Inhibition du facteur de transcription Stat 3 par la technique des sirnas, une thérapie à l horizon? Année

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1 Année Inhibition du facteur de transcription Stat 3 par la technique des sirnas, une thérapie à l horizon? MENARD Baptiste LABORDE DIT PERE Samuel 1

2 SOMMAIRE RESUME..3 I.INTRODUCTION....4 A. Le facteur de transcription STAT Rôle cellulaire Mécanisme Structure Gènes régulés via Stat 3 5 B. La technique des sirna Principe Les Enzymes. 8 a. DICER.8 b. RISC (RNA inducing silencing complex) Le «design» des sirnas Les différents modes de synthèse...10 a. Synthèse enzymatique in vitro...10 b. Synthèse de pool de sirnas par DICER recombinante..10 c. Synthèse chimique...11 d. Synthése de shrna (small hairpin RNA) par le biais de plasmides..12 e. Synthèse de shrnas par le biais de vecteurs Les contrôles nécessaires 14 a. Contrôle via des sirnas portant une mutation...14 b. Le «rescue» contrôle.14 c. Contrôle via des puces à ADN II. ANALYSE DE LA PUBLICATION [22] Expression de STAT 3 par les cellules PC3, LNCaP et par des tissus cancéreux Extinction de l expression de STAT 3 par la technique des sirna Expression des «short hairpin RNA» (shrna) par les cellules PC Calcul de l énergie libre et prédiction de la structure secondaire L inhibition de l expression de Stat 3 supprime l expression des gènes cibles Le sirna Stat 3-3 inhibe la croissance et la survie des cellules PC L activité anti-tumorale de Stat 3-3 in vivo 20 III. DISCUSSION...21 IV. PERSPECTVES : Les sirnas, une thérapie à l horizon?...24 V. BIBLIOGRAPHIE.26 ABBREVIATIONS ARNdb: ARN double brin; ARNi: ARN interference; Chol-siRNA: Cholesterol sirna; Dadr: Dicer associated double stranded RNA binding protein; JAK: Janus kinase; GAS: gamma interferon activated sequence; mirna: Micro ARN; PAZ: Piwi/Argonaute/Zwille; P-Stat3: Stat3 phosphorylé (forme active); RLC: RISC Loadig Complex; SH2: SRC homology domain 2; ShRNA: Small hairpin RNA; SiRNA: Small interference RNA; STAT 3: Signal Transducer Activator of Transcription 3; SOCS: Suppressor of cytokine signalling; TAD: Trans activating domain; VEGF: Vascular Endothetial Growth Factor; VEGF R2 vascular endothelial growth factor receptor-2. 2

3 RESUME La protéine Stat 3, est un facteur de transcription, présente sous forme monomérique et inactive de façon constitutive dans le cytoplasme. Une fois activées par des stimuli extérieurs via des récepteurs tyrosine kinase les formes monomériques sont phosphorylées sur leur tyrosine 705 ce qui induit la dimérisation des sous unités pour former un homodimère actif capable de passer la membrane du noyau grâce à une importine. Une fois dans le noyau le facteur de transcription Stat 3 se fixe à l ADN sur la séquence consensus GAS et induit l expression de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (Cyclin D1, c-myc) et dans l inhibition du phénomène d apoptose (Bcl-xL, Bcl-2, survivin). Ceci confère un caractère tumoral aux cellules. Dans le cas du cancer de la prostate il y a une surexpression du facteur de transcription Stat 3, c est pourquoi l équipe de Gao a ciblé cette protéine par le biais de la technique des «small interference RNA». La technique de sirna permet de sous réguler l expression d un gène de manière spécifique et post-translationelle. Suite à l entrée de fragments d ARNdb d une longueur de 40 à 50 pb dans la cellule par le biais de plasmides ou de vecteur viraux, l enzyme DICER,RNAse de type III, reconnaît ces fragments et les coupent en petits fragments de 21 pb hybridés sur 19 pb et avec 2 extrémités UU 3 sortantes, les sirnas. Ces sirnas sont ensuite reconnus par le complexe RISC, un seul des 2 brins du sirna est fixé par le complexe, l autre étant détruit par les RNAses de la cellule. Ce complexe ribonucléique va ensuite s hybridés par appariement des bases aux messagers endogènes du gène ciblé et induire son clivage. Le gène est donc sous régulés de manière post-translationnelle et spécifique. Les auteurs ont montrés qu il était possible de sous réguler l expression de Stat 3 dans des cellules tumorales de cancer de la prostate (PC3 et LNcaP) via la technique des sirnas de manière in vitro et in vivo sur des tumeurs de souris auxquelles on avait préalablement injecté des cellules tumorales. Cette expérience permet d envisager cette technique en tant que thérapie dans le cas du cancer de la prostate pour l homme. Par ailleurs, malgré la bonne spécificité d action des sirnas, l électroporation, méthode d entrée des sirnas dans la cellule utilisés par les auteurs semble difficilement envisageable dans le cas de thérapies appliquées à l homme. C est pourquoi les problèmes du ciblage des cellules malades de manière spécifique et la stabilité des sirnas dans la cellule reste la préoccupation principale. Par ailleurs il est a noté que des essais cliniques sont à l heure actuelle en cours aux Etats- Unis pour traiter la dégénérescence de la macula. 3

4 I.INTRODUCTION A. Le facteur de transcription STAT 3 1. Rôle cellulaire La protéine STAT 3 est un transducteur de signal, qui une fois dans le noyau entraîne la transcription de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et le mécanisme d apoptose [1]. Elle appartient à la super famille STAT composée de 7 membres qui répondent tous à des stimuli extérieurs. STAT 3 est impliqué dans la réponse à diverses cytokines notamment l interleukine 6. [2] La protéine Stat 3 est donc activée par l intermédiaire de récepteurs membranaires qui eux même sont activés par la fixation d un ligand comme les cytokines, les interférons ou les facteurs de croissance. Les récepteurs impliqués dans l activation de Stat 3 sont des récepteurs tyrosine kinase (JAK «Janus kinase», src) aux facteurs de croissance, aux cytokines, ou des récepteurs non tyrosine kinase. [3] 2. Mécanisme L état de Stat dans le cytoplasme en absence de stimulation extérieure est mal connu. Des partenaires protéiques de Stat comme StIP1 (Stat3-interacting protein) ont été identifiés pour réguler l activation. Lorsque ce partenaire est surexprimé, il bloque l activation de Stat3 [4]. La fixation d un ligand sur les récepteurs capables d activer Stat 3 entraîne leur dimérisation et leur autophosphorylation au niveau des tyrosines des récepteurs. Grâce à leur domaine SH2 les protéines Stats sont recrutées par les récépteurs tyrosine kinase et non tyrosine kinase. Il y alors phosphorylations des tyrosine des monomères de Stat par le récepteur induisant leur dimérisation. La forme dimérique phosphorylée de Stat est alors active et peut être transloquée dans le noyau. Un complexe protéique est nécessaire pour faciliter la translocation dans le noyau. Par exemple, la liaison de Stat 1 à l importine alpha-5 a été mise en évidence pour permettre la translocation [5]. Une fois dans le noyau le dimère Stat peut se fixer via le domaine de liaison à l ADN à la séquence appelée GAS (gamma interféron actived sequence : TTN 5-6 A) [6]. (Fig. 1). 4

