Comparaison et! Alignement! de séquences

Transcription

1 Comparaison et! Alignement! de séquences Frédérique Barloy-Hubler CNRS-IGDR Rennes Responsable PF Amadeus Annotation des gènes et des génomes Biosit -UMS 3480

2 Un petit jeu pour commencer

3 Pourquoi comparer deux objets? C est quoi?

4 Pourquoi comparer deux objets? C est quoi? C est un fruit, une pomme, une granny smith Comment je le sais?

5 Pourquoi comparer deux objets? C est quoi? C est un fruit, une pomme, une granny smith Comment je le sais? Taille, forme, couleur

6 Pourquoi comparer deux objets? C est quoi?

7 Pourquoi comparer deux objets? C est quoi? Je ne sais pas mais

8 Pourquoi comparer deux objets? C est quoi? Cela ressemble à : citron mure-framboise litchi

9 ALIGNEMENT de SEQUENCE 2 à 2 DEFINITION ALIGNEMENT MULTIPLE

10 Pourquoi comparer deux objets? Pour «nommer» un objet, le schéma classique est : -> OBSERVATION, DESCRIPTION -> COMPARAISON -> TRI, CLASSEMENT, RANGEMENT La comparaison est le pont indispensable entre l'observation et la classification.

11 Les limites de la comparaison Comparer ce qui est comparable??

12 Les limites de la comparaison La base de connaissances est incomplète?

13 Les limites de la comparaison Analyser les résultats La comparaison me dit : = Différences possibles (localisation, environnement, autres critères )

14 Comparer deux séquences?

15 Comparer deux séquences? Comparer de séquences 2 à 2 revient à comparer des chaines de caractères (formant ou non des mots)

16 Comparer deux séquences? Comparer de séquences 2 à 2 revient à comparer des chaines de caractères (formant ou non des mots) Les questions sont : - Est ce que ces 2 chaines de caractère ont un lien? - Est ce que ces 2 chaines de caractère ont le même sens? - Exemple POIRE et FOIRE sont des chaines de caractère similaires mais elles n ont pas le même sens

17 Pourquoi comparer deux séquences? Les séquences biologiques qui présentent de ressemblances ont tendance à partager de l information sur leur(s) fonction(s) cellulaires et biochimiques «si je ressemble à une pomme, je suis sans doute une pomme» Or, il est difficile de trouver expérimentalement la fonction d une protéine sans connaissance préalable Annoter par comparaison permet d orienter les recherches

18 Exprimer et interpréter la ressemblance On peut nommer la ressemblance entre deux séquences biologiques en terme de similarité et d identité : La similarité qui est une quantité mesurable de ressemblance, elle s exprime en % L identité qui signifie une ressemblance parfaite entre deux élément. Elle s exprime de manière binaire : 2 protéines sont identiques ou non

19 Similitudes et homologies La similarité ou similitude mesure donc un taux de ressemblance souvent noté «pourcentage de similitude» : % de similitude = % d'identité + % de substitutions conservatives L'homologie est une notion à connotation évolutive et indique que des séquences dérivent d'une séquence ancestrale commune. Remarque Deux séquences peuvent avoir un bon degré de similitude sans être homologues Deux séquences peuvent être homologues avec un faible degré de similitude.

20 Homologie Homologues = Séquences qui dérivent d un ancêtre commun. Blé gène A Colza gène A orthologues : Séquences similaires dans organismes différents (spéciation) Gene ancestral Duplication Chou gène A Chou gène A Chou gène A Blé gène A paralogues : Séquences au sein d'un organisme unique (duplication) Arabette gène A Remarque : ils existent d autres types d homologues comme les xénologues (transferts horizontaux), in-paralogues (duplication après spéciation) sinon outparalogues

21 Qu est ce qu un alignement? L'alignement de deux séquences est une représentation qui permet de visualiser leurs ressemblances : Identité, similitude, insertion, délétions Cet alignement se compose donc de 4 Segments identiques 2 Segments similaires 2 Segments alignés A et G Même classe : Purine Insertions de "gap" qui représente une insertion (séquence du haut) ou une délétion (séquence de bas)

22 Global ou local? Il est possible de réaliser un alignement : global, c'est-à-dire entre les deux séquences sur toute leur longueur local, entre une séquence et une partie d une autre séquence Similarité global Similarités locales

23 Global ou local? Il est possible de réaliser un alignement : global, c'est-à-dire entre les deux séquences sur toute leur longueur -> algorithme de Needleman-Wunsch local, entre une séquence et une partie de l'autre séquence -> algorithme de Smith-Waterman Similarité global Similarités locales

24 L alignement de séquences biologiques L alignement de séquences biologiques revient à aligner des chaînes de caractères Un alignement est une correspondance entre 2 ou plusieurs chaines de caractères sans en changer l ordre, et en autorisant éventuellement des «trous». Deux lettres identiques face à face = match Deux lettres différentes face à face = mismatch Une lettre face à un trou = gap ou indel (insertion-délétion) Le degré de similarité entre les séquences alignées est quantifié par un score.

