Initiation la Recherche Atelier Scrtion Master de Microbiologie M1 (Biochimie et Biologie Cellulaire)

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1 1 Initiation la Recherche Atelier Scrtion Master de Microbiologie M1 (Biochimie et Biologie Cellulaire) Sophie Bleves, Amel Latifi, et Aurlia Battesti. Introduction Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram-négatif, pathogène opportuniste de l homme. Elle est notamment redoutée dans le milieu hospitalier (infections nosocomiales) chez les malades immunodéprimés et les grands brûlés. Cette bactérie est aussi connue pour les complications, souvent fatales, qu elle entraîne chez les patients atteints de mucoviscidose. Sa virulence est multifactorielle: elle est liée d une part à des facteurs associés aux bactéries, tels que le flagelle, les pili ou l alginate (un exopolysacharide muqueux), ou à la sécrétion de diverses toxines et enzymes dégradatives dans le milieu extracellulaire. Figure 1 : Les facteurs de virulence de P. aeruginosa * r ésistance AB pompes efflux* Alginate (biofilm*, adh ésine, antiphagocytose anticompl ément) * * Sécrétion d'enzymes dégradatives et de toxines pigments fluorescents Squestration du fer Flagelle (mobilit, biofilm) Pili (mobilité, adhésion,biofilm)

2 2 La sécrétion chez les bactéries à Gram-négatif implique pour les protéines à sécréter (exoprotéines) la traversée de deux membranes (interne et externe) et d un compartiment aqueux, le périplasme. Cinq voies principales de sécrétion sont conservées au sein des bactéries à Gram-négatif et vous ont été détaillées en cours. Quatre d entre elles sont présentes chez P. aeruginosa (figure 2), cette caractéristique en faisant un modèle particulièrement intéressant pour l étude des mécanismes de sécrétion. Voie Gnrale de Scrtion Type II Elastase ( LasB) Exotoxine A Protase Las A Phospholipases Lipase Phosphatase alcaline Transporteur ABC Type I Protase alcaline, HasAp, AprX Type III Contact dpendant Exoenzymes S, T, U, Y Membrane plasmique cellule eucaryote cible AprF Membrane externe Xcp AprE Psc Périplasme Sec Tat AprD Membrane interne Cytoplasme Mcanismes Sec-indpendants Figure 2 : Schma de 3 voies de scrtion prsentes chez P. aeruginosa. NB la voie de scrtion de type V n est pas prsente La machinerie de sécrétion de type II est composée de 12 protéines Xcp (extracellular protein deficient) qui s associeraient en un complexe multiprotéique reliant les deux membranes. Elle est nécessaire entre autre à la sécrétion de l élastase qui se déroule en deux étapes : traversée de la membrane interne par la voie Sec ou la voie Tat (selon les exoprotéines), puis traversée de la membrane externe par la voie Xcp. Les 12 gènes xcp sont organisés sur un même locus, en deux opérons divergents, xcppq, et xcpr-z, alors que les gènes codant pour les protéines sécrétées sont à différents loci du chromosome. Les protéines

3 3 XcpT, U, V, W et X sont appelées pseudopilines, de part leur homologie avec la piline des pili de type IV, et s assemblent pour former un pseudopilus transmembranaire. La machinerie de sécrétion de type I est la plus simple et comprend 3 protéines Apr (alkaline protease). Elle permet notamment la sécrétion en une étape de la protéase alcaline. Le gène structural de celle-ci (apra) appartient à l opéron arpa-f qui code aussi pour les composants de la machinerie de sécrétion. Enfin la machinerie de sécrétion de type III se compose d une trentaine de protéines Psc (Pseudomonas secretion component), qui forment un conduit permettant le transport des protéines à sécréter directement du cytoplasme bactérien dans le cytosol de la cellule eucaryote cible. In vivo c est le contact avec la cellule cible qui induit l expression des gènes psc et des gènes exos, T, U, et Y codant pour les effecteurs. ExoU est associée à une chaperonne cytoplasmique. Un activateur transcriptionnel de la famille AraC, appelé ExsA, est requis pour l activation du régulon de type III. Cet atelier a pour but d initier les tudiants aux techniques classiques des laboratoires tudiant les mcanismes de scrtion et de leur rgulation, en plus des techniques de base de microbiologie molculaire. Quels sont les objectifs de cet atelier? Partie A Nous allons chercher à déterminer s il existe un quelconque lien, ou «cross-talk», entre les différentes machineries de sécrétion présentes chez P. aeruginosa. Aucune donnée n a jamais été publiée à ce sujet chez P. aeruginosa, mais quelques exemples sont décrits dans la littérature chez d autres bactéries. Nous avons choisi de vous limiter aux machineries de type I et II, et souhaitons que vous abordiez cette question à deux niveaux : - phnotype de la scrtion: une voie de sécrétion influence-t-elle la sécrétion des exoprotéines transitant par une autre voie de sécrétion? - rgulation de l expression des gnes: si le «cross-talk» existe, à quel niveau se situe-t-il? Nous vous demandons d envisager les manipulations que vous entreprendriez pour rpondre ces questions. Dans les annexes, vous trouverez un tableau récapitulatif des souches bactériennes (sauvage et mutantes), des plasmides, des oligonucléotides et des anticorps dont vous disposez, ainsi que d un panel de techniques. Parallèlement à cette étude, vous allez vérifier le génotype d une des souches que vous aurez utilisées lors de cette partie (voir annexe). Partie B Nous étudierons plus particulièrement une protéine, XcpY, qui est un composant de la membrane interne de la machinerie de sécrétion de type II.

