Nouvelles approches pour la nano-caractérisation, et la micro- et nano-robotique par sondes locales

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1 Nouvelles approches pour la nano-caractérisation, et la micro- et nano-robotique par sondes locales Habilitation à Diriger des Recherches CEA Saclay Jérôme Polesel 2 octobre 2012

2 Sommaire I. Curriculum vitæ II. Cadre général des travaux III. Travaux : I. Nouveaux systèmes à sondes locales pour la biologie cellulaire II. Haute-Résolution, micro- et nano-robotique par capteurs intégrés IV. Prospectives et développements futurs: Trois Axes de Recherche 2

3 Parcours de chercheur 2011 Chercheur invité Institut de Microbiologie, ETH Zürich, Suisse Depuis 2008 Chercheur CEA Saclay, DSM-IRAMIS-SPCSI Chercheur-Ingénieur R/D CSEM SA, Neuchâtel, Suisse 2004 Doctorant invité King s College of London, UK Allocataire de Recherche CEMES-CNRS, Toulouse Université Toulouse III 3

4 Collaborations Collaborations nationales et européennes Pr. Stéphane Régnier, ISIR Jussieu Micro- Nano- Robotiques Dr. Tomaso Zambelli, LBB-ETH Zürich Biocapteurs, µfluidique Dr. Benjamin Grévin, CEA Grenoble, INAC Nanostencil Dr. Stéphane Guilet, LPN-CNRS, Marcoussis Microfabrication Dr. Peter Vettiger, IBM Zürich Microfabrication Pr. Urs Staufer, IMT Neuchâtel Microfabrication, capteurs Pr. Juergen Brugger, EPF Lausanne Microfabrication Dr. Hervé Volland, CEA Saclay, DSV Immunologie Pr. Julia Vorholt, IMB-ETH Zurich Microbiologie Dr. Ronald Melki, LEBS-CNRS Biologie structurale Dr. Lev Kantorovich, King s College London Modélisation Pr. Alex Shluger, University College London Modélisation 4

5 Encadrements et enseignements Encadrements, co-encadrements: 5 doctorants, dont 2 en co-direction 3 post-doctorants 7 stagiaires (Master2, Master et TIPE) Enseignements: UPMC Paris VI, Ecole Centrale d électronique Paris, Université de Zürich, ETH 20 heures de cours Université Toulouse III Moniteur, 288 heures (TP, TD et cours) 5

6 Directions de projets scientifiques Coordinateur de projets: C NANO, LABEX NanoSaclay, KTI (Suisse), SNF (Suisse), NRBC 6

7 Cadre général des travaux Nouvelles générations de systèmes à sondes locales: 1) Explorer et agir sur le monde biologique à l échelle de la cellule 2) Scruter, manipuler et fabriquer à l échelle nanométrique sous Ultra Vide 7

8 Contexte: la Microscopie à Force Atomique (AFM) OLYMPUS G. Meyer, 1988, IBM Zürich Gerber et Lang,

9 L AFM en biologie P. Hansma, 1986 Univ. of California A. Engel, 1991 Basel University Fotiadis, Scheuring et al., 2002 Diagnostic par histologie: Cellules tumorales Cross et al., Nature Nanotech Cellules mésothéliales bénignes 9

10 Vers l imagerie Ultra Rapide et la Haute Résolution walking myosin V 5 nm Toshio Ando rotorless F1-ATPase 10 images AFM par seconde! bacteriorhodopsin (D96N) (réponse à la lumière) 10

11 Nanomanipulation et Nanofabrication Pointe STM L. Grill et al., 2007 U=R.I Signature du courant tunnel du déplacement («Hopping») F E k. x Mais pas de mesures directes de la force nécessaire au déplacement et à l énergie dissipée 11

12 Des limitations à résoudre Temps d acquisition long sur de larges zones explorées (> qqs µm), ou spectroscopie cellulaire (plusieurs minutes à plusieurs heures!) Nécessité d utiliser des leviers de plus en plus proches de la limite de diffraction optique de détection (faible k, et haute fréquence) Présence du laser : sources d artefacts optiques, problèmes en milieux turbides, incompatible avec l étude d échantillons thermosensibles ou photosensibles Intégration du «levier optique» difficile pour une architecture multisondes fonctionnant en parallèle (nano-robotique, multiplexage) 12

13 Capteurs intégrés et sondes AFM 13

14 Architecture matricielle de microleviers Le «Millipede» : du stockage de données vers la biologie cellulaire! (1998) J. Polesel, 2006 P. Vettiger, IBM Zürich G. Binnig, IBM Zürich 14

