Sujet d examen. Dynamique Membranaire. 1 heure. 8 janvier Alexandre Benmerah

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1 Sujet d examen Dynamique Membranaire 1 heure 8 janvier 2007 Alexandre Benmerah

2 Le complexe AP-2 est formé de quatre sous-unités, les adaptines α et β2 qui sont des protéines de 100 kd, et deux sous unités plus petites µ2 (50 kd) et σ2 (17 kd). Le complexe AP-2 est supposé jouer un rôle central dans la formation et la fonction des puits recouverts de clathrine en assurant à la fois l'assemblage de la clathrine à la membrane plasmique et la sélection des récepteurs à internaliser. Au sein du complexe AP-2, la sous unité α est supposé jouer un rôle important dans l'assemblage des puits recouverts de clathrine. Il a été suggéré que ces fonctions passent par l'interaction de l'α-adaptine par son domaine C-terminal avec de nombreuses protéines qui jouent un rôle accessoire dans l'assemblage des puits recouverts de clathrine et par son interaction par son domaine N-terminal avec les phospholipides membranaires (PIP2) participant ainsi au recrutement du complexe AP-2 à la membrane plasmique. Les modèles existants sur les fonctions possibles du complexe AP-2, ont été obtenus par différentes techniques classiques incluant, interactions protéines-protéines, protéines-lipides, expression de formes mutantes et microscopie électronique ou de fluorescence. Les expériences décrites ci-dessous ont eu pour but de tester ces différents points (rôle de l'αadaptine et de ces domaines fonctionnels dans l'assemblage et la fonction des puits recouverts de clathrine) en utilisant la technique d'interférence ARN (ou sirna). 1) Pour les figures 1, 3 et 4, décrire les résultats obtenus en justifiant vos réponses. La figure 2 a été incluse uniquement dans le but de décrire le système utilisé. (3x3 points). 2) Donnez un titre pour les figures 1 et 4. (2x2 points). 3) Est ce que ces résultats sont en accord avec ce qui a été proposé pour les fonctions de l'αadaptine (voir introduction ci-dessus)? (2 points). 4) Que suggèrent les résultats de la Figure 4 quant à l'effet de la fusion de l'α-adaptine avec la protéine fluorescente GFP? Quelle étape de l'endocytose est affectée dans les cellules n'exprimant que les formes GFP de l'α-adaptine? Comment pourrait on expliquer cet effet (2 possibilités)? Pour vous aider, les résultats obtenus avec les constructions earless (Figures. 3 et 4) sont importants. (5 points) 5) Dans des études dynamiques en microscopie de fluorescence sur cellules vivantes, certains auteurs ont suivi le complexe AP-2 en étiquetant l'α-adaptine avec la GFP en N ou en C- terminal. Sachant que l'expression transitoire de ces constructions n'a pas d'effet dominant négatif sur l'internalisation de la transferrine, que peut on en conclure sur l'utilisation de formes étiquetées à la GFP pour suivre la dynamique d'ap-2? (2 points bonus)

3 b a c d Figure 1. (A) Equal protein loadings of homogenates from control and sirna-treated cells (α or µ2) were subjected to SDS-PAGE, and Western blots were cut in four and probed with the indicated antibodies (α: α-adaptin; CHC: clathrin heavy chain; µ2; actin). (B) clathrin-coated pits (arrowheads) associated with the plasma membrane of control cells (a) or with the plasma membrane of cells treated with sirna to knock down expression of AP-2 (b-d). (C) Quantification of (B) by morphometry in control and AP-2 depleted cells. Figure 2. (A) Schematic diagram of the two endogenous α-adaptin isoforms (αa and αc) and of the three α-adaptin constructs which have been tagged with a brain specific epitope and which are also resistant to sirna treatment due to the introduction of point mutations in the sirna target sequence. The epitopes recognized by the used antibodies are indicated in the bottom of the figure. (B) Homogenates of control cells and cells stably transfected with the brain-tagged α-adaptin constructs, either with or without treatment with an sirna to deplete endogenous α, were subjected to SDS-PAGE and blotted, and the blots were probed with antibodies against αa, αc or µ2. The αa antibody does not cross-react with the α- adaptin constructs. The αc antibody recognizes both the endogenous protein (arrow) and the α-adaptin constructs (asterisks).

4 Figure 3. (A) Cells stably transfected with the indicated brain-tagged α-adaptin constructs were depleted of endogenous α-adaptin and labeled with an antibody against the brain epitope. (B) Receptor-mediated endocytosis of transferrin in cells expressing the brain-tagged α-adaptin constructs. Cells were allowed to bind 125 I-labeled transferrin at 4 C and then shifted to 37 C for the indicated length of time, internalization of transferrin was indicated as % total initial binding. The cells used for the positive control were neither transfected with α- adaptin constructs nor treated with sirna; the cells used for the negative control were treated with sirna only. All other cells were stable cell lines expressing brain-tagged α-adaptin constructs, which were depleted of endogenous α using sirna.