4 4 Par une analyse bio-informatique de sa séquence, vous obtiendrez toutes les prédictions de topologie la présentant comme une protéine de membrane interne : nombre de segments transmembranaires (certains et putatifs), orientations possibles du polypeptide (extrémité N-terminale dans le cytoplasme ou dans le périplasme). Ces prédictions de topologies seront confirmées par une approche in vivo qui consiste à étudier le phénotype de fusions traductionnelles de XcpY avec des enzymes rapporteurs (voir le principe en annexe). Vous étudierez l interaction de XcpY avec une autre protéine de membrane interne de la machinerie, XcpZ. Pour ce faire, vous disposerez d un plasmide (pgm ) qui porte le gène codant pour XcpY et un gène codant une forme étiquetée 6 His de XcpZ. Comment pourriez-vous mettre en vidence l interaction entre ces 2 protines grce ce plasmide? Quelles seront les diffrentes tapes de cette exprience? Consultez les annexes pour vous aider, et ne perdez pas de vue qu il s agit de protéines membranaires. Partie C Nous étudierons la production par Pseudomonas aeruginosa de facteurs de virulence autres que ceux sécrétés ( shearing -rasage- d appendices extracellulaires, adhsion sur support inerte, mobilit swiming et twitching-). Programme Lun20/02 M Mar21/02 M Mer22/02 Jeu23/02 Ven24/02 M+ Lun27/02 M SB SB AB AL SB SB SB SB 1 re confrence Tutorat (binme 1-14h-, 2-15h-,3-16h-) Introduction au FIL ROUGE Prparations (milieux, tampons et autres solutions) Bactries comptentes et transformation Prparation de plasmides (lyse alcaline) Comparaison des protocoles lyse alcaline et semi-boiling Prparation de protines scrtes Montage SDS-PAGE Fin prparation chantillons protiques, Electrophorse, Transfert Conjugaison Carte restriction (salle TD) 2 me confrence Analyse topologie XcpY (salle Info)

5 5 Mar28/02 M+ Mer01/03 M Jeu02/03 M (CNRS) Ven03/03 Lun06/03 M Mar07/03 M Mer08/03 M Jeu09/03 M Ven10/03 Lun13/03 M Jeu16/03 M Ven17/03 M+ SB AB AL SB AL AB AL AL AL SB AB AL AL AL ALSB Immunodtection, Analyse restriction, Electrophorse ADN Croissance (prparation cellules pour interaction XcpZ-Y) Bio-Informatique Type III- (salle Info) Prparations (milieux, tampons et autres solutions) Protocoles (salle TD) Sonication, Solubilisation dtergent, Colonne affinit(interaction XcpZ-Y) Prlvements chantillons (dosage galactosidase) PCR sur colonies, Electrophorse ADN 3 me confrence RT-PCR (salle TD) Prparation ARN SDS-PAGE & Coomassie (interaction XcpZ-Y), Dosages protiques et galactosidase FIL ROUGE Travail thorique FIL ROUGE Botes swiming twithching, test adhsion, shearing RT-PCR, Electrophorse ADN, test adhsion (lecture 6h) Test adhsion (lecture ON), SDS-PAGE & Western-Blot ( lecture botes, photos ME 4 me confrence Bilan final (salle TD) ECRIT Comptes-rendus rendre ORAL Shearing), AB : Aurlia Battesti ) SB : Sophie Bleves ) AL : Amel Latifi