15 Sondes piézorésistives: principe Proportionnalité entre l élongation relative et la variation de résistance électrique l R R R Passivation: Nitrure de silicium Piézorésistance: silicium dopé au Bore l l surface R R K. l l 15

16 Sondes piézorésistives: fabrication et matrices Apex= 20 nm k=0.06 N/m 16

17 Sondes piézorésistives: intégration 10 mm Pilotage d une matrice de 16 microleviers en parallèle 17

18 Force (nn) Force (nn) Force (nn) Force (nn) Spectroscopie de force sur cellule Z (nm) 18µm Z (nm) Z (nm) 6.4µm Analyse du module d élasticité E donné par le modèle de Hertz-Sneddon : E F 1 Z (nm).tan

19 Acquisition d images et de courbes en parallèle 170 um k=160 mn/m compatible avec l imagerie AFM à hauteur constante Zone de l ordre du mm² Résolution de l ordre de 200 nm 19

20 Spectroscopie de force et limite de résolution PBS (0.01M) Détection minimale de force = 160 pn Polylysin (5mg/l) glass surface Force 600 pn/div Distance (nm) in expert reviews in molecular medicine, 20

21 Angstroms/sqrt(Hz) Limite de détection Comparatif : détection optique et piézorésistive Op-Amp Bandwith=7kHz Optical laser beam detection Physical limit of noise Piezoresistive detection S Johnson S1/ f S Johnson S Athermal S Athermal W frequency (Hz) S 4. k. T R Johnson B. Prédominance du bruit Johnson-Nyquist et du bruit en 1/f pour la détection piézorésistive S 1/ f f i 2 load 2. R. f. N Origine du bruit en 1/f? S A thermal f 4k T Q B 2 2 c 0kc 2f Qc 21 1 f 0 2

22 Détection optique par interférométrie 22

23 Détection interférométrique: principe CMOS camera Diode laser reference Miroir cantilever cantilever Image en intensité = 2 cantilever Interférogramme = 2 cantilever reference surface I( z) I I2 2 I1.I 2cos 1 avec: z 4n J. Polesel,

24 Déflexion pointe mesurée (nm) Suppression de l ambiguïté de phase z 4n Linéarité de mesure pour z < λ/2 Mesure limitée à 329 nm λ/2 surface Solution apportée par la mesure de plusieurs profils: It 350 / Déflexion pointe réelle (nm) 24

25 Détection interférométrique: intégration J. Polesel,

26 Mesures de l élasticité cellulaire 10 nn 2 µm 3T3 cells Sensibilité de l ordre de 10 pn avec k= 0.01 N/m 26

27 Agir sur la cellule unique Des cellules individuelles, bien que génétiquement identiques, montrent des phénotypes différents et des profils d expression différents des gènes Nature, december 2011 T. K. Chowdhury, 1969 T. Zambelli, J. Polesel,

28 FluidFM: principe et intégration Microlevier creux Un microlevier creux: 28

29 Injection, extraction, dépôt, manipulation cellulaire Perforation et injection/extraction contrôlée: Perforation membranaire Contact non-invasif Manipulation contrôlée de cellules: Myoblastes C2C12 P. Dörig et al., 2010 Saccharomyce cerevisiae 29

30 Injection ciblée de virus dans une cellule Vaccinia A5-GFP Suivi en microscopie optique: P. Stiefel et al.,

31 1 er Bilan Premières études de la cellule dans son milieu avec des capteurs intégrés piézorésistifs: intégration matricielle, mais limite de détection (160 pn) Première approche interférométrique de sondes AFM: repousse la limite de détection (10 pn), intégration matricielle, mais interface optique à contrôler Première utilisation d un microlevier creux AFM comme microseringue contrôlée en force, pour la biologie cellulaire 31

32 Capteurs intégrés et Haute Résolution 32

33 Sonde piézoélectrique: principe Diapason en quartz avec électrodes (Cr, Au, Ni, Al) de pilotage 100 um Electrical Butterworth- Van Dyke model Facteur de qualité élevé Q > à l air 500 N/m < k < N/m Utilisé en mode AC F. Giessibl, Rev. Mod. Phys. 75, 949 (2003) 33

34 Avantage du diapason Force de rappel nécessaire pour oscillation entretenue: k. A L énergie d entretien de l oscillateur: k 2 A Q F tip surface E tip surface avec E A tipsurface k. A Le rapport signal-sur-bruit le plus favorable si A=λ (portée de l interaction): f f z 2 2 z A 2 2 Z mechanical F. Giessibl, 1999 F. Giessibl et al., Appl. Surf. Sci. 140, 352 (1999) Ainsi, pour λ~å, on converge vers une sonde t. q. : A Angström k 2000 N/m 34