25 L alphabet des séquences biologiques Un alphabet est un ensemble fini de symboles distincts deux à deux. L alphabet de l ADN est composé de 5 symboles ΣADN ={,A,C,G,T} L alphabet de l ARN également -> ΣARN = {,A,C,G,U} L alphabet des protéines est composé de 21 symboles ΣAA = {,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y} qui représente les acides aminés

26 Notion de distance La distance de Hamming La distance de Hamming (dh) est très simple : Entre 2 mots de même longueur, dh est le nombre de substitutions de caractères nécessaire pour transformer le premier mot en second mot. Entre le mot U et le mot V : dh = 4 L'algorithme de Needleman et Wunsh est basée sur cette distance

27 Notion de distance La distance de Levenshtein Cette distance (dl) ajoute, à la distance de Hamming, la prise en compte de la présence des insertions, des délétions et des substitutions. La distance dl entre le mot U et le mot V se calcule à l'aide d'une matrice dite de programmation dynamique qui permet non seulement de calculer un score de similarité entre u et v mais aussi de les aligner. L'algorithme de Smith et Waterman est basé sur cette distance.

28 Notion de programmation dynamique La matrice dite de programmation dynamique Comparons ATTGA et ATCCGA avec une matrice de ce type. Ici la distance dl finale est de 2 ATTGA Dans chaque case, la fléche représente une possibilité (il y en a plusieurs) de type de calcul Identité (score=0) ou substitution (score=1) ATT - GA ATCCGA (score=1) Pour le mot horizontal, délétion Pour le mot horizontal, insertion Idem pour

29 Notion de score global On remarque dans l exemple précédent que l attribution du score global se fait «site par site» Il résulte de la somme des scores élémentaires calculés sur chacune des positions appariés de manière optimal. Ce score additif correspond à l hypothèse selon laquelle chaque séquence accumule des mutations à un rythme qui lui est propre selon la pression de sélection à laquelle elle est soumise et que chaque site est susceptible d évoluer indépendamment. C est une hypothèse simplificatrice qui peut parfois être fausse notamment pour les ARN.

30 Problème de score Scorer les gap Pénaliser les gaps ou ne pas les pénaliser? Quelle(s) pénalité(s)? Scorer les similitudes Les similitudes sont scorés à l aide de matrice(s) de substitution. Quelle matrice choisir sachant que, bien évidemment le score et l'alignement seront dépendants du choix de la matrice.

31 Scorer par identité Une façon simple de scorer un alignement est de compter le nombre de correspondance parfaite. On obtient un % de sites identiques en divisant le nombre de correspondance et le nombre de positions (en incluant les gaps) 11 matches identiques sur 16 positions = 68,75% (69%) de sites identiques

32 Scorer par identité Une façon simple de scorer un alignement est de compter le nombre de correspondance parfaite. On obtient un % de sites identiques en divisant le nombre de correspondance et le nombre de positions (en incluant les gaps) 11 matches identiques sur 16 positions = 68,75% (69%) de sites identiques Pb de la longueur : le % d identité dépend de la longueur, plus la séquence est longue, plus il diminue en général Pb des matchs aléatoires: dans l ADN, 25 % des positions matchent par hasard contre 5 % chez les protéines.

33 Scorer par identité Interprétation(s) < 20 % > 30% d acides aminés identiques Fonction(s) Différente(s) Fonction(s) similaire(s) probable Entre 20% et 30%, on est dans la «zone d ombre» Sauf pour des protéines très particulières, on n observe jamais 100% de sites identiques entre protéines homologues chez différentes espèces

34 Scorer à l aide de matrices Il existe plusieurs matrices de score Le mode de calcul est toujours le même 1 - Les scores élémentaires (se, site par site) sont donnés par la matrice 2 - Le score global est la somme des scores élémentaires Score global = Σ se 3 - Le score final est le score global moins la somme des pénalités P Score = Σ se - Σ P Le score est donc fonction de la longueur de l alignement, de la matrice utilisée et du poids des indels qui définit les pénalités.