5 Fig 1 Mécanisme d activation de Stat, translocation dans le noyau et fixation à l ADN. Activation de Stat par les récepteurs tyrosine kinase (après fixation de facteurs de croissance ou de cytokines) ou par les récepteurs non tyrosine kinase. Dimérisation de Stats dans le cytoplasme et translocation dans le noyau. Activation de la transcription des gènes cibles. Différents systèmes de régulation négative ont été mis en évidence. Il existe des phosphatases cytoplasmiques et nucléiques qui déphosphorylent Stat et donc l inactivent [7]. Un système de régulation négative de Stat appelé SOCS (suppressor of cytokine signalling) a aussi été mis en évidence [8]. Ce système bloque l activation de Stat en bloquant l activité tyrosine kinase des récepteurs. 5

6 3. Structure La nature des différents domaines des protéines Stats, a dans un premier temps, été déterminée par mutagenèse [9]. Ceci a permis de montrer qu il existe en C-terminal un domaine de transactivation (TAD) précédé d un domaine SH2 (Src-homology-2 domain). De plus, ceci a permis de déterminer que le domaine de liaison à l ADN se trouve au centre de la molécule. Ces données ont ensuite été confirmées par l étude cristallographique de la forme dimérique de STAT 3 fixée à l ADN [10]. La protéine présente quatre hélice alpha (coiled-coil domain) à partir du résidu 134 jusqu au résidu 317. Ensuite se trouve le domaine de liaison à l ADN (DNA binding domain) entre les résidus 317 et 488, qui comprend plusieurs feuillets β comme les domaines de liaison observés chez les facteurs de transcription Nf - κb ou P53. Le domaine de liaison (linker domain, résidus 488 à 576) est une structure hautement conservée. Une mutation qui affecte ce domaine entraîne une instabilité de la liaison à l ADN. Entre les résidus 576 et 683 se trouve le domaine SH2 suivi de la tyrosine 705 qui sera phosphorylée par les récepteurs. Enfin le domaine de transactivation, qui contient une sérine phosphorylable, est observé en C terminal à partir du résidu 683. (Fig. 2) 6

7 Fig 2 Structure tridimentionnelle de STAT 3 et site de liaison protéique. a : Structure de la forme dimérique de Stat 3 fixée à l ADN et localisation des sites de liaison protéique. IRF: interferon regulatory factor. CBP: CREB binding protein. Mcm: minichromosome maintenance. Nmi: N-Myc interactor. PIAS: protein inhibitor of activated STAT. b: Structure de STAT. STAT: Signal transducer and activator of transcription. SH2: Srchomology-2-domain. 4. Gènes régulés via Stat 3 STAT 3 régule positivement l expression des gènes Bcl-xL, Bcl-2, Mcl-1 et Survivin responsables des mécanismes anti-apoptotiques [11]. STAT 3 entraîne aussi une surexpression 7

8 des gènes codant la cycline D1, D2, D3, A, la p53 et c-myc qui sont impliqués dans la régulation du cycle cellulaire. Enfin STAT 3 contribue à la surexpression de VEGF, un facteur de croissance impliqué dans l angiogenèse. Plusieurs études ont montré que diverses cellules tumorales issues de tissus malades différents surexpriment STAT 3 [12]. STAT 3 stimule la prolifération cellulaire, les mécanismes anti-apoptotiques et l angiogenèse, par conséquent il est un facteur important dans le développement d un cancer. Ce rôle prépondérant dans le caractère tumoral des cellules suggère que Stat 3 est une cible potentielle pour de nouvelles stratégies anticancéreuses. Une des stratégies possibles est la technique de l ARNi (ARN interférence) pour éteindre l expression Stat3. 8

9 B. La technique des sirnas 1. Principe La technique de l ARNi (ARNinterférence) a été découverte pour la première fois chez le nématode C.elegans puis par la suite chez de nombreux organismes tels que la drosophile, les champignons, les plantes et les mammifères. Ce mécanisme est aujourd hui connu pour permettre la sous régulation de gènes de manière spécifique et post translationelle. Phénomène en trois étapes conservées chez la plupart des organismes étudiés [13]. -Entrée dans la cellule d ARNdb qui est reconnue par l enzyme DICER qui dégrade cet ARNdb en petits fragments d ARNdb (de pb) qui sont appelés les sirnas (Small interférence ARN). -Les sirnas sont déshybridés par une hélicase, il y a alors intégration d un des brins du sirna de manière asymétrique dans le complexe enzymatique RISC dépendant de l appariement des bases à l extrémité 5 des extrémités du sirnas (généralement c est le brin antisens). -Le complexe ribonucléique RISC-siRNA simple brin va reconnaître selon l appariement des bases le messager endogène auquel il va s hybrider de Fig.3 Représentation schématique du phénomène manière très spécifique induisant ainsi son clivage de l ARNi (image extraite de par le complexe enzymatique RISC. Le processus de l ARNi utilise les enzymes de la machinerie cellulaire de l hôte qui sont retrouvés chez tous les organismes. Ce phénomène apparaît comme un moyen de régulation de l expression des gènes par la cellule qui utilise les mirnas, de petites molécules d ARN double brin, semblables aux sirnas, mais l appariement de leurs bases est imparfait et ceci n induit pas nécessairement un clivage du gène cible mais peut aussi causer un ralentissement dans sa 9

