Olivia Mercier Touzet UMR2724 IRD/CNRS/UM1 Laboratoire de Parasitologie-Mycologie MONTPELLIER

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1 Olivia Mercier Touzet UMR2724 IRD/CNRS/UM1 Laboratoire de Parasitologie-Mycologie MONTPELLIER UE méthodologique : «Outils de manipulations des génomes et d expression des gènes

2 I. Historique II. Mécanismes de l ARNi III. L ARNi in vivo VI. L ARNi in vitro : outil de génétique inverse

3 I. Historique I.1 Découverte fortuite du phénomène d ARNi I.2 Découverte du phénomène chez les mammifères I.3 DéfiniAon(s)

4 Napoli, C., Lemieux, C. and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. The Plant Cell 2: Chez le pétunia : Introduction le gène codant la chalcone synthase (CHS) Diminution du niveau d expression de l ARNm correspondant dans les fleurs blanches ou très pâles. => transgène ET gène endogène ne s expriment pas Ce phénomène est appelé co-suppression = Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) 1. Historique

5 Fire, A., et al. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: Chez le nématode C. elegans : Introduction d un ARNdb : inactivation de la synthèse de la protéine codée par l ARN homologue. Introduction brin ARNsens ou antisens : peu/pas d effet Introduction fragments d ARNdb correspondant à des introns ou à des séquences promotrices => Pas d effet détectable Introduction de seulement quelques molécules d ARNdb sont suffisantes => Phénomène d amplification Ce mécanisme est nommé ARN interférence / Gene silencing 1. Historique

6 Zamore, P. D., et al. (2000) RNAi : double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mrna at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101: Chez la drosophile : Introduction de grands ARNdb : ils retrouvent ces ARN db fragmentés en ARN de 21 à 23 nts, dans des lysats embryonnaires de Drosophile : Ces fragments guident le clivage de l ARNm Ce mécanisme d exancaon génique est donc conservé chez les plantes, les nématodes C. elegans et la drosophile. Et chez le mammifère??? 1. Historique

7 Dans les cellules de mammifères, introduc3on d ARNdb de grand taille déclenche une forte réac3on an3virale non spécifique: réponse interféron Une dégrada0on non spécifique des ARN messagers But : Bloquer la réplica3on de par3cules virales et de protéger les cellules voisines. M. Elbashir, S. et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411: Dans différentes lignées cellulaires de mammifères: Introduction de petits ARNdb de 21 nts (=sirna) de séquence homologue à celle d un ARNm endogène dégradation spécifique de cet ARNm, dans différentes lignées cellulaires de Mammifères. 1. Historique

8 Depuis 2001 : augmentation exponentielle du nombre de publications sur l ARNi 1 ère définition : ARN interférence = Inhibition séquence-spécifique de l expression d un gène par dégradation de l ARNm correspondant, par appariement entre des petits ARN double-brins dits sirna et cet ARNm. puis élargissement de la notion d ARNi suite à la découverte d autres familles de molécules d ARNdb inhibition/blocage de la traduction (mirna) modification des histones et induction de l hétérochromatine (inhibition de la transcription) 1. Historique

9 II. Mécanisme de l ARNi (sirna)

10 Mécanisme de l ARNi Le processus de l ARNi se déroule en deux étapes dis3nctes : - La phase d initiation : Production des petits ARNi à partir du brin d ARN exogène - La phase effectrice : Destruction de l ARNm cible par découpage à l aide d une activité nucléasique

11 1 ère étape : synthe0c Clivage des RNAdb de longue taille en sirna (21-23 nt) par l endonucléase Dicer qui contient : - Hélicase - Domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) - Deux domaines ARNase III II. Mécanisme de l ARNi

12 synthe0c 2 ème étape : Assemblage du brin guide (brin antisens) avec le complexe RISC RNA-induced silencing complex qui contient: - une protéine de reconnaissance à activité RNase = Argonaute (Ago) - une hélicase complexe sirisc II. Mécanisme de l ARNi

13 synthe0c 3 ème étape : Le brin guide est utilisé comme matrice pour cibler ARNm complémentaires + clivage des ARNm cibles par Ago II. Mécanisme de l ARNi