5 a b Figure 4: (A) Schematic diagram of the two GFP-tagged α-adaptin constructs. (B) Homogenates of control cells and cells stably transfected with the GFP-tagged α-adaptin construct, either with or without treatment with an sirna to deplete endogenous α, were subjected to SDS-PAGE and blotted, and the blots were probed with antibodies against αa or αc. (C) Localization and behavior of GFP-tagged α in cells depleted of endogenous α. (a and b). Cells were incubated with Alexa Fluor 594 conjugated transferrin for 30 min at 37 C then washed, fixed and then analyzed by fluorescence microscopy. Black and white images of green (a) and red (b) staining are shown. The focus was made on the adherent surface of the cells and a representative region was enlarged. Arrows stress colocalization of the two markers. (D) Receptor-mediated endocytosis of transferrin in cells expressing GFP-tagged α constructs (full length ( ) or earless/truncated (ρ)) as in Figures 3B.

6 Corrigé: 1+2) Les titres donnés ne sont que des propositions, tout titre contenant ces mots clefs ou synonymes ont été acceptés. Chaque mot clef présent dans le titre permet d accumuler des points. Figure1 : titre : Le complexe AP-2 est requis pour la formation des puits recouverts de clathrine à la membrane plasmique. A- Dans les cellules traitées avec des sirna contre les sous-unités α ou µ2 du complexe AP-2 on note une diminution drastique de l expression des chaînes correspondantes (α ou µ2) comme le montre la disparition du signal en Western-blot pour chaque sous-unité (α ou µ2) en comparaison avec les cellules contrôles. De plus, parallèlement à l extinction de l expression des sous-unités cible de chaque sirna (α ou µ2) on observe une diminution de l expression de l autre chaîne (µ2 pour α et a pour µ2) comme le montre la diminution du signal en Western-blot de l expression de la chaîne µ2 dans les cellules traitées avec des sirna contre a et vice versa. Cette diminution des chaînes a et µ2 semble spécifique puisque le signal en Western blot pour la chaîne lourde de la clathrine ou pour l actine n est pas diminué dans les cellules traitées avec des sirna contre les chaines du complexe AP-2. Ces données suggèrent que les sirna conte les différentes chaînes des complexe AP-2 sont spécifiques, mais qu en absence d une des sous-unités c est l ensemble du complexe AP-2 qui est déstabilisé. B et C- L analyse en microsocopie électronique des cellules contrôles et traitées avec des sirna contre le complexe AP-2 montre la présence de puits recouverts de clathrine à la membrane plasmique de toutes les cellules. Cependant l analyse morphométrique et la quantification des images montrent une réduction très importante du nombre de puits recouverts de clathrine à la surface des cellules traitées avec des sirna dirigés contre le complexe AP-2 en comparaison avec les cellules controles. L ensemble de ces données montrent donc que le traitement de cellules avec des sirna dirigés contre les sous-unités α ou µ2 du complexe AP-2 réduit de façon très importante et spécifique l expression du complexe AP-2 et que cette diminution d expression s accompagne d une diminution très importante (90%) du nombre de puits recouverts de clathrine présents à la membrane plasmique. Ces données sont donc en accord avec le rôle supposé central du complexe AP-2 dans l assemblage des puits recouverts de clathrine associés à la membrane plasmique. Figure 2 : n était pas à décrire Cette figure vous présente le système expérimental utilisé dans les figures 3 et 4. Brièvement, les auteurs ont réalisé des constructions chimériques des deux isoformes de l αadaptine en échangeant la région C-terminale de la sous-unité αc par celle de l αa qui présente un épitope spécifique du cerveau (reconnu par l anticorps anti-brain). Ces trois constructions chimériques présentent en plus une mutation dans leur région N-terminale les rendant insensible au sirna dirigé contre la sous-unité α (wt) et une mutation du site de liaison au PIP2 (PIP2) ou une délétion de la région C-terminale (earless). Ces trois constructions ont été transfectées de façon stable dans des cellules. L analyse en Westernblot de ces lignées cellulaires montre qu en absence de traitement sirna, toutes ces chimères sont co-exprimées avec la forme endogène de façon comparable, en présence de sirna contre la forme α endogène seules les chimères sont exprimées. La quantité totale de