10 traduction en se fixant sur les séquences non traduites des messagers. La technique des sirna dérive de ce processus naturel, et peut être utilisé afin de sousréguler ou d inhiber l expression d un gène cible en utilisant les sirnas qui sont séquence spécifique et donc induisent le clivage du messager de la protéine contre laquelle ils sont dirigés. 2. Les Enzymes a. DICER DICER, RNaseIII de classe III (voir Fig.4) est capable de réaliser 2 coupures endonucléique sur un ARNdb afin de générer des fragments de 21 nt d ARNdb, les sirnas [14]. Le mécanisme par lequel DICER coupe l ARNdb en sirnas fait encore l objet de recherches, mais un modèle est aujourd hui admis. Fixation de PAZ sur l extrémité 3 sortante de l ARNdb, et du domaine de liaison à l ARNdb puis pseudo Fig.5 Schéma supposé de l action catalytique de DICER. Le domaine PAZ se lie à l extrémité 3 sortante de plus faible énergie de l ARNdb. Les 2 domaines RNAsesIII forment un pseudo dimère. Chaque domaine hydrolyse un des brins du substrat. Le domaine de liaison de dsrbd n est pas défini. dimérisation des 2 domaines RNaseIII créant des sites actifs de coupure sur chaque brin d ARN. La distance entre les sites de coupure et l extrémité 3 sortante fixée par le domaine est d environ 2 nt. La coupure générant une nouvelle extrémité 3 sortante est fonction de l alignement des dimères [15]. Fig.4 Représentation schématique des genes codant pour les enzymes DICER[12] - Classe I : présente chez les bactéries et chez les levures, constitué d un domaine RNaseIII et d un domaine de liaison à l ARN db - Classe II : présente chez l eucaryote supérieur, constitué de 2 domaines RNaseIII, d un domaine de liaison à l ARNdb, d une région riche en proline et d une région riche en glycine et arginine (fonctions non connues). - Classe III : présente chez l eucaryote supérieur, constitué de 2 domaines RNaseIII, d un domaine de liaison à l ARNdb, un domaine PAZ (Piwi /Argonaute / Zwille), un domaine helicase, et un domaine de fonction non connue 10

11 b. RISC (RNA inducing silencing complex) Après la coupure enzymatique par Dicer, les sirnas ayant une longueur optimale sont déshybridés par une RNA hélicase de manière ATP-dépendante [16]. Un des deux brins sera ensuite incorporé dans le complexe RISC, l autre étant détruit par les RNAses de la cellule. Le complexe RISC sirna (simple brin) est donc capable de reconnaître le messager à cibler par appariement des bases, ceci provoque le clivage de l ARNm cible. Le RLC (RISC loading complex) est constitué de Dicer et Dadr, une protéine de liaison à l ARNdb, formant ainsi un hétéro-dimère se liant aux sirnas. Ces résultats suggèrent que le complexe DICER après avoir réalisé la coupure vient se réhybrider aux sirnas. La protéine Dadr, se fixe à l extrémité de plus faible énergie et permet ainsi la Fig.6 Les sirnas favorisés thermodynamiquement sont intégrés au complexe RISC Dadr: Dicer associated double stranded RNA binding protein. H: Hélicase. p: 5 phosphate, OH: 3 hydroxyle; ciseaux: activité catalytique de l Argonaute. Le cercle représente l extrémité de plus faible énergie liaison de l ARN hélicase sur l autre extrémité. Il y a ensuite fixation de la protéine Argonaute qui est la protéine effectrice du complexe RISC au complexe RLC ; constitué de 2 domaines conservés le domaine PAZ (domaine de liaison à l ARN simple brin) et le domaine PIWI qui semble avoir les même propriété que la RNaseH. Ce complexe est alors capable de conserver un des 2 brins et de dégrader l autre. Il y a ensuite dissociation du complexe qui libère un complexe Ago-siRNA qui sera alors capable de reconnaître le messager endogène et ainsi de le cliver pour sous réguler l expression du gène cible [17]. L étude des enzymes impliquées dans le phénomène de l ARNi, a permis d élaborer des règles pour le «design» des sirnas, leur donnant une activité optimale. 3. Le «design» des sirnas Afin d optimiser l efficacité et la spécificité des sirna, des règles pour contruire les sirna ont été déterminées à partir de diverses expériences réalisée [18,19]. Plusieurs équipes ont proposé des guides permettant un design optimal des sirna. Les premiéres caractéristiques intrinsèques des sirna ont été déterminés de manière 11

12 empirique. Ces propriétés ont été retenues lorsque les sirna se sont montrés efficace, c est à dire, lorsque une réduction de 90% de la quantité de protéine est observée. Dans un premier temps, il est important que chaque brin comporte deux nucléotides sortants : brin sens 5 - (N19)TT-3 et brin antisens 5 -(N19)TT-3. La présence de 2 -deoxythymidine pour les deux nucléotides sortants a également été suggérée. Ceci permet de préserver les sirna de la dégradation protéique [20,21]. De plus, la région ciblée de l ARNm par le sirna ne doit pas être un intron, la région doit se trouver à au moins 75 paires de bases du codon initiateur [20,21] et ne doit pas contenir plus de 50% de G+C [20,21]. Enfin pour minimiser les effets non spécifiques, une recherche sur BLAST dans la base de donnés de séquences génomiques est nécessaire. Ces règles, d une manière générale, sont valables mais un sirna peut respecter ces conditions et ne pas être efficace. Pour mieux déterminer l importance du «design» des sirna dans leur efficacité, les recherches se sont portées sur la compréhension des mécanismes biochimiques et sur l analyse de la relation structure fonction des mirnas endogènes. Le tableau ci-dessous récapitule les différents paramètres à prendre en compte pour le «design» des sirna. (Tableau 1) Critères Propriétées biophysiques, thermodynamiques et structurales Faible ou moyenne composition en G+C (30 à 50%) Faible stabilité interne en 5 du brin antisens Raisons probables Facilite l intéraction avec RISC Favorise la selection du brin antisens par RISC Bloque la sélection du brin sens par RISC Augmente la concentration des shrna fonctionnels Favorise l interaction ARN-ARN et le clivage Positions spécifique des bases dans le brin sens Présence de A en position 3 et 19 du brin sens Absence de G ou C en psition 19 du brin sens Présence de U en position 10 du brin sens Absence de G en position 13 du brin sens Favorise la selection du brin antisens par RISC Favorise la selection du brin antisens par RISC Favorise le clivage par RISC et la dissociation du complexe RISC-siRNA Favorise l efficacité de déroulement 12