35 Sonde piézoélectrique: intégration GND1 UHV Chamber V Bias GND3 J. Polesel, nm V(I tunnel ) INA Sample GND3 GND1 Tip V(I TF ) INA GND3 GND2 Actuator GND3 GND2 35

36 <Itunnel>/Itunnel Sonde piézoélectrique: intégration V Bias GND3 GND1 STM standard: I tunnel I.exp 2.. z 0 STM oscillant: avec 2. m. V(I tunnel ) GND3 INA GND1 Sample Tip I tunnel 1 T T z. 2. A I tunnel I exp. I0.exp 2.. z( t). dt Actuator GND2 z ( t) z0 A.cos 2. f. t Tuning Fork AFM I tunnel Cantilever AFM I tunnel 4.. A Gain d un facteur 6 à 16 sur <I tunnel >! Amplitude (Angstroms) 36

37 normalized Amplitude Sonde piézoélectrique: intégration Δf Forces conservatives ΔA Dissipation FM-AFM (Modulation de Fréquence): Attractive Repulsive V(I TF ) GND3 GND3 INA normalized Frequency GND2 U=R.I Sample Tip Actuator GND2 z ( t) z0 A.cos 2. f. t F E k. x Force F f f f A. k 2 z t, z t 1/ f z( t), z ( t).sin 2. f t 0 0 F. TF f0 2. k TF 0. df dz. k. A Energy Dissipation Q 2 0. Exc Exc 0 0 f f 0 dt 37

38 Molécules faiblement adsorbées: P3DDT sur HOPG STM regulation <I t > =4.3pA, V=-1Volt, A=92pm T=300 K Stabilité d imagerie sur molécules faiblement adsorbées Inversion de contraste liée à un effet de trajectoire de la pointe La spectroscopie en distance démontre un régime de force répulsif durant l imagerie STM, à petit courant (pa) Force gradient HOPG Molecules Tunneling current Dissipation HOPG Molecules 38

39 Effet mécanique à l échelle d une molécule! Paracyclophanes sur HOPG Effet mécanique de la compression de la pointe sur la molécule electronic switch? étude en cours Topography Dissipation Force gradient T=300 K Collaboration A. Bocheux, F. Charra (CEA -SPCSI-LEPO) 39

40 Graphène sur SiC(0001): étude AFM-STM Régulation STM: Haute Résolution, mise en évidence des réseaux hexagonaux SiC et graphène nm (250x250)nm 2 (50x50)nm 2 a) b) Å (6x6)nm 2 (2x2)nm 2 c) d) nm 0.00 Z(nm) Å 0.00 Z(Å) 0 Z(pm) Régulation FM-AFM: topographie et carte en courant tunnel Chute brutale de la conductivité du graphène révélée? Etude en cours J. Moran Meza, PhD. 40

41 Projet satellite: étude mécanique de MEMS-NEMS Etirement contrôlé d un «nanoressort» GaAs : Courbe de force acquise en parallèle : 41

42 Projet satellite: NanoStencil fabrication de nano-électrodes 42

43 Projet satellite: NanoStencil fabrication de nano-électrodes Tuning fork force sensor Evaporator Metal flux «Atterrissage» de la sonde en AM-AFM et FM-AFM Deposited contact Nanoelectrode Rapport des masses sonde/puce ~ 1 Nanoélectrodes d or sur TiO 2 43

44 2 ème Bilan Premières études à l échelle de la molécule avec un diapason AFM-STM, à température ambiante Première utilisation d un capteur piézoélectrique pour la caractérisation de MEMS-NEMS in situ dans un MEB (gamme de force explorée du µn au nn ) Première démonstration de nanofabrication par NanoStencil au moyen d un capteur piézoélectrique 44

45 Bilan actuel Travaux multidisciplinaires à l interface physique-chimie-biologie Collaborations interdisciplinaires nouées 8 instruments originaux réalisés 32 publications dans des revues à comité de lecture 1 ouvrage, 1 chapitre de livre 2 prix (Prix Innovation/Recherche, Prix d Instrumentation) 7 brevets, dont 1 valorisé par une start-up 45

46 Et après Trois Axes de Recherche proposés en prospective: Axe 1 : Imagerie et spectroscopie de Force Haute Résolution à l échelle de la protéine Axe 2 : Nanomanipulation et haute vitesse en milieu biologique Axe 3 : Biocapteurs en polymère 46