6 6 Annexes Souches bactriennes P. aeruginosa PAO1 PAO1 xcpy PAO1 apre PAO1 xcpyz PAO1 flic PAO1 pila PAK pila flic E. coli DH5 Plasmides AB pgm ped psb4 psb52 psb3 pplasb ppapr ppxcp prk2013 Ap, Cb Ap, Cb Ap Ap Km Ap, Cb Tc Tc Km Anticorps polyclonaux (de lapins) Caractristiques Sauvage Délétion du gène xcpy dans la souche PAO1 Insertion Tn dans le gène apre de la souche PAO1 Délétion des gènes xcpz et xcpy dans souche PAO1 Délétion du gène flic codant pour la flagelline non flagélée Délétion du gène pila codant pour la piline des pili de type IV non piliée Mutations ponctuelles dans les gènes pila et flic dans la souche PAK F-, f80dlaczdm15, D(lacZYA-argF)U169, deor, reca1, enda1, hsdr17(rk-, mk+), phoa, supe44, l-, thi-1, gyra96, rela1 Production forme étiquetée de XcpZ 6His et XcpY (expression à partir ptac) Surproduction pseudopiline XcpT (expression à partir ptac) Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au résidu 232 Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au résidu 278 Fusion traductionnelle XcpY avec la -lactamase au résidu 363 Fusion transcriptionnelle promoteur lasb-lacz(lasb code pour l élastase) Fusion transcriptionnelle promoteur apradef-lacz Fusion transcriptionnelle promoteur xcpr-z-lacz Plasmide mobilisateur Anti élastase, Anti protéase alcaline, Anti XcpT, Anti XcpY, Anti 6 His Oligonuclotides lasb amont lasb aval rpoa amont rpoa aval L1 L2 R1 R2 5 TGGCGGCCACGAGGTCA 3 5 TTACAACGCGCTCGGGC 3 5 CATCGTTCAGCCCGGTC 3 5 AGGCAGTGGCCTTGTCGT 3 5 GAGAGGGCCCTAGGAGGTTGA3 5 CGCCTGCTGAAATTGTCGGAAG3 5 CCCTGCCCGTTCAACTGCTCCA3 5 TATACCCGGGACTCCACTCA3

7 7 Protocoles exprimentaux Croissances bactriennes Milieux de culture: P. aeruginosa est cultivé en milieu PIA (Pseudomonas Isolation Agar) ou milieu riche LB (Luria broth) supplémenté en cas de besoin par les antibiotiques suivants : carbénicilline (Cb) 500 g /ml, tétracycline (Tc) 200 g/ml. En milieu liquide, la Cb est utilisée à 300 g/ml, et la Tc à 50 g/ml.. E. coli est cultivée en milieu riche LB supplémenté en cas de besoin par les antibiotiques suivants : ampicilline (Ap) 50 g /ml, tétracycline (Tc) 15 g/ml, kanamycine (Km) 25 g /ml. Milieux d identification: A/ L lastase et la protase alcaline sont deux protéases, et leur activité enzymatique peut être mise en évidence sur deux types de boîtes, contenant de la caséine (boîte au lait ou skim-milk) ou de l élastine. L élastase utilise comme substrats l élastine et la caséine alors que la protéase alcaline n utilise que la caséine. Ces activités se traduisent par un halot d hydrolyse autour des colonies de Pseudomonas après 24 à 48h de croissance à 37 C. B/ Botes mobilit swiming (flagelle) et twitching (pili de type IV) Milieu LB semi-solide à 0.3% d agar (swiming). Milieu agar (1,5%) innoculé au cure-dent en traversant la gélose, puis coloration au cristal violet (twitching). C/ Botes activit phosphatase alcaline Milieu LB supplémenté de BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) à 0,4mg/ml.

8 8 Techniques de gntique Transformation voir Fascicule principes techniques Conjugaison 3 partenaires _ - Déposer sur une boîte LB sans antibiotiques, 10 l de la souche donnatrice et de la souche mobilisatrice NB Penser à réaliser tous les témoins Incuber 2h à 37 C (1 er contact= mobilisation) - Mettre la souche réceptrice pendant ces 2h à 42 C (inhibition des systèmes de restrictionmodification de l ADN) - Rajouter alors 10 l de la souche réceptrice Incuber au moins 4h à 37 C (2 ème contact) - Resuspendre le «patch» de bactéries dans 500 l de LB Etaler 200 l sur milieu sélectif PIA + antibiotiques et incuber O/N à 37 C NB1 les conjugants peuvent n apparaître qu après 24 à 48h. NB2 Réisoler les conjugants sur LB +antibiotiques, le milieu PIA n étant utilisé que pour la sélection des Pseudomonas.