13 Augmentation de la spécificité du ciblage Recherche d homologies performantes Faible interaction de stringence entre sirna et le 3 UTR Minimise les effets non spécificiques Minimise la non spécificité potentielle d extinction génique Haute stabilité en 5 du BS, bloque l incorporation du BS dans RISC faible stabilité en 5 du BA, favorise l incorporation du BA dans RISC. Faible stabilité dans cette région, favorise le clivage de l ARNm par RISC et favorise la dissociation du complexe RISC-BA. BS : Brin sens BA : Brin Antisens Supplément tableau 1 Shema d un sirna optimisé pour être efficace. Le sirna fait de 21 à 23 paire de bases dont 19 bases s apparient avec deux régions 3 sortantes de deux nucléotides. 5 phosphate et 3 hydroxyle nécessaire. 4. Les différents modes de synthèse a. Synthèse enzymatique in vitro Les sirnas peuvent être synthétisés in vitro en utilisant des séquences d ADN codant un brin des sirnas sous le contrôle du promoteur T7. Les deux brins seront ensuite hybridés in vitro pour former des T7 sirnas d une longueur de 21 ou 22 nt. Les brins d ARNs synthétisés ont une guanine en 5 dû à l utilisation du promoteur T7, la guanine étant le point +1 de transcription [22]. Les brins d ARN synthétisés ont une longueur de 21 nt avec 19 bases hybridées par 13

14 complémentarité et 2 extrémités 3 sortantes. Le brin antisens est construit pour favoriser son intégration dans le complexe enzymatique RISC ce qui induira le clivage de l ARNm du gène cible. La synthèse par cette méthode permet de produire des sirnas in vitro avec un faible coût. De plus la longueur maîtrisée de ces sirnas n induit pas de réponse immunitaire (activation de l interféron γ) observée lorsqu on utilise des longs brins d ARNdb [22]. b. Fig.7 Stratégie pour synthétiser des T7 sirnas La séquence du gène d intérêt est représentée en rouge et bleu alors que les séquences nécessaires à la synthèse sont en noir. Synthèse de poosl de sirnas par DICER recombinante Un autre type de synthèse enzymatique est l utilisation de DICER recombinante pour produire des fragments de sirnas à partir de longs fragments d ARNdb qui sont complémentaires du gène que l on veut inactiver. Cette méthode permet d obtenir un pool de sirnas qui sont semblables à ceux obtenus in vivo. Ces sirnas seront donc aptes à cliver le messager endogène, mais l utilisation de ces pools peut induire des réponses immunitaires si il n y a eu qu une digestion partielle de l ARNdb de départ. C est pourquoi une étape de purification sur gel est nécessaire pour récupérer les fragments de 21 à 23 pb afin d éviter les réactions immunitaires dû aux longs brins d ARNdb non digérés. Par ailleurs la digestion produit divers sirnas ayant des séquences diverses qui pourront avoir des effets sur des gènes autres que celui d intérêt [23]. 14

15 c. Synthèse chimique Des oligonucléotides synthétisés de manière chimique et indépendante sont hybridés pour former des sirnas. Cette méthode est devenue un standard pour sous réguler l expression de gènes car elle a de nombreux avantages comparés aux autres techniques (synthèse plus rapide et avec un grand nombre de modifications chimiques possible). La synthèse des oligonucléotides peut être commandée auprès de diverses entreprises et il est nécessaire de faire une étape d hybridation avant la transfection dans la cellule. Malgrés de nombreux avantages ce mode de synthése reste couteux. Cette méthode de synthèse chimique permet de construire des sirnas d une longueur de 21 à 27 pb avec une efficacité croissante qui est fonction de la longueur et optimale pour un sirna s hybridant sur 27pb avec des extrémités 3 sortantes [23], au dessus de 27 pb il y a des réactions immunitaires. La durée d inactivation et l efficacité sont d autant meilleures que la concentration en sirnas transfectée dans la cellule est faible. Entreprises auprès desquelles on peut commander des sirnas chimiques: - Ambion - Promega - Euromedex - sirna therapeutics Après la transfection dans la cellule le sirna est séparé en deux brins distincts via une hélicase, un des brins est alors intégré dans le complexe RISC, l autre est reconnu par les RNAses de l hôte et sera rapidement dégradé. La durée d inactivation de gènes via des sirnas synthétisés vu précedemment est donc faible, car ils sont rapidement dégradés par la machinerie cellulaire de l hôte. Cette durée relativement courte d inhibition du gène cible (2-3 jours) pose des problèmes si l on envisageait les sirnas comme thérapie [23]. Les chercheurs ont donc mis au point des techniques de sirna permettant une expression durable au sein de la cellule via des vecteurs, plasmides, rétrovirus, adénovirus ou lentivirus. 15

16 d. Synthése de shrna (small hairpin RNA) par le biais de plasmides Les sirnas peuvent être exprimés dans les cellules via des plasmides exprimant des fragments d ARN d une longueur d environ 40-50pb s hybridant de manière intramoléculaire par appariement des bases et donnant ainsi des shrnas (small hairpin RNA). Les shrna sont reconnus puis clivés par l enzyme DICER, produisant ainsi à l intérieur de la cellule des sirnas. L utilisation de plasmides permet une meilleure durée d inactivation du gène à l intérieur de la cellule car il y a une expression continue de shrnas dans la cellule [23]. Le plasmide commercial psilencer1.0 U6 (Ambion, Austin, Texas) est un vecteur permettant de sous réguler l expression d un gène d intérêt via les shrna. Le design de l insert le plus courant a 2 séquences complémentaires inversées séparées par un linker et suivi d un site de terminaison de la ARN polymérase III (5 T). La longueur des séquences répétées peut être Fig.8 Carte du plasmide psilencer 1.0-U6 ColE1 : origine de réplication d E.coli.F1 origin : Origine de réplication comprise entre 25 et 29 nt avec un linker de 4 à phagique.mouse U6 : promoteur Pol III. Ampicilline : résistance à l ampicilline 23 nt sans affecter l efficacité du sirnas. Pour choisir la séquence, on scanne la séquence de l ARNm à cliver ; on recherche et sélectionne 2 adénosines successives et les 19 nt suivants [24]. Cette démarche nécessite de vérifier que la séquence choisie n a pas d autres lieux d hybridation sur les messagers de l organisme étudié afin d éviter des réactions non spécifiques. Ceci peut être fait par comparaison avec une base de données représentant les messagers de la cellule. L expression de shrnas à l intérieur de la cellule par le biais de plasmides permet une meilleure durée d inactivation du gène comparée à la méthode via les T7 sirna grâce à une expression continue due au plasmide en cas d intégration. Par ailleurs cette méthode a une limitation venant de l efficacité relative de transfection des plasmides dans certains types cellulaires, surtout pour les cellules difficilement transfectables [23]. C est pourquoi une autre méthode de synthèse et de transfection des sirnas a été trouvée, l infection des cellules par le biais de vecteurs viraux. 16