35 Les matrices de substitution Matrices d identité existe pour ADN, ARN et les acides aminés Matrices «Génétique» pour les acides nucléiques Matrices «Homologie» pour les acides aminés Similarités physico-chimiques Evolution des substitutions Comparaison des séquences

36 Les matrices nucléiques Matrice d identité Matrice unitaire Matrice Transversion - Translation

37 Les matrices nucléiques Les modèles décrivant l évolution de l ADN JC Jukes et Cantor K80-K2P 1980 Kimura a=b=c=d=e=f a=c=d=f, b=e 2 substitutions K81-K3ST 1981-Kimura T /T Tamura a=f, b=e, c=d 3 substitutions a=c=d=f, b, e 3 substitutions

38 Les matrices protéiques Les matrices protéiques d identité ne sont pas utilisées puisqu 1 a.a. peut être substitué sans altération importante de la structure ou de la fonction par un autre qui lui ressemble. Ces ressemblances peuvent être de plusieurs types : - même charge - hydrophiles / hydrophobes - type de groupement latéral : polaire (groupe I), polaire non chargé (groupe II), chargé (groupe III)

39 Les matrices de substitution Les matrices protéiques liées à l évolution sont : Basées sur des arbres construits en utilisant le maximum de parcimonie : PAM (Dayhoff et al., 1978) JTT (Jones et al., 1992). Sur des arbres construits en utilisant le maximum de vraisemblance : WAG (Whelan et Goldman, 2001). Sur des comparaisons par paires utilisant des alignements locaux : BLOSUM (Henikoff et Henikoff, 1992) Gonnet (1992)

40 Matrice PAM (Point Accepted Mutation) Proposé par Margaret Dayhoff et al. en 1978 Une mutation ponctuelle acceptée (accepted point mutations) est une substitution entre 2 acides aminés accepté par la sélection naturelle L idée est d'analyser les mutations ponctuelles acceptées dans un grand nombre de groupes de séquences alignées et sans gap En 1978 : 71 familles de protéines id> 85% 1300 séquences Ensuite, ils ont calculé la probabilité qu un acide aminé change dans un petit intervalle évolutif = la mutabilité relative (relative mutability) mj = nombre de changements de j / nombre d'occurrences de j

41 Matrice PAM (Point Accepted Mutation) Mutabilité relative A l aide la matrice des mutations ponctuelles acceptées et la mutabilité relative, on calcule la probabilité de mutation pour chaque paire d acides aminés

42 Matrice PAM (Point Accepted Mutation) La matrice PAM1 Fréquences multipliées par Il y a 0.11% de probabilité que C soit remplacé par S

43 Matrice PAM (Point Accepted Mutation) La matrice PAM1 La matrice PAM1 donne la probabilité de mutation pour un intervalle d évolution dans lequel 1% des substitutions étaient acceptées Les probabilités de mutation pour des intervalles d évolution plus grands sont obtenues par la multiplication du PAM1 avec elle-même PAM120 = PAM substitutions acceptées pour 100 aa PAM250 = PAM substitutions acceptées pour 100 aa

44 Matrice PAM (Point Accepted Mutation) Distance évolutive et valeur des matrices PAM 25 % = PAM30 50 % de distance = PAM80 80% de distance = PAM246 Le «bon» choix de la matrice PAM dépend du jeu de données (connaissances à priori?)

45 Matrice PAM (Point Accepted Mutation) Les matrices PAM ont été réactualisées en 1992 par Jones, Taylor et Thornton. Ces matrices réactualisées apparaissent sous le nom de matrices JTT. La réactualisation a été conduite sur la base de 2621 familles de protéines ( séquences, mutations ponctuelles) issues de la base de données SWISSPROT. Boite à outils Site pour calculer matrice PAM

46 Matrice BLOSUM (BLOcks SUbstituion Matrix) Proposé par Henikoff & Henikoff en 1992 Dérivées d alignement multiples locaux de blocs Blocs = régions conservées de familles protéiques ne contenant pas d indels 2000 blocs provenant de 500 familles provenant de la banque de données BLOCKS (

47 Matrice BLOSUM (BLOcks SUbstituion Matrix) Les matrices BLOSUM ne sont pas basées sur la distance d évolution comme les matrices PAM Les matrices BLOSUM ont pour objectif de trouver des régions conservées entre différentes séquences en aa 504 groupes de séquences proches 2205 blocs Regroupés en clusters selon % id BLOSUM 62 = groupe de blocs à 62 % id BLOSUM 80 = groupe de blocs à 80% id

48 Matrice BLOSUM (BLOcks SUbstituion Matrix) Les matrices BLOSUM ont cependant tendance à «dériver» En effet, les bases de données contiennent un nombre très variables de séquences selon les espèces et selon les protéines. Les matrices BLOSUM tiennent ce décentrement en compte en appliquant une pondération (poids basé sur le nombre de séquences par blocs). On obtient une matrice de fréquences pondérées transformée ensuite en probabilités d occurence

49 Matrice BLOSUM (BLOcks SUbstituion Matrix) BLOSUM62

50 PAM versus BLOSUM Comparaison BLOSUM62 et PAM250 BLOSUM62 PAM250

51 Importance du choix de la matrice Impliquées dans toutes les analyses par comparaison de séquences par alignement Les résultats sont fortement dépendant de la matrice utilisée Comprendre une matrice permet de faire «le bon choix»

