Etude du rôle de l inactivation d HNF1α dans la tumorigenèse hépatique
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- Marthe Vinet
- il y a 8 ans
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1 Etude du rôle de l inactivation d HNF1α dans la tumorigenèse hépatique Laura Pelletier, Sandra Rebouissou, Jessica Zucman-Rossi Inserm U674 «Génétique fonctionnelle des tumeurs solides»
2 Hepatocyte Nuclear Factor 1α: HNF1α 631 aa Domaine de dimérisation Domaine POU Homéodomaine Domaine de transactivation Domaine de liaison à l ADN Facteur de transcription à homéodomaine Impliqué dans la différenciation hépatocytaire Mutations bi-alléliques inactivatrices d HNF1α dans 40% des adénomes hépatocellulaires (AHC) (Bluteau et al. Nature Genet, 2002) HNF1α => gène suppresseur de tumeurs
3 Les adénomes hépatocellulaires mutés HNF1α Les mutations d HNF1α définissent un groupe homogène d adénomes, caractérisé par une stéatose marquée (Zucman-Rossi et al. Hepatology, 2006)
4 Objectif : Comprendre les mécanismes de tumorigenèse liés à l inactivation d HNF1α
5 Méthode : Analyse du transcriptome (Rebouissou et al. J Biol Chem, 2007) Puces ADNc et Affymétrix ( gènes) dans 8 AHC HNF1α-/- vs 8 Foies normaux appariés 597 gènes différentiellement exprimés gènes sous-exprimés gènes sur-exprimés Validation RT-PCR quantitative dans 16 AHC HNF1a-/- et 11 foies non tumoraux et validation protéique (WB)
6 Méthode : Mise au point d un système d inhibition d HNF1α par sirna HepG2 sirna ciblant les exons 8-9 d HNF1A Western Blot sirna HNF1α (nm) HNF1α β-actine 95 % d inhibition d HNF1α Validation - sirna HNF1α exon 3 - Hep3B et Huh7 Lipofectamine RNAiMax, 10 nm de sirna, 72h après transfection P value : *** P<0.001 Cibles connues d HNF1α : FABP1 : Fatty Acid Binding Protein 1 ; FGB : Fibrinogène
7 Conséquences de l inactivation d HNF1α : 1. Activation de voies métaboliques 2. Activation de voies oncogéniques 3. Phénotype
8 Résultats transcriptome : Activation de la lipogenèse (Rebouissou et al. J Biol Chem, 2007) Activation de la lipogenèse de novo spécifiquement dans les adénomes mutées HNF1α, indépendemment de SREBP1 et ChREBP Explique l importante stéatose observée dans ces tumeurs
9 Modèle cellulaire : Activation de la lipogenèse Activation de la lipogenèse après 7 j de sirna dans HepG2 HNF1a FASN *** * sirna HNF1a sirna Contrôle Western Blot ACACA ACLY * ** sirna Témoin HNF1α HNF1α FADS1 FASN SCD SREBP ACLY actin ARNm sirna/témoin ± SD RT-PCRQ 10 nm de sirna ; 7 jours après transfection P value : * P<0.05 ** P<0.01, *** P<0.001 FASN : Fatty Acid Synthase, ACLY : ATP Citrate Lyase, ACACA : Acetyl-CoA Carboxylase-A
10 Modèle cellulaire : Activation de la lipogenèse sirna contrôle 7 jours de sirna sirna HNF1α x40 x40 Coloration Red Oil O (colorant des lipides)
11 Conséquences de l inactivation d HNF1α : 1. Activation de voies métaboliques 2. Activation de voies oncogéniques 3. Phénotype
12 Résultats transcriptome : surexpression des oncogènes Cycline D1 et EEF1A2 (Rebouissou et al., résultats non publiés) Foies non tumoraux AHC mutés HNF1α eef1a2 Cycline D1 Western Blot Foies non tumoraux (N) n=10 AHC mutés HNF1α (T) n=16
13 Modèle cellulaire : surexpression des oncogènes Cycline D1 et EEF1A2 Expression de la cycline D1 Expression de EEF1A RT PCRQ ARNm Cycline D ARNm EEF1A C sirna HNF1α ex8-9 transfectés (nm) C sirna HNF1α ex8-9 transfectés (nm) Spearman R = -0,9758, P< Spearman R = -0,9880, P< HepG2, 72h après transfection sirna HNF1α (nm) sirna Témoin HNF1α Western Blot HNF1α Cycline D1 HNF1α EEF1A2 β-actine β-actin Résultats reproduits dans Hep3B et Huh7
14 Conséquences de l inactivation d HNF1α : 1. Activation de voies métaboliques 2. Activation de voies oncogéniques 3. Phénotype
15 Modèle cellulaire : Modification de la morphologie des cellules Microscope à contraste de phase Cellules HepG2 à 72h sirna Contrôle sirna HNF1α Résultats reproduits dans Hep3B et Huh7
16 Modèle cellulaire : Altération du cytosquelette d actine: HepG2 sirna Contrôle fluorescent sirnahnf1α + sirna contrôle fluorescent x63 x63 x63 72h x63 x63 x63 96h Phalloïdine sirna Control Résultats reproduits dans Hep3B et Huh7
17 Modèle cellulaire : Transition épithélio-mésenchymateuse Western Blot sirna HNF1α (nm) HNF1α E-cadhérine β-actine 10 nm sirna, 72h après transfection P value : ** P<0.01, *** P<0.001 Résultats reproduits dans Hep3B et Huh7
18 Modèle cellulaire : Migration en Chambre de Boyden HepG2 à 72h 200 ** Nb de cellules sirna Contrôle sirna HNF1a P value : ** P<0.01 (migration vers milieu 10% SVF) Les cellules transfectées avec le sirna HNF1a migrent 2,5 fois plus que des cellules HepG2 non transfectées.
19 Modèle cellulaire : Migration en test de blessure sirna contrôle 0 h 48 h 72 h sirna HNF1α
20 Conclusions Analyse transcriptomique des AHC mutés HNF1α Activation de voies métaboliques (lipogenèse) Activation de voies oncogéniques (cycline D1, EEF1A2) Modèle cellulaire d inactivation d HNF1α Validation des voies spécifiquement liées à l inactivation d HNF1α Transition epithelio-mésenchymateuse et augmentation de la mobilité cellulaire sans augmentation de la prolifération
21 Remerciements Inserm U674, Paris Equipe «Génétique des tumeurs hépatiques» Jessica Zucman-Rossi Sandra Rebouissou Yannick Ladeiro Gabrielle Couchy Karine Poussin Karine Bacri Mohamed Amessou Danijela Vignjevic, Institut Curie/CNRS UMR 144, Paris Inserm U889,Bordeaux Paulette Bioulac-Sage Charles Balabaud
22 EMT et AHC mutés HNF1a Bords flous, petits nodules, infiltration du tissu tumoral dans le tissu sain
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