17 e. Synthèse de shrnas par le biais de vecteurs viraux (lentivirus, adénovirus ou rétrovirus) Les sirnas peuvent être exprimé à l intérieur de la cellule de manière continue à l aide de vecteurs viraux permettant ainsi une expression de shrnas durable. L expression de shrnas par le biais de rétrovirus [25], permet une expression durable et stable en évitant les problèmes due à la transformation de plasmide (faible efficacité, grande variabilité entre les cellules ) et ceci même pour les cellules qui sont difficilement transformables. La construction des rétrovirus permettant l expression de shrnas à l intérieur de la cellule nécessite une construction préalable de l insert dans un vecteur plasmique comme le psilencer1.0 U6 et intégration dans le rétrovirus. Fig..9 Construction de rétrovirus capables d exprimer des shrnas Construction du rétrovirus exprimant des sirnas : tous les plasmides dérivent de pmscvpuro (clontech). Insertion du promoteur U6 en bleu, le contrôle (rouge) et le sirna dirigé contre Nuclear Dbf-2 Related (vert) sont insérés dans les sites de restriction BamHI et NsiI. Ψ+: packaging signal, PGK: promoteur de la phosphoglycérique kinase murin pour l expression de l antibiotique (Puromycine) permettant la sélection. Les cellules sont infectées par le biais de ce rétrovirus, il y a alors intégration dans le génome de l hôte grâce aux séquences 3 et 5 LTR induisant une expression des shrnas de manière stable, durable et transmissible. Il existe donc différents modes de synthèse et de transfert des sirnas à l intérieur de la cellule, chacun ayant ces avantages et inconvénients, on utilisera plutôt des sirnas synthétisés de manière chimique dans un premier temps pour trouver la séquence du sirna ayant la meilleure efficacité et on confirme ces résultats in vivo en utilisant des plasmides ou vecteurs viraux. Après avoir trouvé la séquence et le mode de synthèse approprié des sirnas en fonction du gène que l on veut inactiver, il est nécessaire de réaliser des contrôles pour s assurer de la spécificité de ce sirna dans la cellule. 17

18 5. Les contrôles nécessaires a. Contrôle via des sirnas portant une mutation Le deuxième type de contrôle que l on peut utiliser dans le cadre d une expérience d ARNi, est l utilisation de sirna ayant des mutations dans leur séquence, induisant la perte de complémentarité totale nécessaire au clivage du messager endogène. Cet sirna ne doit pas induire la sous régulation du gène d intérêt. Ce contrôle facile à mettre en place permet de vérifier la spécificité de séquence du sirna que l on teste vis-à-vis du gène cible. b. Le «rescue» contrôle Le contrôle le plus reconnu dans le cadre d une expérience d ARNi, consiste à reverser l effet des sirnas en surexprimant par le biais de plasmide l ADNc de la protéine d intérêt portant des mutations silencieuses à l intérieur de sa séquence. Ce gène produira ainsi la protéine sous sa forme native mais le messager correspondant ne sera pas reconnu par les sirnas grâce a sa séquence différente. Les fonctions perduent en préscence des sirnas doivent alors être retrouvées. Ce contrôle permet de s assurer que l effet, du sirna est bien spécifique de la perte de notre protéine. c.contrôle via des puces à ADN Après avoir transformé ou transfecté les cellules par des sirnas, il est nécessaire de contrôler que notre sirnas n a pas d effet sur l expression des autres gènes de la cellule. Pour ce faire, les puces à ADN permettant de détecter l expression de gènes via leurs quantité de messager à l intérieur de la cellule sont un bon moyen de vérifier que notre sirna a bien une activité spécifique. Il existe des puces permettant de regarder l expression de l ensemble des gènes d une cellule. Le temps après lequel on teste l expression des gènes est très important. En effet si l on regarde l expression des gènes trop tôt alors on ne verra pas l effet de notre sirna, par ailleurs si l on teste trop longtemps après, alors, la sous régulation du gène et donc la sous expression de la protéine peut induire des régulations négatives dont l expression est sou la dépendance du premier. Ce contrôle permet de vérifier que le sirna que l on teste n a pas d effets directs sur 18

19 l expression de l ensemble des gènes de la cellule mais il est coûteux et difficile à mettre en place, ce qui en limite son utilisation. 19

20 II. ANALYSE DE LA PUBLICATION [34] L équipe de Gao a mis en place une stratégie de «small interference RNA» afin d inhiber cette surexpression. L efficacité de trois sirna différents a été testée (Stat 3-1, Stat 3-2, Stat 3-3) ex vivo sur les cellules PC3 et LnCAP issue d une collection américaine de cellules en culture (Manassas). 1. Expression de STAT 3 par les cellules PC3, LNCaP et par des tissus cancéreux. L analyse par western blot et immunohistochimie (non montré) montre une surexpression de STAT 3 par les 3 types de cellules tumorales (Fig. 10.A). Une surexpression d environ 2 fois est observé dans ces cellules par rapport aux cellules issues d une prostate saine. (Fig. 10.B). De plus, le Tableau 2 : Analyse immunohistochimique de niveau d expression de STAT 3 l expression de Stat 3 dans des tissues de prostate saine ou malade. N : nombre de tissus testés, +++ : dans 23 tissus prostatiques sains et 23 tissus forte expression, ++ : moyenne expression, + : cancéreux est significativement différent. faible expression, - très faible expression. (Tableau 2) Fig.10 Expression de Stat 3 par des cellules cancereuses de prostate humaine A : Analyse par western Blot de l expression de Stat 3 par les cellules PC3, LnCap, dans un tissu malade et sain. B : Quantification des résultats obtenus par western Blot et normalisés par rapport à l expression de la Β-actin. Ces résultats montrent bien que Stat 3 est surexprimé dans le cas de cancer de la prostate. 20