14 Pour certains organismes: «gene silencing» stable et durable par amplifica3on (C. elegans) Recyclage des complexes sirisc II. Mécanisme de l ARNi

15 III. L ARNi in vivo III.1 Organismes réalisant l ARNi III.2 Rôle physiologique de l ARNi

16 Comment identifier les organismes réalisant l ARNi? 1. Analyse bio-informatique Étude génomique, BLAST 2. Approche fonctionnelle inhibition de transcrits endogènes avec grands ARNdb ou siarns? recherche de siarns III.1. Organismes réalisant l ARNi

17 PROTOZOAIRES : Amibe : Entamoeba histolytica (Amibiase) E. histolytica Flagellés Trypanosomatidés : Trypanosma brucei (maladie du sommeil) T. brucei Ne fonctionne pas chez : T. cruzi (Flagellé ; Trypanosomatidé) : Dicer, Argonaute (maladie de Chagas) Leishmania (Flagellé ; Trypanosomatidé) : Dicer, Argonaute (Leishmaniose) Toxoplasma (Apicomplexe) (Toxoplasmose) Plasmodium (Apicomplexe) (paludisme) Giardia lamblia (Giardiose) X X X X III.1. Organismes réalisant l ARNi

18 METAZOAIRES : Parasites : Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum Schistosoma spp. Non parasites : Végétaux : A. thaliana, Petunia, Chlamydomonas, Cosuppression = PTGS Champignons : Schizosaccharomyces. pombe, S. cerevisiae, Sac. castellii, Neurospora crassa, C. albicans, Quelling Invertébrés : Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Gene Silencing Vertébrés : Poissons, Mammifères, X III.1. Organismes réalisant l ARNi

19 2. Rôles physiologiques de l ARN interférence : Protection contre les virus à ARNdb Prévention de la propagation des éléments transposables Régulation de l expression des gènes III.2. Rôles physiologiques

20 IV. L ARNi in vitro : outil de génétique inverse IV.1 Introduction des ARNdb IV.2 Exemple pratique de protocole IV.3 Exemple de l étude des MCAKs chez les Trypanosomatidés

21 Les éléments introduis diffèrent selon le type cellulaire : Dans les cellules non mannifères (C.elegans ou la drosophile, plante ) : Introduc3on un grand ARN bd (200pb) complémentaire de l ARNm cible car une fois dans la cellule, Dicer va générer les ARNi. Dans les cellule de la mammifère : Introduc3on directement des siarn minent le produit générer par Dicer, sous peine de générer une réponse interfèron IV. Outil de génétique inverse

22 Nourrir les nématodes avec des bactéries produisant l ARN double-brin C. elegans Injecter l ARN double-brin dans une cellule Tremper le nématode dans une solution contenant l ARN double-brin IV. Outil de génétique inverse

23 Injecter l ARN double-brin dans un embryon/adulte D. melanogaster Transfecter avec un vecteur exprimant l ARN double-brin (lignées cellulaires) Souches transgéniques exprimant un gène en orientation sens et anti-sens IV. Outil de génétique inverse

24 Plantes Transfecter avec un vecteur exprimant l ARN double-brin : sur une feuille ou sur des cellules germinales Mammifères Transfecter avec des sirna (lignées cellulaires) Transfecter avec un vecteur d expression possédant un promoteur ARNpolIII (shrna) IV. Outil de génétique inverse

25 VI.2 Exemple pratique: Protocole d ARNi chez un protozoaire parasite : T. brucei

26 Trypanosoma brucei Agent de la maladie de sommeil ou Trypanosomiase humaine africaine Mode de transmission : mouche Tsé Tsé ou glossine cas rapportés et morts/ an en Afrique Mouche Tsé-Tsé (glossine) Trypanosoma brucei Répartition de la maladie du sommeil

27 Trypanosoma brucei Forme procyclique (insecte) Forme sanguine (mammifère)

28 Extrémité postérieure Membrane ondulante Flagelle Extrémité antérieure

29 Types de vecteurs utilisables sens Vecteur d expression Vecteur d expression antisens transfection transfection ARN sens antisens ARN sens antisens ARNdb ARNdb IV. 2. RNAi chez T.brucei

30 MAIS Problème pour les gènes essentiels. Système INDUCTIBLE : Vecteur d expression + souche exprimant TetR IV. 2. RNAi chez T.brucei

