RNA interference. Charles Lecellier. Institut de Genetique Moleculaire de Montpellier CNRS UMR IFR 122
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- Josiane Leclerc
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1 RNA interference Charles Lecellier Institut de Genetique Moleculaire de Montpellier CNRS UMR IFR Route de Mende Montpellier Cedex 5 Phone : 33 (0) Fax : 33 (0) charles.lecellier@igmm.cnrs.fr
2 Chalcone synthase Co-suppression (CS) in transgenic Petunias Opposite phenotype P CS T CS transgene No CHS mrna RNA silencing
3 dsrna as a key molecule for RNA silencing activation P X T 2-3 % of silenced lines 80 % silenced lines P X T 2-3 % silenced lines P X X T 95 % silenced lines
4 dsrna as a key molecule for RNA silencing activation injected GFP dsrna RNA interference (RNAi): C.elegans Fire et al., 1998 Sense or antisense single stranded RNA had no effect Sequence-specific Systemic General phenomenon in animals: planarians, drosophila, mouse.
5 Mediator molecule of RNA silencing? a nucleic acid Causing degradation of sense RNA GFP Silenced GFP Non silenced antisense RNA? No consistent detection of high molecular weight antisense RNA in various RNA silencing systems Low molecular weight antisense RNA? 15% PAGE sense RNA detected in same abundance Template = dsrna? 21-23nt antisense GFP RNA
6 21-23nt RNAs universal markers of RNA silencing H 2 O RNAi
7 Hypothesis: dsarn RNAse-III? Sequence-specific degradation of target RNA 25nt RNA Bernstein et al., 2001
8 21-25nt RNAs are the specificity determinants of RNA silencing in drosophila lysates Dicer P 2nt P 5 P P sirna small interfering RNA synthetic 21nt RNA OH OH Target mrna 5 p 32 3 Drosophila embryo lysate +ATP +creatin kinase 11nt Endonuclease - AGO2 5 p 32 3 Elbashir et al., 2001
9 RNAi in drosophila lysates cyclin E dsrna mrna sirna Hammond et al., 2000 RNA-Induced Silencing Complex (containing AGO2)
10 Core reactions of RNA silencing dsrna Dicer sirna RISC targeted mrna degradation
11 Viral replication produce dsrnas TMV viruses produce proteins as a counter-defense
12 Suppression of RNA silencing is a general property of plant viruses CMV TBSV RYMV ACMV Etc.. Protein 2b Protein P19 Protein P1 Protein AC2 Proteins diverse in: -structure -sequence RNA and DNA viruses
13 P PRSV PRSV T PRSV dsrna PRSV sirnas Papaya ringspot virus (PRSV) Loaded RISC PRSV viral RNA HcPro preloaded RISC
14 21-25nt RNAs are the specificity determinants of RNA silencing (II) OH OH lamin A/C sirna Hela Cells (lipofectamine 2000 transfection) Elbashir et al., 2001b
15 choix de la séquence sirna Consultation de la littérature Algorithmes (e.g. Dharmacon, Qiagen..) 1- recherche dans la région codante de l ARNm cible de 21 nucléotides commençant par motifs AA ou NA (sirna avec débordement dinucléotides UU en 3 sont plus puissants) 2- sélection d une zone ayant 30-50% GC (fort taux GC en 3 antisens et faible taux en 5 ) 3- éviter la région bp après AUG contenant des sites polymorphiques et/ou occupés par protéines régulatrices 4- le motif dinucléotide leader AA/NA ne fait pas partie du duplex final 5- choisir 2-4 séquences cibles/gène (1/2 sirna diminue ARNm cible de 50% et ¼ de 75%) 6- éviter les séquences cibles qui présentent bases contigües similaires (BLAST pour chercher autres gènes similaires) 7- rechercher une complémentarité possible entre région seed du sirna et autres séquences 3 UTR (BLAST)
16 Méthode conventionnelle AUG mrna 5 NA AAAA -3 UTR bases UTR 21 base target sequence GCCANACGUUGCAAUAGCUUAGUACTTGAG Synthesis Annealing sirna duplex CGUUGCAAUAGCUUAGUACTT TTGCAACGUUAUCGAAUCAUG Sens Antisens
17 Méthodes de synthèse de sirna Synthèse chimique Transcription in vitro Digestion ARNdb long in vitro par Dicer ou RNase III Expression par un plasmide ou vecteur viral (psilencer, psuper ) Utilisation d un backbone mirna
18 Mise en œuvre in vitro Transfection ou infection des cellules avec vecteur d expression codant un shrna (plasmide, virus) Lipofection des cellules avec formulations synthétiques de sirnas cinétiques, viabilité, dose-réponses