21 2. Extinction de l expression de STAT 3 par la technique des sirna. Une réduction spécifique du niveau d ARNm de STAT 3 a été mise en évidence par Northern Blot, 72 heures après transfection. Les sirna Stat 3-2 et Stat 3-3 réduisent le niveau d ARNm de Stat 3 d environ 3 fois par rapport au contrôle. En revanche Stat 3-1 n a pas d effet significatif sur le niveau d expression de l ARNm de STAT 3. La réduction de l ARNm de STAT 3 a aussi été mesurée par RT-PCR semiquantitative (Fig.11) ; les résultats concordent avec ceux observés en Northern Blot. Fig.11 Analyse par Northern Blot et par RT-PCR de l expression des ARNm de Stat 3. A : Analyse par Northern Blot de l expression des ARNm de Stat 3 chez les cellules PC3. B : Quantification des résultats obtenus par Northern Blot. C : Quantification par RT-PCR de l ARNm de Stat 3 exprimé par les cellules PC3. Ensuite, l effet des sirna sur l expression de la protéine Stat 3 et p-stat 3 (forme active) a été évalué par Western blot. Les résultats du sirna Stat3-1 montrent un niveau similaire d expression de STAT 3 et p-stat 3 par rapport au contrôle. Cependant, Stat 3-2 et Stat 3-3 entraînent bien une diminution de l expression des deux formes de STAT 3 (Fig.12 A-D). De plus nous pouvons observé que l efficacité d extinction est dépendante du temps avec un maximum d inhibition 72 après transfection. (Fig.12 E) Fig.12 Analyse par Western Blot de l expression de Stat 3 et p-stat 3. A : Quantité de protéine Stat 3 dans les cellules PC3 transféctées avec les 3 sirna et le vecteur seul. B : Quantification de l exoression de Stat 3 SE (P< 0,05. C : Quantité de protéine p-stat 3. D : Quantification de l expression de la quantité de protéine p-stat 3. SE (P< 0,05). E : Analyse au cours du temps de l expression de la protéine Stat-3 après transfection par le sirna Stat

22 3. Expression des «short hairpin RNA» (shrna) par les cellules PC3 Afin de déterminer si la différence d efficacité d extinction de Stat 3-1 par rapport à Stat 3-2 et Stat 3-3 est due à une mauvaise expression ou à une mauvaise stabilité des shrna, un Northern Blot est réalisé. Les résultats montrent que le niveau d expression des trois sirna est similaire après 48 et 72 heures de transfection (Fig.13). Par conséquent, l absence d efficacité d extinction de Stat 3-1 ne semble pas être due à une mauvaise expression ou stabilité de ce dernier. Fig 13 Analyse par Northern blot de l expression des transcrit shrna par les cellules PC3 transfecté par le vecteur exprimant le sirna Stat 3-1. L analyse par Northern Blot est réalisé après 48 et 72h. 4. Calcul de l énergie libre et prédiction de la structure secondaire de la région de l ARNm ciblée par chaque sirna. Pour connaître l origine de l absence d effet de Stat 3-1 sur l extinction de Stat 3, les auteurs ont prédit la structure secondaire de la région de l ARN ciblée par les différents sirna à l aide du logiciel Mfold. Une boucle est observée au niveau de la structure secondaire de la région de l ARNm ciblée par Stat 3-2 et Stat 3-3. En revanche, la région de l ARNm de STAT 3 ciblée par Stat 3-1 présente une épingle à cheveux. Donc la différence d efficacité d extinction des sirna pourrait être due à la structure secondaire qu adopte la région cible de l ARNm. Fig 14 Structure secondaire locale de la région de l ARNm ciblée par les différents sirna. Les nucléotides cibles sont représentés en gris. La structure des ARN est prédit par le logiciel Mfold. DBD, CCD, SH2 : région de l ARNm de Stat 3 qui code pour les domaines : DBD : Domaine de liaison à l ADN, CCD : Domaine super enroulé, SH2 : domaine SH 22

23 Les auteurs ont également déterminé l énergie libre associée aux différents sirna. Stat 3-1 montre un ΔG élevé, alors que Stat 3-2 et Stat 3-3 ont une énergie libre plus faible. (Tableau 3) Tableau 3 :Propriétés des sirna ciblant l ARNm de Stat 3. Calcul du ΔG à l aide du logiciel Mfold. L importance de ces résultats sera discutée plus loin. 5. L inhibition de l expression de Stat 3 supprime l expression des gènes cibles Bcl-2, cyclind1 et c-myc dans les cellules PC3. Après avoir démontrer que la sous régulation de Stat 3 est possible dans les cellules PC3 via la technique des sirnas, les auteurs montrent que cette sous régulation a bien des effets sur les gènes cibles de Stat 3 qui sont impliqués dans la dérégulation du cycle cellulaire et l inhibition du phénomène d apoptose. Pour se faire les auteurs réalisent un western blot en gel SDS-Page sur le protéome total des cellules PC3 en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines Bcl-2 et cyclind1. Fig.15 analyse par Western Blot de l expression des gènes Bcl2, cyclind1 et analyse par RT-PCR de l expression du gène c-myc dans des cellules PC3. A :Western blot de Bcl-2 dans les cellules PC3 transféctées par le sirna Stat 3-3, avec anticorps anti- Bcl-2 ou anti-β-actin. C : Western blot de cyclin D1 dans les cellules PC3, avec anticorps anti-cyclind1 ou β- actin. E : RT-PCR sur le messager de c-myc ou β-actin. B et D : Quantification de l expression des protéines observé sur le gel par analyse par densité optique. La quantification est normalisé par rapport à l expression de la Β-actine Ce western blot montre bien que le niveau d expression de Bcl2 et de la CyclinD1 dans les cellules tumorales PC3 est 4 fois supérieur à l expression dans les cellules traitées par le sirna Stat 3-3. La réaction de RT-PCR sur le messager de 23