9 9 Techniques de biochimie Prparation de protines scrtes - prendre la DO 600 des cultures de nuit * DO 600 inoculum de nuit quoi faut-il penser? - ensemencer 50 ml de milieu LB à une DO 600 initiale de 0,1 - incuber à 37 C sous agitation - prendre la DO 600 de chaque culture après une heure, puis suivre la croissance toutes les 30 minutes pendant la phase exponentielle de croissance puis toutes les heures jusqu à DO 600 = 4 Prélever et transvaser dans un eppendorf de 1,5 ml, 1 ml de culture à DO 600 1, 2 et 4 * tracer au fur et mesure sur papier semi-logarithmique la DO 600 en fonction du temps pour chaque souche - centrifugation de chaque prélèvement (10, 8000RPM) inutile de manipuler stérilement * le surnageant de culture contenant les protéines sécrétées est soigneusement transvasé dans un nouvel eppendorf, placé dans la glace puis 150 l de TCA 75% (acide trichloroacétique) sont ajoutés pour précipiter les protéines toute la nuit (ON) à 4 C * le culot cellulaire est repris à 1 U DO 600 par 50 l de tampon de charge SDS-PAGE puis conservé à 20 C (= C) - centrifuger les surnageants de culture que vous avez précipité ON à 4 C (30, 13000RPM), le surnageant est éliminé et le culot est lavé par 1 ml d acétone 90% - centrifugation (10, 13000RPM), éliminer tout l acétone et évaporer le reste d acétone en laissant les eppendorfs ouverts 5 min à 37 C. - le culot est repris à 1 U DO 600 par 10 l de tampon de charge SDS-PAGE (= SN) - dénaturer tous vos échantillons (C et SN) pendant 8 au bain marie bouillant * fermer soigneusement vos eppendorfs et veiller ce qu ils ne se remplissent pas d eau du Bain Marie! NB les centrifuger 5 secondes avant de les charger SDS-PAGE (Mini ProteanIII Biorad-) - monter le système (présenté dans le fascicule de principes techniques) - délimiter par un trait de marqueur la hauteur du gel de séparation ( 5 cm) * vrifier que le systme ne fuit pas en ralisant un essai avec de l eau Tant que l acrylamide n a pas polymris, il est toxique : MANIPULER AVEC DES GANTS - préparer dans 2 béchers (volume pour 2 gels)

10 10 gel de séparation (10%) gel de séparation (12%) gel de concentration Acrylamide 30% 6,6 ml 8 ml 0,8 ml H 2 0 8,4 ml 7 ml 4,8 ml Lower Tris 5 ml 5 ml Upper Tris 2 ml - QUAND VOUS ETES PRETS A COULER LE GEL de sparation ajouter 800 l d APS 1% et 25 l de TEMED dans le bcher correspondant, mélanger doucement et couler le gel à la pipette Pasteur jusqu au trait et vérifier le niveau (la surface doit être horizontale). Déposer délicatement à l aide d une pipette Pasteur de l eau distillée à la surface du gel. - quand le gel a polymérisé (vérifier avec ce qu il reste dans le bécher), éliminer l eau en retournant le système - ajouter 400 l d APS 1% et 8 l de TEMED dans le bécher du gel de concentration, mélanger doucement et couler le gel à la pipette Pasteur. Mettre immédiatement les peignes en évitant autant que possible de faire des bulles. - monter la chambre d électrophorèse, la placer dans la cuve et remplir les 2 compartiments de tampon d électrophorèse - enlever délicatement le peigne - charger la gamme étalon protéine, la protéase alcaline et l élastase pures, ainsi que l équivalent de 0,2 U DO 600 de cellules (C) et de 1 U DO 600 surnageant (SN) - appliquer 80V par système pour le gel de concentration, puis migrer à 150V - suivre la migration par l avancée du front du bleu et l arrêter avant qu il ne sorte ( 1h30) Tampon de charge SDS-PAGE : 2% SDS, 10% glycérol, 5% -mercapthoéthanol, 62,5mM Tris-HCl, ph 6,8, bout de spatule de BBP (Bromophénol Blue) Lower Tris : 1,5M Tris-HCl, 0,4% SDS, ph 8,8 Upper Tris : 0,5M Tris-HCl, 0,4% SDS, ph 6,8 Tampon d électrophorèse : 250mM Tris, 1,9M Glycine, 35mM SDS Western-blot - placer le gel dans du tampon de transfert ainsi qu un feuille de nitrocellulose et 6 feuilles de papier Whatman