7 complexe AP-2 dans les cellules traitées avec des sirna ne varie pas comme le montre le WB contre la chaîne µ2. En conclusion, les lignées stables permettent d obtenir des cellules qui, en présence de sirna contre l α-adaptine endogène, vont exprimer uniquement les formes chimériques de l α-adaptine et qui vont donc remplacer les formes endogènes au sein des complexes AP-2 et permettre ainsi de tester le rôle fonctionnel des différents domaines de l α-adaptine. Figure 3 : A. Les cellules exprimant les différentes chimères présentées dans la figure 2 ont été traitées avec des sirna pour dépléter la forme endogène de l α-adaptine. Ces cellules ont ensuite été marquées avec l anticorps qui permet de suivre spécifiquement les formes chimères de l α-adaptine (anti-brain). Les images montrent que les trois formes wt, PIP2 et earless présentent une distribution similaire sous la forme de petits points distribués sur toute la surface de la cellule. Ces données montrent que toutes les chimères sont bien exprimées en présence de sirna et suggèrent que les deux formes mutantes PIP2 et earless sont capables de remplacer la forme endogène de l α-adaptine en ce qui concerne la localisation du complexe AP-2 à la membrane et donc vraisemblablement dans l assemblage des puits recouverts de clathrine à la membrane plasmique. Certains d entre vous ont cru voir des différences surtout pour PIP2 qui semble présenter un marquage diffus cytoplasmique plus fort. En absence de quantification réelle des images, j ai accepté ces réponses. B. Les cellules exprimant les différentes chimères traitées par des sirna contre l α-adaptine endogène et des cellules contrôles traitées (negative control) ou pas (positive control) par les mêmes sirna ont été testées pour leur capacité à internaliser de la transferrine, le marqueur de l endocytose dépendante des puits recouverts de clathrine. Les résultats obtenus montrent que les cellules exprimant les chimères wt et earless internalisent la transferrine de façon tout à fait similaire au contrôle positif. Les cellules exprimant la chimère mutante PIP2 ont un phénotype intermédiaire étant toujours capable d internaliser de la transferrine, plus que control négatif mais moins que celles cellules du contrôle positif. L ensemble de ces données suggèrent que bien que toutes les chimères semblent capables de remplacer la forme endogène de l α-adaptine pour assembler des structures AP-2 positives à la membrane plasmique (puits recouverts de clathrine?), les structures formées par les complexes AP-2 contenant la chimère présentant une mutation du site de liaison au PIP2 ne semblent pas complètement fonctionnelle quant à sa capacité à remplacer la sous unité endogène pour l internalisation de la transferrine. Explication avec moins de puits formés par la chimère PIP2 acceptée (cf ci dessus) Figure 4 : titre : la fusion de la GFP sur l extrémité C-terminale de l α-adaptine inhibe spécifiquement l étape d internalisation.. A. Les auteurs ont réalisé de nouvelles formes chimères de l α-adaptine en fusionnant la GFP à l extrémité C-terminale de la forme complète ou de la forme mutante earless. Ces constructions aussi résistantes aux sirna ont été transfectées de façon stable dans des cellules et utilisées par la suite pour des expériences similaires aux précédentes (Figures 2 et 3). B. La chimère α-adaptine sauvage fusionnée à la GFP s exprime de façon stable dans les cellules (WB anti-αc). L expression de la forme chimère ne modifie pas l expression de la forme endogène dans les cellules (WB anti-αa). Le traitement des cellules avec les sirna contre l α-adaptine endogène inhibe bien l expression des formes endogènes (marquage αa ou αc) mais pas celle de la fusion GFP.