47 Enjeux Comprendre les liens biophysiques et pathologiques (fibres amyloïdes (processus d assemblage et interaction avec la membrane), mécanisme d entrée du prion PrPc PrPsc, endocytose cellulaire) S. Pawlicki, 2005 Détection et criblage multiplexés sur le terrain (génomique, protéinique et cellulaire), détection de menaces biologiques USA France MEMS, NEMS Intégration, portabilité Haute Sensibilité Multiplexage, sélectivité 47

48 Axe 1 : Imagerie et spectroscopie de Force Haute Résolution à l échelle de la protéine La haute résolution en imagerie AFM et en spectroscopie de force avec les capteurs intégrés 2 mm J. Polesel, 2010 Deux Prix (Innovation, Instrumentation): k eff Q k 0.7 N/m Collaboration CEA DSV-LERI (H. Volland) 48

49 Axe 1 : Imagerie et spectroscopie de Force Haute Résolution à l échelle de la protéine Fonction chimique/biologique Oscillateur Pointe Linker Surface 49

50 Axe 1 : Imagerie et spectroscopie de Force Haute Résolution à l échelle de la protéine Haute Résolution en milieu liquide Nouvelle procédure de fonctionnalisation des pointes Quantification des interactions spécifiques Glucose Oxydase 50

51 Axe 1 : Imagerie et spectroscopie de Force Haute Résolution à l échelle de la protéine Etude par DFS (diagramme de Bell-Evans), information énergétique de l interaction ligand-protéines Etudes sur modèles membranaires Etude de systèmes biologiques photosensibles 51

52 Axe 2 : Nanomanipulation et haute vitesse en milieu biologique Ultra-Vide Milieu biologique Manipulations, adressage spécifiques d interaction: Brins d ADN Protéines Fibres Cellules 52

53 Amplitude (a.u.) Axe 2 : Nanomanipulation et haute vitesse en milieu biologique Plateforme de nanomanipulation à l air: Tests préliminaires en solution: 200.0µ in air immersed in liquid 150.0µ 100.0µ 50.0µ Frequency (MHz) f= MHz AFM haute vitesse par capteur intégré Manipulation contrôlée de nanobilles d or (80 nm) à l air: T. Ando J.-O. Abrahamians, PhD. 53

54 Axe 2 : Nanomanipulation et haute vitesse en milieu biologique 4. Dynamic-Mode AFM in liquid Takeshi Fukuma, Michael J. Higgins Février

55 Axe 3 : Biocapteurs en polymère et analyse multiplexée Utilisation de matériaux polymères organiques pour élaborer des micro- et nano- capteurs ( E polymère =E Silicium /40 ) Mise en place de la chimie de fonctionnalisation pour une utilisation en biocapteurs Communication sans-fil de ces capteurs passifs 55

56 Axe 3 : Biocapteurs en polymère et analyse multiplexée Quelques preuves de concepts: J. Polesel, μm 56

57 Remerciements aux doctorants, post-docs, stagiaires Paris Zürich CEA Saclay Neuchâtel Toulouse 57

58 Remerciements particuliers Christophe Lubin François Thoyer Thomas Berthelot Pascal Viel Hervé Volland Serge Palacin Ali Makky 58

59 Remerciements CEA-SPCSI: Luc Barbier Catherine Julien Christine Prigian Jacques Cousty Frédéric Merlet Sylvain Foucquart Fabien Silly Laurent Pham Van Et tout le SPCSI CEA-SPAM: Marc Briant CEA-LSI: Patrice le Houedec CEA-LERI: Cécile Féraudet-Tarisse Christophe Créminon UPMC-ISIR: Stéphane Régnier Sinan Haliyo ETH Zürich: Tomaso Zambelli Julia Vorholt CSEM Neuchâtel: Harry Heinzelmann Raphaël Pugin André Meister Marta Giazzon Martha Liley Réal Ischer Eric Bernard IBM Zürich: Peter Vettiger LPN-CNRS: Stéphane Guilet Christophe Roblin CEMES-CNRS Toulouse: Sébastien Gauthier Thierry Ondarçuhu Christian Girard Jean-Pierre Boué Laurent Guiraud Henry Pinna KCL-UCL Londres: Lev Kantorovich Thomas Trevethan Alex Shluger Cécilia Liliane et Cannelle 59

60 MERCI DE VOTRE ATTENTION Commissariat à l énergie atomique et aux énergies alternatives Centre de Saclay Gif sur Yvette Cedex T. +33 (0) F. +33 (0) DSM IRAMIS SPCSI Etablissement public à caractère industriel et commercial RCS Paris B

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