherche de nouveaux biomarqueurs suite aux expériences d exposition en flux continu. Ainsi, la publication n 7 concerne les effets des contaminants organiques sur les variations d expression des protéines et l identification de certains processus biochimiques mis en jeu. La publication n 8 présente la réponse comportementale des copépodes suite à des injections de contaminants. 7

26 Introduction 8

27 Chapitre I : Synthèse bibliographique Chapitre 1 Synthèse bibliographique Ce chapitre présente synthétiquement l état des connaissances actuelles sur les différents contaminants étudiés au cours de ces travaux, leurs concentrations dans l environnement ainsi que leurs effets sur les organismes aquatiques. De plus, une présentation des différents biomarqueurs analysés ainsi que leur utilisation dans différentes études d évaluation du risque chimiques pour les milieux aquatiques sont également détaillées. 9

28 Chapitre I : Synthèse bibliographique 10

29 Chapitre I : Synthèse bibliographique I. La qualité de l eau I.1. Les critères de qualité Les politiques de l eau des états membres de l Union Européenne sont de plus en plus encadrées au niveau européen. La France, comme tous les autres états membres, est tenue d appliquer ces réglementations. Pour cela les cadres fixant la politique de l eau au niveau européen ont été transposés en droit français par la loi n du 21 avril 2004 et font également l objet d un projet de loi sur l eau et les milieux aquatiques (30 mai 2006). Ces lois donnent les outils nécessaires à l administration et aux collectivités locales pour atteindre les objectifs fixés par la directive cadre européenne. - La Directive Cadre Européenne 2000/60/CE (DCE) Depuis le 23 octobre 2000, la directive cadre européenne sur l eau (DCE) fixe des objectifs ambitieux à atteindre par les états membres : - établir un cadre pour la protection des eaux, - reconquérir la qualité des eaux et atteindre en 2015 un bon état fixé par la DCE (préservation des ressources en eau destinées à l alimentation humaine, préservation des activités liées à l eau, préservation du bon état chimique et écologique des milieux), - élaboration de programmes visant à réduire, voire supprimer les rejets de substances dangereuses (maintenir un bon état physico-chimique et microbiologique des milieux) par la mise en place de valeurs limites d émission et de normes de qualité environnementale, - faire participer le public à l élaboration et au suivi des politiques, - tenir compte du principe de récupération des coûts des services liés à l utilisation de l eau. Le cadre général de la DCE s applique aux eaux intérieures, aux eaux souterraines, aux eaux de transition et aux eaux côtières. La qualité des eaux en France n a pas encore atteint le bon état requis par la directive du fait des pollutions ponctuelles et diffuses insuffisamment maîtrisées. Actuellement, le bon état écologique des eaux n est notamment 11

30 Chapitre I : Synthèse bibliographique atteint que sur la moitié des points de suivi des eaux superficielles. Pour atteindre ce bon état, la loi française prévoit notamment d utiliser les Schémas Directeurs d Aménagement et de Gestion des Eaux (SDAGE) et les Schémas d Aménagement et de Gestion des Eaux (SAGE) au sein d une approche par bassin versant. Cette approche vise dans un premier temps à dresser un état des lieux des milieux en déterminant l incidence des activités humaines sur les écosystèmes aquatiques par la mise en place de programmes de surveillance (mesures de base de polluants, structurées au sein d un plan de gestion). Cette évaluation permet d établir et de définir des zones protégées. Pour préserver la qualité physico-chimique et microbiologique des cours d eau et des eaux souterraines et suivant les risques présentés, des mesures réduisant les émissions de polluants (substances prioritaires : nitrates, phytosanitaires, oestrogéno-mimétiques, neurotoxiques; bactéries) sont à envisager. Dans un deuxième temps, cette approche a pour but de préserver la qualité écologique des cours d eau (aménagement des écosystèmes) et d améliorer la gestion quantitative des niveaux des eaux (étiages, prélèvements d eau). I.2. La contamination chimique - Les sources Deux types de contaminants chimiques peuvent être présents dans les écosystèmes aquatiques, les macropolluants et les micropolluants. Les macropolluants sont soit présents naturellement dans les eaux soit introduits suite à des activités humaines et sont toxiques pour des gammes de concentrations de l ordre du mg.l -1. Trois groupes de macropolluants sont répertoriés : les matières en suspension (biodégradables ou non), la matière organique et les nutriments (essentiellement l azote et le phosphore). Les micropolluants sont majoritairement d origine anthropique et sont introduits dans les eaux soit directement par des sources diffuses, soit indirectement lors d apports ponctuels. Ces contaminants sont toxiques pour des gammes de concentrations de l ordre du µg.l -1. On distingue deux groupes de micropolluants chimiques : les métaux et les micropolluants organiques. L introduction des métaux dans l eau peut provenir de l érosion des sols mais est majoritairement d origine industrielle. Les micropolluants organiques sont soit d origine synthétique (des additifs de détergents : par ex. les alkylphénol polyéthoxylés; pesticides; substances pharmaceutiques; composés chlorés : ex: Polychlorobiphényles (PCB)) soit liés à la combustion des réserves fossiles du bois ou de la matière organique (Hydrocarbures 12