11 11 - mettre dans l ordre sur la plaque de l appareil à blot (transfert semi-sec) en prenant soin d éliminer les bulles (en faisant rouler une pipette) : 3 feuilles de papier Whatman, la membrane de nitrocellulose, le gel, et enfin encore 3 feuilles de papier Whatman (voir schéma) * ne jamais toucher la feuille de nitrocellulose avec ses doigts --> des pinces mtalliques sont votre disposition 3 feuilles de papier Whatman le gel (attention aux bulles) la nitrocellulose 3 feuilles de papier Whatman Plaque appareil à blot - fermer le capot de l appareil à blot - transférer 35 min en se plaçant à 15 V limitant - quand le transfert est terminé, placer la feuille de nitrocellulose dans un bain de rouge ponceau (coloration temporaire des protéines), puis la transférer immédiatement dans un bain d eau. Agiter doucement, les protéines apparaissent en rouge. Quand la gamme étalon se détecte bien, repasser au stylo à bille les différentes bandes (94, 67, 43, 30, 20 et 14 kda), faire un point au niveau de la protéase alcaline (48 kda) ou de l élastase (30 kda) purifiée, puis venir me voir pour découper la membrane. Conserver les 2 morceaux de nitrocellulose dans du papier d aluminium à 4 C après décoloration totale dans de l eau. - immunodétection : incuber la membrane de nitrocellulose sous agitation - 30 min en TBS lait 5% Tween 20 0,1% - 1h30 en TBS lait 5% Tween 20 0,1% contenant soit Ac élastase (1/500), soit protéase alcaline (1/1000), XcpT (1/1000). - 3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0,1% - 1h en TBS lait 5% Tween 20 0,1% contenant Ac secondaire anti IgG de lapins marqué à la phosphatase alcaline (1/5000) - 3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0,1% - Placer la membrane dans 5 ml du kit de détection de l activité phosphatase alcaline (Western Blue( Stabilized substrate for alkaline phophatase Promega-). Agiter et laisser la coloration se développer et l arrêter en plaçant la membrane dans de l eau. La sécher dans du papier absorbant. Tampon de transfert : 48mM Tris, 40mM Glycine, 20% Et-OH TBS (10x) : 0,5M Tris-HCl, 1,5M NaCl, ph8

12 12 Coloration des gels de protines au bleu de Coomassie: Tampon de coloration Bleu de Coomassie 0.25% Ethanol Acide acétique H2O QSP 1 g 125ml 40ml 500ml Tampon de Décoloration 250ml d éthanol et 80ml d acide acétique, H2O QSP 1 litre. Solubilisation de protines de membrane interne - prendre la DO 600 des cultures de nuit - ensemencer 50 ml de milieu LB +AB à une DO 600 initiale de 0,1 - incuber à 37 C sous agitation - à DO 600 = 0,5-0,6 ajouter de l IPTG 2mM - incuber à 37 C pendant 3h 45 ml de culture (10, 5000RPM) - culot repris dans 6 ml de tampon NaPi + 60 l inhibiteur de protéases (campus J. Aiguier) - sonication 5X15 arrêts de 45 en glace 6 ml, 10, 3000RPM (élimination des débris cellulaires et bactéries non cassées) surnageant, 30, RPM campus J. Aiguier) NB culot de membranes totales est orangé culot repris dans 1,5 ml de tampon NaPi + DM (n-dodecyl-_-d-maltoside) 1% 30 en glace ajouter 375 l glycérol 30, RPM campus J. Aiguier) les protéines de membrane interne solubilisées se retrouvent dans le surnageant NB culot de membrane externe est translucide Tampon NaPi: NaH 2 PO 4 50mM, ph8 (ajuster avec NaOH) Purification de protines tiquette 6 His 1. Rincer la colonne avec 5 ml d H 2 O 2. Charger 0.5ml de 0.1M NiSO 4 3. Rincer avec 5ml d H 2 O 4. Rincer avec 10ml de tampon A 5. Passer l échantillon (Solubilisation de protines de membrane interne) 11. Rincer avec 10 ml de Buffer A + 50mM Imidazole