24 c-myc démontre aussi que l inhibition de Stat 3 induit une diminution de la transcription du gène. Ces résultats montrent que l extinction de Stat 3 par les sirna suffit à éteindre l expression des gènes cibles impliquées dans la prolifération tumorale. 6. Le sirna Stat 3-3 inhibe la croissance et la survie des cellules PC3 et LNCaP et induit l apoptose et l arrêt en G1 des cellules PC3 ex vivo. Après la transfection des cellules par le sirna Stat 3 les auteurs ont observé quantité de cellules sur les boites de culture et, d autre part, ils colorent les cellules avec de l acridine orange, un colorant qui permet de repérer les cellules en apoptose. Les cellules transfectées par le sirna Stat 3-3 sont moins nombreuses sont en suspension ce qui témoigne d une mort cellulaire. De plus la coloration à l acridine orange montre que les cellules traitées entrent en apoptose, les cellules sont ensuite comptées et classées selon leur stade dans le cycle cellulaire par cytométrie en flux. Fig. 16 inhibition de la croissance cellulaire et indction de l apoptose après transfection par Stat 3. A : 72 h après la transfection par le sirna Stat 3-3, observation des cellules (grossissement : x1000) B : 72 h après la transfection par le sirna Stat 3-3, les cellules sont fixées avec 4% de paraformaldéhyde, puis coloration à l acridine orange pour observer les cellules en apoptose. (grossissement : x1000) Tableau 4 Induction de l apoptose par le sirna Stat 3-3 et analyse du cycle cellulaire chez les cellules PC3 24

25 Ces résultats démontrent bien que les cellules cancéreuses PC3 traitées par le sirna entre en apoptose ou bien sont bloquées en phase G1 du cycle cellulaire. Dans les deux cas on observe une très bonne efficacité sirnas. (Tableau 4) 7. L activité anti-tumorale de Stat 3-3 in vivo Les auteurs montrent ensuite qu il est possible d inhiber la croissance des cellules tumorales qui se sont développées dans un contexte in vivo. Ils ont injectés des cellules tumorales PC 3 dans le flan de souris type «xenogreffe» (souris modifiées pour développer un cancer provenant de tumeurs cancéreuses humaines ) et ils observent la taille des tumeurs après 17 jours (157,56 ± 28,54 mm 3 ). Ils injectent alors les sirnas dans la tumeur puis font une électroporation des cellules in vivo. Cette opération est répétée au jour 24. Après 34 jours, ils recalculent la taille des tumeurs. Fig.17 Electroporation intratumorale des sirna Stat 3-3 montrant une diminution du volume tumorale. B : Souris traitées avec 20 ug de tampon seul, observation de la tumeur. C : Souris traitées avec le psilencer1.0u6, contenant le sirna Stat 3-3, observation de la réduction de la taille de la tumeur. D : Souris traitée avec un sirna «scramble», contrôle, observation d une taille de la tumeur similaire au souris traitées au tampon seul. La taille des tumeurs au jour 34 pour les tumeurs traitées par le sirna Stat 3-3 a fortement diminuée (354,25 ± 56,89 mm 3 ) alors que celles traitées par le contrôle «scramble» se sont développées fortement (1092,09± 189,23 mm 3 ) et de même pour le tampon seul (1185,50± 147,42 mm 3 ). Ces résultats montrent que les sirnas peuvent aussi inhiber l expression de Stat 3 in vivo et induire l apoptose des cellules tumorales. 25

26 III. DISCUSSION La protéine Stat 3 est un transducteur de signal entraînant l expression de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire (Cyclin D1, c-myc ou encore p53), l inhibition de l apoptose (Bcl-2, Mcl-1) et l angiogénèse. Par conséquent, la surexpression de Stat 3 peut être responsable d une prolifération anarchique des cellules, et donc entraîner l apparition de tumeurs. Les résultats des auteurs montrent que les lignées cellulaires cancéreuses PC3, LNCaP ou bien des cellules extraites de tumeurs de la prostate surexpriment Stat 3. Diverses stratégies ont été testées pour diminuer l expression de Stat 3 vu son rôle prépondérant dans le caractère tumoral de ces cellules tumorales. Ces différentes stratégies consistent entre autre à inhiber l activité tyrosine kinase (recepteurs JAKs) [26,27], utiliser des oligonucléotides antisens ou dans notre cas l ARN interférence [28,29]. L expérience réalisée par Gao et son équipe en 2005 [34], met en évidence l utilisation de sirna pour éteindre l expression de STAT 3. Ces résultats montrent bien que les sirna sont capables d éteindre l expression des ARNm et de la protéine Stat 3 de manière efficace. De plus les auteurs ont mis en évidence que l extinction de Stat 3 entraîne bien la diminution de l expression des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, l apoptose et donc entraîne l arrêt en phase G1 des cellules tumorales ou leur mort. La méthode avançée par les auteurs apporte des bases solides pour envisager l inhibition de Stat 3 dans le cadre de cancers de la prostate. Bien que les résultats soient cohérents, leur fiabilité reste à discuter. En effet les contrôles utilisés pour confirmer la spécificité d action sont limités pour envisager cette méthode directement en thérapie. Dans le cas de l expression des sirna Stat 3-3 au sein de la cellule, les contrôles que les auteurs utilisent sont soit le «scramble vector» ou bien le vecteur seul. Ces types de contrôles sont des bonnes preuves de la spécificité de séquence du sirna testé et que le phénotype résultant n est pas dû à l entrée du vecteur plasmidique. L ultime contrôle que les auteurs auraient dû mettre en place est le contrôle «rescue», ce contrôle aurait permis de vérifier que l extinction de Stat 3 est bien une résultante du sirna et non d un phénomène incontrôlé qui aurait induit cette diminution d expression. De plus les auteurs ne donnent aucune information sur le niveau basal de Stat 3 exprimé dans des cellules saines, ceci aurait permis de vérifier que les cellules tumorales traitées 26