31 Chapitre I : Synthèse bibliographique aromatiques polycycliques (HAP) et dioxines) et sont quasi exclusivement introduits dans l eau suite à des activités anthropiques. - La biodisponibilité Selon Ramade (2002), "la biodisponibilité d un contaminant dépend de l état physique (solubilisé ou adsorbé) ou chimique (complexé ou ionisé) dans lequel se trouve un polluant et conditionne son écotoxicité". De plus, la biodisponibilité est caractéristique de la fraction de cette substance ayant la possibilité d être absorbée et d être utilisée par le métabolisme d un organisme vivant. La biodisponibilité joue un rôle très important dans la toxicité réelle d'un contaminant. L analyse de la biodisponibilité des contaminants organiques dans les écosystèmes constitue un aspect fondamental des études menées en écotoxicologie pour évaluer les risques toxiques d une/plusieurs substance(s) dans un écosystème. Cette notion de biodisponibilité se situe à l interface de plusieurs disciplines scientifiques. Elle dépend à la fois de la géochimie et du devenir du contaminant dans le milieu, mais également de la biologie des organismes exposés (physiologie/éthologie). Trois approches complémentaires peuvent être envisagées pour estimer la biodisponibilité d un contaminant : - une approche chimique consistant dans un premier temps à déterminer la répartition du contaminant dans les différents compartiments du biotope (phase dissoute et phase particulaire/sédimentaire dans les milieux aquatiques et le rôle des substances humiques) et d autre part à mesurer la concentration en contaminant bioaccumulé (1) par la biocénose au cours de l exposition dans le cas où il n y a pas de biotransformation, (1) Le terme bioaccumulation désigne la capacité des organismes à concentrer et à accumuler des substances chimiques à des concentrations bien supérieures à celles où elles se trouvent présentes dans l eau qui les environne. La bioaccumulation considère deux principales voies d entrée des substances chimiques dans l organisme : l eau par le biais de la respiration et la consommation d aliments eux-mêmes contaminés. Les substances ingérées sont susceptibles d être éliminées de diverses façons. Il y a bioaccumulation lorsque les quantités de substances apportées à l individu dépassent les quantités éliminées. ( 13

32 Chapitre I : Synthèse bibliographique - une approche biologique consistant à mesurer la réponse biologique d un organisme ou d une population suite à une exposition à un contaminant. En fonction de l espèce et du biomarqueur (2) utilisés, la réponse est proportionnelle à la concentration du contaminant dans le milieu. En fonction du contaminant et de sa concentration dans le milieu, deux types d effets sont envisageables : une toxicité aiguë conduisant à la mort de l organisme (DL 50 (3) ) et une toxicité chronique produisant des effets à plus long terme, - une approche couplée (chimique et biologique), plus rigoureuse permettant d évaluer la réponse d un organisme en fonction de la concentration d un contaminant dans le milieu et non pas, comme dans les deux premières approches, de déterminer l un à partir de l autre. Dans le cadre des deux premières approches, l estimation de la biodisponibilité d un contaminant intègre des facteurs présentant une variabilité plus ou moins grande sans en tenir compte. Ainsi l analyse chimique des contaminants bioaccumulés est précise mais ne prend pas en compte les variabilités intra- et interspécifiques des organismes (ex variabilité des capacités de métabolisation des contaminants en fonction de l état de l organisme et de l espèce) et ne renseigne pas sur la toxicité de ces contaminants. L approche biologique permet d estimer le risque lié aux contaminants mais est plus variable et plus difficile à interpréter. Par exemple, les données de DL 50 des contaminants, classées en 3 catégories par la Directive Européenne 93/67/EE (DL 50 < 1mg.L -1 : composé très toxique pour les organismes aquatiques, 1 < DL 50 < 10 mg.l -1 : composé toxique pour les organismes aquatiques, 10 < DL 50 < 100 mg.l -1 : composé nocif pour les organismes aquatiques) sont difficilement exploitables pour des concentrations environnementales. De plus, la réponse des organismes n est pas toujours proportionnelle à la concentration en contaminants. A contrario, l approche couplée donne des informations précises sur la contamination et les risques biologiques qui en découlent et permet une interprétation plus fiable et plus aisée. (2) Changement observable et/ou mesurable au niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou comportemental, qui révèle l'exposition présente ou passée d'un individu à au moins une substance chimique à caractère polluant (Lagadic et al., 1997). (3) DL 50 : Dose létale pour 50 % de la population 14

33 Chapitre I : Synthèse bibliographique Dans le cadre de ces travaux de thèse et dans le but d évaluer le stress lié à la contamination chimique en estuaire de Seine, différentes classes de contaminants ont été étudiées sur des critères de concentrations élevées dans les milieux aquatiques, de rémanence, de transferts importants vers le compartiment biologique (bioaccumulation/bioconcentration) et de toxicité élevée. Le paragraphe suivant est consacré à la présentation des différents contaminants étudiés au cours de cette étude. II. Les contaminants organiques étudiés II.1. Les Polychlorobiphényles (PCB) II.1.1. Réaction de synthèse et structure chimique Les PCB représentent une famille de composés de haut poids moléculaire possédant tous la même structure générique (C 12 H 10-n Cl n ) avec un nombre variable de substitutions par des atomes de chlore (1 n 10) (Figure 1.1.). 2, 2,6,6 : ortho-substitutions 3, 3,5,5 : méta-substitutions 4,4 : para-substitutions Figure 1.1. : Structure générique des PCB et positions des substitutions des atomes de Cl Ces molécules d origine anthropique sont obtenues industriellement par deux étapes successives consistant dans un premier temps à synthétiser un biphényle par déshydrogénation de deux molécules de benzène à 800 C, puis à substituer des atomes d hydrogène par des atomes de chlore sur le biphényle par des apports de chlore anhydre (jusqu'à cinq atomes de chlore sur chaque phényle) en présence d'un catalyseur, le chlorure ferrique (Figure 1.2.). 15