13 Elution : 1ml Buffer A + 100mM Imidazole 1ml Buffer A + 200mM Imidazole 1ml Buffer A + 300mM Imidazole 1ml tampon A + 400mM Imidazole 1ml tampon A +500mM Imidazole 13. Dosage des protéines et analyse sur gel SDS-PAGE (12%) du contenu de chaque fraction. Tampon A : 0.02M de tampon phosphate Na 2 HPO 4, 0.5M NaCl, glycérol 10%, ph 7.4. Dosage des protines totales Mthode Lowry: voir Fascicule de principes techniques Mthode Bradford: Gamme talon : Diluer 40 l d albumine bovine (BSA) 10mg/ml dans 960 l d H 2 O soit solution à 400 g/ml Faire la gamme (5 6 points ) dans les cuvettes : 200 l de BSA, 600 l d H 2 O et 200 l de réactif Bradford Mlanger 800 l d chantillon et 200 l de ractif Bradford. Incuber 5minutes temprature ambiante. Lire la densit optique 595. Penser raliser une courbe talon avec la BSA (albumine bovine). Dosage de la -galactosidase: Voir Fascicule de principes techniques pour connaître le principe 0.1ml de culture est dilu dans 0.9ml de tampon Z plus Mercaptothanol (27 l de Mercaptothanol pour 10 ml de tampon Z) plus deux gouttes de chloroforme et une goutte de SDS 0,1%. Vortexer 2 min, et placer dans un bain 28 C Incuber 10 minutes 28 C Prendre la DO 600 des cellules 0.2ml d ONPG (4mg/ml) est ajout pour dbuter la raction, le temps est alors not. Lorsque la couleur devient jaune, la raction est stoppe par adjonction de 0.5ml de Na 2 CO 3 1M. Le temps auquel le Na 2 CO 3 est ajout est not. La DO 420 est dtermine. Si le mlange est trouble, centrifuger au pralable afin d liminer les dbris cellulaires. NB Tmoins raliser?

14 14 L activit galactosidase est calcule partir de l quation suivante : Units Miller = (DO 420 *1000) / (t* v * DO 600 ) T = Temps coul entre l addition ONPG et addition de Na 2 CO 3 en min V = volume des cellules utilises en ml Tampon Z (ph7) 60mM Na 2 HPO 4 40mM NaH 2 PO 4 Conserver 4 C 10mM KCl 1mM MgSO 4 7H 2 O Na 2 CO 3 1M ONPG 4mg/ml prparer extemporanment en tampon phosphate 0.1M, ph 7,4 Tampon phosphate 0.1M ph 7,4 : 77,4 ml de Na 2 HPO4 1M et 22.6ml de NaH 2 PO4 1M, qsp 1 litre avec H 2 O distille.

15 15 Techniques de biologie molculaire Miniprparation lyse alcaline Centrifuger 1,5 ml de culture O/N Resuspendre le culot dans 100 l de Solution I Ajouter 200 l de Solution II vortexer brièvement et incuber 5 minutes à température ambiante Ajouter 150 l de Solution III, Vortexer Centrifuger 5 minutes Précipiter le surnageant par 270 l (0.6 vol) d isopropanol, vortexer Centrifuger 10 minutes Rincer le culot par 500 l d éthanol 70% Centrifuger 5 min éliminer le surnageant, laisser sécher 5-10 minutes et resuspendre dans 25 à 50 l d eau plus Rnase (1mg/ml) Solution I : 50mM glucose, 25mM Tris ph8, 10mM EDTA Solution II : 0.2N NaOH, 1%SDS Solution III : 2.55M KAcetate, ph 4.8 Miniprparation semi boiling Centrifuger 1,5 ml de culture O/N Resuspendre le culot dans 1ml de STET + 2 l RNase (1mg/ml préalablement bouillie) + 20 l Lysozyme (20mg/ml) Mettre les tubes à 95 C 7min Les remettre immédiatement en glace min, 13000RPM Enlever le culot (visqueux) au cure-dents Incuber 15 min à 37 C (action RNase) Ajouter 0,4ml AcNH4, 5M, ph5,5 et 0,9ml Isopropanol Mélanger par retournements min, 13000tr/min Eliminer le surngeant Laver avec 500 l Et-OH 70% min, 13000RPM Eliminer le surnageant et laisser sécher 5-10min, et resuspendre dans 20 à 50 l H 2 O