8 C. Des cellules exprimant de façon stable la fusion α-adaptine à la GFP et traitées avec les sirna ont été incubées avec de la transferrine marquée au fluorochrome Alexa594 pendant 30 minutes à 37 C. Les images montrent une localisation ponctiforme de la fusion α- adaptine à la GFP qui représente vraisemblablement une localisation au sein des puits recouverts de clathrine et suggère que la fusion GFP est correctement adressée et capable de remplacer la déplétion de la forme endogène pour assembler des puits à la membrane. La transferrine Alexa594 est retrouvée colocalisée dans ces structures associées à la membrane plasmique. Ce dernier résultat est inattendu car, après 30 minutes d incubation, la transferrine est normalement internalisée (70% à 10 minutes, voir figures 3B et 4D) et donc retrouvée dans les endosomes. Ces données suggèrent que la fusion GFP est capable de remplacer l α-adaptine endogène pour assembler des puits, que ces puits seraient capables de concentrer la transferrine et son récepteur, mais que ces puits ne seraient pas capables de donner naissance à des vésicules. D. La capacité des chimères GFP à remplacer l α-adaptine endogène pour l internalisation de la transferrine a été testée de façon similaire à la figure 3B. Les résultats montrent que les fusions GFP (sauvage ou tronquée/earless) ne sont pas capables de complémenter l absence d α-adaptine endogène, l internalisation de la transferrine dans les cellules exprimant de façon stable ces fusions et traitées avec les sirna présente une internalisation de la transferrine similaire au contrôle négatif. 3) Les résultats obtenus ne sont que partiellement en accord avec les modèles proposés pour les fonctions de l α-adaptine. L α-adaptine joue bien un rôle central au sein du complexe AP-2, sa déplétion entraîne une absence presque totale de puits recouverts de clathrine et l endocytose dépendante de la clathrine (transferrine). Cependant, ces expériences reflètent plutôt les fonctions du complexe AP-2 puisque ces phénotypes sont retrouvés avec la déplétion de la sous-unité µ2. La liaison au PIP2 membranaire semble jouer un rôle important comme attendu. Les chimères présentant une mutation de ce domaine ne sont pas capables de transcomplémenter l absence d α-adaptine (endocytose de la transferrine). Par contre, le résultat le plus étonnant est que le domaine C-terminal de l α-adaptine ne semble pas requis pour les fonctions de l α-adaptine, la chimère earless complémente l absence d α-adaptine (assemblage puits et endocytose transferrine). 4) La fusion de la GFP en C-terminal de l α-adaptine génère une protéine chimérique qui n est que partiellement capable de remplacer la déplétion de l α-adaptine endogène. Les données de la figure 4 montrent que la fusion GFP de la forme complète est bien adressée dans des structures ponctiformes a la membrane plasmique montrant que cette fusion GFP est capable d assurer l assemblage de puits recouverts de clathrine. Ces puits recouverts de clathrine contiennent de la transferrine et sont donc fonctionnels pour sélectionner les récepteurs à internaliser. Par contre, ces puits recouverts formés en présence de la fusion GFP ne semblent pas capable de donner naissance à des vésicules puisque l endocytose de la transferrine est très fortement inhibée dans les cellules exprimant la fusion GFP et traitées par les sirna. Comment expliquer cette inhibition? La GFP a été fusionnées à l extrémité C-terminale de l α-adaptine, un domaine qui comme précisé dans l introduction est impliqué dans de nombreuses interactions avec des protéines accessoires des puits recouverts de clathrine. La présence de la GFP en aval de ce domaine fonctionnel pourrait donc perturber ces interactions et expliquer les résultats obtenus. La comparaison des résultats obtenus avec les constructions dépourvues du domaine C- terminal montrent que ce domaine ne semblent pas requis pour les fonctions de l a-adaptine.

9 Il est donc peu vraisemblable que l effet négatif de la GFP passe par une inhibition des interactions des partenaires de la région C-terminale. Une autre hypothèse est donc que la GFP par elle même présente un effet dominant négatif sur l endocytose. Elle ne semble pas inhiber l étape d assemblage mais plutôt l étape de formation des vésicules. Elle pourrait donc par encombrement stérique inhiber l'incorporation au sein des complexes AP-2, les étapes d invagination membranaires, bloquer le recrutement de la dynamine, l assemblage de clathrine etc 5) Dans les études par transfection transitoire, les chimères GFP sont exprimées en présence de la protéine endogène et l expression de ces chimères dans ces conditions ne semble pas avoir d effet dominant négatif sur l endocytose de la transferrine, effet dominant négatif qui semblent être observé uniquement quand la chimère GFP est la seule source d αadaptine cellulaire. La possibilité que la chimère soit fonctionnelle lorsqu'elle est diluée en présence d'a-adaptine endogène reste à démonter. Ces constructions pourraient donc être a priori utilisées pour suivre la dynamique du complexe AP-2. Le problème est que si la présence de la GFP inhibe effectivement les fonctions de l α-adaptine à laquelle elle est fusionnée et donc celles du complexe AP-2 qui contient la chimère GFP, on risque de suivre uniquement des complexes qui ne seraient pas fonctionnels (incapables d être incorporés dans des vésicules en formation). Il reste possible que la fusion de la GFP en N-terminal de l α-adaptine ne présente pas les mêmes effets que la fusion en C-terminal, ce qui reste à tester dans le système expérimental présenté dans la figure 4. Deux papiers ont servi a faire ce sujet: 1: Motley AM, Berg N, Taylor MJ, Sahlender DA, Hirst J, Owen DJ, Robinson MS. Functional analysis of AP-2 alpha and mu2 subunits. Mol Biol Cell Dec;17(12):5298-2: Motley A, Bright NA, Seaman MN, Robinson MS. Clathrin-mediated endocytosis in AP-2- depleted cells. J Cell Biol Sep 1;162(5): Deux autres études ont utilisé différentes chimères GFP de l'α-adaptine: 1: Rappoport JZ, Benmerah A, Simon SM. Analysis of the AP-2 adaptor complex and cargo during clathrin-mediated endocytosis. Traffic Jul;6(7): : Wu X, Zhao X, Puertollano R, Bonifacino JS, Eisenberg E, Greene LE. Adaptor and clathrin exchange at the plasma membrane and trans-golgi network. Mol Biol Cell Feb;14(2):