19 Contrôles pour expériences d ARNi Contrôle positif Optimisation et suivi de l efficacité de transduction 1- ciblage d un gène abondant et d expression constitutive (GAPDH, Lamin A/C, Cyclophilin B) 2- pas d effet sur la viabilité cellulaire 3- pas d effet sur le phénotype cellulaire 4- test de mesure de l inhibition aisé Contrôle négatif Différentier inhibition séquence-spécifique des effets non-spécifiques 1- ne doit cibler aucun gène cellulaire connu (siluc, sigfp, Non-targeting sirna) 2- pas d effet sur la viabilité cellulaire 3- pas d effet sur le phénotype cellulaire 4- Contrôler les effets off-target (RNAi non spécifique) Contrôle de transfection Déterminer les conditions optimales d administration 1- signal fluorescent dont la détection ne fait aucun doute sur la pénétration cellulaire (siglo) 2- intensité du signal dépendante l efficacité d entrée des sirnas et de l ARNi Contrôle non traité Définir le taux basal de viabilité et d expression du gène cible 1- culture cellulaire en absence de sirna pmaxgfp pmaxgfp + sigfp
20 Mise en œuvre in vivo Injection systémique de sirnas nus possible mais rarement utilisée: nucléases et élimination rénale Injections locales peu efficaces: problèmes de pénétration dans les tissus, organes (sauf cas particulier, e.g. VEGFR et MAD) Nécessité d associer sirnas aux techniques de transfert de gènes: - vecteurs synthétiques (liposomes, chitosan, nanoparticules ) - modifications chimiques (greffage cholestérol, PEG ) - vecteurs d expression plasmidiques ou viraux (LV, AAV ) - méthodes physiques (hydrodynamique, électroporation )
21 Modifications chimiques et vecteurs synthétiques Bénéfices des modifications chimiques et formulations de sirnas 1- stabilité thermique supérieure 2- résistance aux nucléases 3- biodistribution améliorée 4- entrée dans les cellules cibles 5- ciblage tissu-spécifique 6- diminution des effets off-target Corey (2007) JCI 117(12):
22 Constructions virales Clonage du shrna sirna problèmes identiques à ceux de la thérapie génique: shrna - efficacité de transduction du tissu cible - spécificité du ciblage - toxicité - immunogénicité H1 Production du plasmide ou virus
23 Multi-gene RNAi using mirna-based shrnas against HIV sirna/shrna efficiently inhibit HIV-1 replication Rapid emergence of RNAi-resistant escape viruses due to deletions/mutations abolish the antiviral effect + Viral suppressors Design of multi-sirna hairpin vectors targeting for durable inhibition of escape-prone HIV-1 viruses Brake et al. (2009) Gene Therapy 16, Brake et al. (2006) Mol Therapy 14, Prom1 5 mir shrna1 3 mir Prom2 5 mir shrna2 3 mir Prom3 5 mir shrna3 3 mir Liu et al. (2007) Nucleic Acids Res 35, p positioning of the sirna at the base of the hairpin stem yields optimal RNAi activity without triggering the innate antiviral IFN response
24 endogenous RNAi effectors in mammals Röther et al., Biochimie 2011
25 gdna NUCLEUS CYTOPLASM Pre-miRNA Exportin 5 Pri-miRNA Drosha Dicer translational repression target mrna P asymetric RISC assembly RISC P Processing (P)-bodies
26 Nature Reviews Genetics 12, (February 2011)
27 Nature Reviews Genetics 12, (February 2011)
28 Possible mechanisms of mirna-mediated repression Chekulaeva M and Filipowicz W., Current Opin Cell Biol 2009
29 fundamental roles of mirnas in mammals Knocking out Dicer in mouse mir-181 induces B cell differentiation in vitro and in vivo - Chen et al., 2004 Bernstein et al.,2003 developmental arrest in mouse embryo Each cell type produces a specific mirna repertoire
30 SOME EXAMPLES Feb mirnas & Cancers NCBI Entrez Pubmed pubmed - mirna pubmed - mirna and cancer count count percentage , , , , , , , , , , , , Lets take some examples from the lab
31 I. mirna profiling as diagnostic and prognostic markers (mirnas present in all biological fluids) II.Novel anti-cancerous therapies aimed at modulating (restoring) mirna expression Pharmacological modulations of mirna expression (transcriptional regulation) mirna inhibition : antisense oligonucleotides (LNA, 2 Ome, ) intravenous injection is efficient mirna enforced expression : new gene therapy vectors containing mirna precursors
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