16 16 STET : Tris-HCl 0,1M, ph8, EDTA 50mM, sucrose 8%, Triton X100 0,5% Prparation d ARN NB : La lyse sera adaptée à Pseudomonas 3. Add 350 l Buffer RLT to the sample. Mix thoroughly by vortexing vigorously. If insoluble material is visible, centrifuge for 2 min in a microcentrifuge at maximum speed, and use only the supernatant in subsequent steps. If more than 5 x 108 bacteria are processed, additional homogenization with a QIAshredder homogenizer or a syringe and needle may increase RNA yield (see pages 20 24). Note: Ensure that ME is added to Buffer RLT before use (see Important notes before starting ). 4. Add 250 l ethanol (96 100%) to the lysate. Mix thoroughly by pipetting. Do not centrifuge. A precipitate may form after the addition of ethanol, but this will not affect the RNeasy procedure. 5. Apply the sample (usually 700 l), including any precipitate that may have formed, to an RNeasy mini column placed in a 2 ml collection tube (supplied). Close the tube gently, and centrifuge for 15 s at 8000 x g ( 10,000 rpm). Discard the flow-through. Reuse the collection tube in step 6. If the volume exceeds 700 l, load aliquots successively onto the RNeasy column, and centrifuge as above. Discard the flow-through after each centrifugation step.* 6. Add 700 l Buffer RW1 to the RNeasy column. Close the tube gently, and centrifuge for 15 s at 8000 x g ( 10,000 rpm) to wash the column. Discard the flow-through and collection tube.* Skip this step if performing the optional on-column DNase digestion (page 99). 7. Transfer the RNeasy column into a new 2 ml collection tube (supplied). Pipet 500 l Buffer RPE onto the RNeasy column. Close the tube gently, and centrifuge for 15 s at 8000 x g ( 10,000 rpm) to wash the column. Discard the flow-through. Reuse the collection tube in step 8. Note: Buffer RPE is supplied as a concentrate. Ensure that ethanol is added to Buffer RPE before use (see Important notes before starting ). 8. Add another 500 l Buffer RPE to the RNeasy column. Close the tube gently, and centrifuge for 2 min at 8000 x g ( 10,000 rpm) to dry the RNeasy silica-gel membrane. Continue directly with step 9, or, to eliminate any chance of possible Buffer RPE carryover, continue first with step 8a. It is important to dry the RNeasy silica-gel membrane since residual ethanol may interfere with downstream reactions. This centrifugation ensures that no ethanol is carried over during elution. Note: Following the centrifugation, remove the RNeasy mini column from the collection tube carefully so the column does not contact the flow-through as this will result in carryover of ethanol. 8a. Optional: Place the RNeasy column in a new 2 ml collection tube (not supplied), and

17 17 discard the old collection tube with the flow-through. Centrifuge in a microcentrifuge at full speed for 1 min. 9. To elute, transfer the RNeasy column to a new 1.5 ml collection tube (supplied). Pipet l RNase-free water directly onto the RNeasy silica-gel membrane. Close the tube gently, and centrifuge for 1 min at 8000 x g ( 10,000 rpm) to elute. Electrophorse d ADN - préparer un gel d'agarose 0,7% en TBE 0,5X faire bouillir au micro-ondes (salle de pesée) Laisser refroidir et ajouter une goutte de bromure d' éthydium (Bet) (0,625mg.ml -1 ) par 50ml de gel préparés * porter des gants: le Bet est mutagne chez les bactries et est souponn d tre cancrigne chez l homme Mettre les peignes et couler dans le support - rajouter 5 l de tampon de charge ADN dans chaque tube et charger 15 l de chaque échantillon sur le gel d'agarose Déposer 5 l de marqueur de taille (Smart ladder, Eurogentec) Tampon de charge ADN: 30% glycérol, 0,25% bleu de bromophénol, 0,25% - mercaptoéthanol TBE 20x 1,8M Tris, 40mM EDTA, 1,8M Acide Borique Vrification par PCR du gnotype d une souche La souche mutante de sécrétion de type II (PAO1 xcpy) utilisée lors de ce stage porte une délétion complète du gène xcpy, ce que vous allez vérifier par PCR avec les couples d'oligonucléotides appropriés sur colonies. L2 2,1kb R2 L1 1,4kb R1 xcpx xcpy XcpZ