31 Système inductible Répresseur = TetR ADN ADN Opérateur Tet Séquence d intérêt Tet ADN ADN Opérateur Tet Séquence d intérêt ARN double brin IV. 2. RNAi chez T.brucei

32 Vecteur utilisé IV. 2. RNAi chez T.brucei

33 Souche utilisée : Tb plew13 T7RNAP NEO + plew29 TETR HYG T7 exprime : le répresseur Tet sous contrôle du promoteur T7 la T7 RNA polymérase les gènes de résistance à l hygromycine et à la néomycine IV. 2. RNAi chez T.brucei

34 Etapes du protocole Transfection de T. brucei (électroporation) Sélection des trypanosomes recombinants (Neo/Hyg/Phéo) Ajout de tétracycline INDUCTION de l ARNi Observation du phénotype induit (courbe de croissance, observation microscopique, ) Vérification de l inhibition de l expression du gène (Western blot, Northern blot, RT-PCR, ) IV. 2. RNAi chez T.brucei

35 Comparaison entre le système knock-out (remplacement d un gène) et knock-down (inactivation par RNAi) + Gène X remplacement 1 étape (1 gène de résistance) 3 étapes (3 gènes de résistance) IV. 2. RNAi chez T.brucei

36 3. Exemple de l étude des MCAKs chez les Trypanosomatidés IV. 3. RNAi chez T.brucei

37 Quelques par3cularités des Trypanosoma3dés Pôle postérieur Cytosquelette membranaire : constitué exclusivement par un "corset" hélicoïdal de microtubules (pas de filaments d actine) Une seule mitochondrie, avec un ADN mt unique = Kinétoplaste Pôle antérieur

38 Quelques par3cularités des Trypanosoma3dés Double cycle cellulaire : Les deux cycles sont synchronisés mais indépendants - Celui de l ADN nucléaire (mitose) - Celui du kinétoplaste associé au corps basal (cytodiérèse) Duplication du corps basal Croissance du second flagelle Ségrégation du corps basal McKean (2003) Curr.Opin.Microbiol 6:600_7

39 Etude des MCAKs chez les Trypanosomatidés MCAKs = Mitotic Centromere-Associated Kinesins Kinésines de sous famille 13 qui hydrolysent les microtubules (métaphase, anaphase). 5/6 chez les Trypanosomatidés (1 chez l homme!!) IV. 3. RNAi chez T.brucei

40 LmjF Localisation intracellulaire chez Leishmania major: GFPc GFP K N N nf K nf Localisation préférentielle aux 2 extrémités du flagelle IV. 3. RNAi chez T.brucei

41 Effet de la surexpression de LmjF chez Leishmania major: LmjF GFPc Induction d un phénotype «flagelle court» + modification de la morphologie IV. 3. RNAi chez T.brucei

42 Inhibition de l expression par ARNi ARNi non réalisable chez Leishmania L. major et T. brucei très proches phylogénétiquement cf. forte synténie Leishmania Chromosome 33 T. brucei Chromosome 2 T. brucei Chromosome 11 Rupture de synténie ARNi réalisable chez T. brucei IV. 3. RNAi chez T.brucei

43 ARN interférence ciblant l orthologue de LmjF chez T. brucei : Tb Non-induit Induit Augmentation de la longueur du flagelle. Longueur du flagelle IV. 3. RNAi chez T.brucei

44 LmjF Localisation intracellulaire chez Leishmania major: GFPn DAPI IV. 3. RNAi chez T.brucei

45 ARN interférence ciblant l orthologue de LmjF : Tb N1K 3N1K 7N2K 7N2K 4N2K 4N2K 6N1K 0N1K 0N1K 4N2K 6N1K 4N2K 4N1K 4N1K IV. 3. RNAi chez T.brucei

46 ADN PFR 5N1K 0N1K IV. 3. RNAi chez T.brucei

47 PFR ADN IV. 3. RNAi chez T.brucei

48 Conclusion ARNi = actuellement un des outils de génomique fonctionnelle les plus puissants Facilités chez les protozoaires parasites : TRES SPECIFIQUE, rapide et inductible: insertion de grands ARN double-brins très peu d effets hors-cibles

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