27 retrouvaient un niveau d expression du transducteur de signal proche de celui observés dans les tissus sains. Lors de cette étude les auteurs ont aussi montré que l un des trois sirnas testés n avait pas d effet sur l expression de Stat 3. L analyse par Northern Blot de l expression des shrna montre qu il n y a pas de différence au niveau de l expression ou de la stabilité des trois sirna testés. Les auteurs ont alors supposé que la structure secondaire adoptée au niveau de la région de l ARNm ciblée par le sirna pouvait être responsable de cette absence d extinction. La structure secondaire des ARNm cible a été prédite à l aide d un logiciel (Mfold). Une différence dans la structure secondaire est observée pour l ARNm cible du sirna inefficace. En effet, une épingle à cheveux est présente au niveau de cette structure et pourrait être à l origine de cette inefficacité Une étude récente a mis en évidence que l efficacité d extinction des sirnas dépend non seulement de la structure secondaire de la région ciblée de l ARNm mais aussi des propriétés intrinsèques des sirnas [30]. Les auteurs ont prédit plusieurs structure secondaire en épingle à cheveux avec un nombre de bases de la région cible de l ARNm impliqué dasn la structure allant de 5 à 20. La quantification de l expression du gène cible à été réalisé à l aide d un gène rapporteur (GFP). Cette étude montre également que lorsque que la région cible de l ARNm est engagé dans une structure telle qu une épingle à cheveux, l efficacité d extinction est diminué. Et plus le nombre de base impliqué dans la structure secondaire est important, plus l efficacité d extinction du sirna est faible. (fig 15) Fig 18 : Analyse de l expression du gène ciblé par le sirna, en fonction du nombre de bases impliquées (VsiRNA1) dans la structure secondaire. Target : séquence cible ; GFP : gène rapporteur. (a) Extrémité 5 exposé (b) Extrémité 3 exposé Toutes les bases impliquées. 16 bases 10 bases 5bases 27

28 D autre part, les auteurs ont calculé l énergie libre associée à différentes structures secondaires. L énergie libre témoigne de la stabilité de la structure, plus elle est faible, plus la structure est stable, ceci découle du nombre de bases appariées et la structure secondaire associée. Les résultats montrent une corrélation négative entre l énergie libre et l efficacité d extinction. Plus la structure ciblée du messager est stable, plus l efficacité d extinction est faible. (Fig. 19) Ceci n est pas cohérent avec les résultats obtenus par l étude de Gao, car la structure secondaire de la région de l ARNm ciblée par le sirna Stat 3-1 semble la moins stable Fig 19 : Variation de l expression du gène cibler par les sirna en fonction de car peu de bases sont appariées. De toute évidence, ces l energie libre associé à la structure secondaire locale de l ARNm. données restent incertaines, car ces structures sont prédites par un logiciel qui peut faire des erreurs.. Gao et son équipe ont aussi montré que l énergie libre associé aux différents sirnas (voir tableau 3) pourrait aussi expliquer cette différence d efficacité, l énergie libre (ΔG) du sirna n ayant peu ou pas d activité est plus élevée (3,2 KCal.mol -1 ) que les deux autres (-0,8 et 0,2 KCal.mol -1 ). Les valeurs d énergie libre dans un cas général doivent être comprises entre -0,5 et 0,5 KCal.mol -1. La structure secondaire des ARNm et les propriétés intrinsèques des sirna semblent être primordiale pour l efficacité d extinction de gène via les sirnas. Il est indispensable de mieux appréhender ces paramètres pour augmenter l efficacité d extinction. Ceci permettra également de pouvoir prédire le sirna qui sera le plus efficace pour éteindre l expression d un gène. 28

29 IV. PERSPECTVES : Les sirnas, une thérapie à l horizon? La technique des sirnas comme démontré dans la publication peut être envisagée pour sous réguler des gènes qui sont surexprimés et qui induisent un caractère tumoral à la cellule. Stat 3 est une bonne cible thérapeutique dans le cas de cancers du fait de son rôle prépondérant dans ce type de pathologie. Le problème auquel est confronté cette technique est celui du ciblage des cellules malades. En effet la méthode d électroporation envisagée dans la publication pour faire pénétrer les sirnas à l intérieur de la cellule est un bon moyen de réaliser des essais in vivo sur souris mais semble peu envisageable chez les patients. Le problème du ciblage fait aujourd hui l objet de recherches intensives afin que l action des sirna soit tissu spécifique et gène spécifique ce qui deviendrait un moyen de thérapie à fort potentiel. L équipe de Raymond M. Schifflers [31] s est penchée sur le problème du ciblage et ont développés un système de nanoparticules spécifiques des cellules malades. Pour se faire ils mélangent des polymères cationiques avec des sirnas, ces interactions forment des polyplexes qui ont été appelés les nanoplexes due à leur taille de 100nm. De plus ils font exprimer à la surface de ces nanoplexes des motifs capables de cibler les intégrines à la surface des cellules endothéliales qui sont souvent en cause dans des processus d angiogenèse. Cette méthode a permis de cibler les cellules endothéliales de manière spécifique et également de cibler le gène VEGF R2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette technique de ciblage pourrait donc s imposer dans la mise en œuvre d une thérapie à base de sirna. L utilisation de ces nanoplexes semble encourageante pour développer des thérapies, mais le problème de la stabilité des sirnas une fois à l intérieur de la cellule est un deuxième point qui fait, lui aussi, l objet de recherche importantes. L équipe de Jürgen Soutschek [32] a, dans un premier temps, a démontré qu il était possible d augmenter la durée de vie des sirnas à l intérieur de la cellule en couplant du cholestérol en 3 du brin sens des sirnas via un linker pyrrolidine. Les auteurs ciblent le gène de l apob avec des sirnas normaux ou bien avec des sirnas couplés au cholestérol, les CholsiRNAs. Ces Chol-siRNAs injectés ont une ½ vie d élimination multipliée par 15 et une clairance diminué de 34 fois. Cette méthode apporte une meilleure stabilité aux Chol-siRNAs dans la cellule puisqu ils ne sont pas éliminés de la cellule après 24h contrairement aux sirnas synthétisés de manière chimique classique. Cette méthode est une bonne approche permettant une 29

30 meilleure efficacité d inhibition ce qui permet d envisager cette méthode en thérapie, mais le problème du ciblage n est pas résolu et donc les risques d effets secondaires sont grands. Par ailleurs pour illustrer l idée que les sirnas feront partie des thérapies du 21 siècle, des essais cliniques sont actuellement en cours [33]. Ces essais de phase 1 sont réalisés sur des patients Américains atteints de dégénérescence maculaire. La technique utilisée pour les essais est l injection directe au niveau de la rétine de sirna pour inhiber l expression du gène responsable de la maladie. Ces essais sont un premier pas vers le développement des sirnas en tant que thérapie. 30

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