18 18 Lyse des bactries - reprendre une colonie de PAOI ou PAO1 xcpy (une souche par groupe) dans100 l d'h 2 O et lyser les bactéries comme suit: 15' à -20 C, puis décongeler à 37 C, 15' à -20 C et 10' à 95 C (attention ce que l eau ne pntre pas dans les tubes!) centrifuger 5'' les échantillons PCR - préparer les mélanges réactionnels suivants dans des eppendorfs PCR sur la glace en ajoutant l enzyme quand tous les groupes sont prts lancer la PCR 5 l d'adn (bactéries lysées, PAOI ou PAO1 xcpy ) + oligonucléotide R1 ou R2 (20 pmol à partir solution à10pmol/ l) + oligonucléotide L1 ou L2 (20 pmol à partir solution à 10pmol/ l) + dntp (1mM final à partir solution 10mM) + tampon ADN polymérase (1X final) + MgCl 2 (1X final) + 1 l DMSO (limiter les structures secondaires ADN) H2O qsp 20 l +0,2 l ADN polymérase thermostable (Taq polymérase, 5U/ l) - programmation de l'appareil PCR ( 3h) 95 C 7' 95 C 1' 55 C 1' 30 cycles 72 C 1'30 72 C 10' Techniques de RT-PCR semi-quantitatives NB: Toutes les manipulations doivent tre ralises dans des tubes dpourvues de RNases 1/ Dcontamination la DNase : Pour chaque raction, raliser le mlange suivant : 1 g d ARN + 1 l de tampon DNase 10X + 1 l de DNase + 1 l d inhibiteurs de Rnases, H 2 O QSP 10 l.

19 19 Incuber minutes temprature ambiante. Inactiver la DNase par ajout de 1 l d EDTA 25mM. 2/ Raction de RT-PCR (en une tape) Pour chaque raction, raliser le mlange suivant : 25 l de tampon 2X + 1 g d ARN + 3 l du mlange des 2 amorces (10mM) + 1 l d enzyme + 1ml d inhibiteur de RNases QSP 50 l. Lancer le programme adquat. NB: Penser faire une raction dans les mmes conditions avec la polymrase afin de vrifier la non contamination avec de l ADN. Exemple de programmes Un cycle : 45 minutes 50 C (ceci correspond la raction de reverse transcription) 2 minutes 94 C Trente cinq cycles : 30 secondes 94 C 45 secondes 50 C 1 minute 70 C Un cycle : 5 minutes 72 C Taq NB: Rflchir aux cycles au quels devront tre faits les prlvements. Chaque prélèvement est analysé en chargeant 10_l de réaction plus 5 _l de tampon de charge ADN sur gel d agarose 1,5% en TBE 0,5X.

20 20 Test d adhrence en plaque polystyrne 24 puits - Remplir chaque puits par 1 ml de LB - A partir d une cultutre O/N en LB+/- antibiotique, inoculer chaque puits à 0,2 UDO 600 /ml (Penser à faire plusieurs puits pour une même souche : Contrôle DO 600 ; et à garder un puits sans bactérie : Contrôle négatif de contamination) - Incuber à 30 C, sans agitation, le temps voulu - Révéler en ajoutant 100µl de Crystal Violet (1X) dans chaque puits, sauf pour celui qui sert à mesurer le DO Laisser agir 10 à 15 min - Enlever le Crystal violet à l aide d une pipette non stérile - Rincer 2 fois à l H 2 0 sans toucher les parois - L anneau d adhérence violet s observe à l interface air-liquide - Quantification : Resuspendre l anneau avec 400µl d éthanol 95% ; Compléter avec 600µL d H 2 0!!!! et lire la DO à 600 nm Rasage (Shearing) " - Etaler les bactéries sur boîtes de Pétri carrées (LB +AB + IPTG frais 2mM) ON à 37 C - Re-suspendre les bactéries dans 1,8ml de LB, MgCl2 10mM NB DO 600 entre 5 et 10 - Les passer 3 fois dans une seringue équipée d une aiguille 19G RPM (centri eppendorf) - Récuperer 1,5ml de surnageant RPM - Récuperer 1,4ml de surnageant RPM - Récuperer 1,2ml de surnageant - Précipiter 1h dans la glace TCA (10% final) RPM - Laver le culot / 500 l acétone 90% RPM - sécher le culot à 37 C et resuspendre à 2UDO 600 /" l de SDS-PAGe loading buffer - 1U DO 600 sur gel Prdiction de la topologie d une protine transmembranaire, XcpY Les protéines intégrales de la membrane interne sont ancrées dans celle-ci par des segments d une vingtaine de résidus, dont la structure secondaire correspond à des hélices # hydrophobes. Une protéine possédant un segment transmembranaire est dite bitopique. Une

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