52 Importance du choix de la matrice Impliquées dans toutes les analyses par comparaison de séquences par alignement Les résultats sont fortement dépendant de la matrice utilisée Comprendre une matrice permet de faire «le bon choix» A RETENIR 80% Id 60% Id 40% Id 20% Id 80% Id 62% Id 30% Id

53 Comparer deux séquences? La comparaison de deux séquences peut se faire : Par dotplot Par alignement L alignement 2 à 2 peut-être : - global ou local - réalisé par : programmation dynamique méthode heuristique apprentissage machine

54 Le Dot Plot Les dotplots ou (graphe par matrice de points) sont utilisés : Une représentation graphique de la similarité par paires Sa simplicité empêche les artefacts Idéal pour rechercher des caractéristiques similaires dans des ordres différents (répétitions, inversions ) Bénéficier de la plus sophistiquée d'analyse statistique outil dans l'univers... votre cerveau

55 Le Dot Plot Les dotplots sont utilisés : Pour mettre en évidence visuellement des ressemblances/différences globales ou locales entre deux séquences Par les programmes de recherche de similarité dans les premières étapes de recherche. Pour analyser les régions de séquence de «faible complexité» Pour analyser les séquences qui «résistent» à la recherche classique d homologie de séquences

56 Le Dot Plot Le DotPlot utilise une matrice élémentaire ou unitaire également appelé tableau à double entrée

57 Le Dot Plot Lecture d un dotplot Dans un dotplot, les deux séquences sont placées le long des axes d'un graphique : L axe X représente la première séquence L axe Y représente la seconde séquence L'intersection de chaque ligne et colonne est marquée d'un point si la lettre est la même dans les deux séquences Seq 2 Une diagonale révèle une région identique entre les deux séquences. Seq 1

58 Le Dot Plot (exemples) ARN gène A DotPlot et épissage ADN gène A DotPlot et répétitions DotPlot et synténie Zone d instabilité synténique inversion Matrices dot plot de séquences IGS de six espèces de diptères révélant différentes tailles de sous-répétitions (Huang et al, 2011)

59 Le Dot Plot (exemples) DotPlot et structure d ARN DotPlot et fonction assignation pour protéines A : organisation fonctionnelle de la structure primaire de la protéine P101 B : dotplot avec un homologue putatif Hofacker et al, 1998 Voigtet al, 2005

60 Le Dot Plot (exemples) DotPlot et génomes DotPlot et assemblage (NGS) Comparaison des génomes de maïs et de sorgho Schnable et al, 2010 Dotplot d'une portion de scaffold et des BACs qui reflète l absence de problème d assemblage (ordre ou orientations des contigs corrects) Mural et al, 2002

61 Les outils pour réaliser des dotplots YASS

62 Les outils pour réaliser des dotplots YASS Génome 1 Génome 1 Input : Séquence acide nulcéique (.fna) Sans annotation

63 Les outils pour réaliser des dotplots

64 Les outils pour réaliser des dotplots YASS Génome 1 Génome 2

65 Les outils pour réaliser des dotplots

66 Les outils pour réaliser des dotplots ZPICTURE Outil pour visualiser les alignements blastz (alignement local à base de graines espacées) en utilisant PipMaker (serveur web d alignement) Possibilité d entrer des annotations en plus (# avec YASS) Possibilité d entrer des numéros d accession Exemple avec 2 génomes bactériens

67 ZPICTURE Liste ECR Evolutionary Conserved Regions

68 ZPICTURE Liste ECR 2 paramètres Génome 1 Génome 2

69 ZPICTURE Alignement 2 formats

70 ZPICTURE Alignement

71 ZPICTURE Alignement

72 ZPICTURE Dot-plot Si annotations

73 ZPICTURE Dot plot

74 ZPICTURE Vizualisation

75 ZPICTURE Vizualisation

76 Les outils pour réaliser des dotplots Quelques autres outils de Dot-plot (séquences plus petites ou plus homologues) DOTLET ou EMBOSS Dottup DNAdot APLOT 2 applets Java intéressantes Gepard JDotter

77 Référence Dotplots Gibbs, A. J. & McIntyre, G. A. (1970). The diagram method for comparing sequences. its use with amino acid and nucleotide sequences. Eur. J. Biochem. 16, Staden, R. (1982). An interactive graphics program for comparing and aligning nucleic-acid and amino-acid sequences. Nucl. Acid. Res. 10 (9),

78 Conclusion sur les dotplots Avantages et inconvénients les plus: les moins: - simple - très informatif - on peut comparer sans «annotation» - interprétation pas de mesure objective - pas d information fonctionnelle besoin de méthodes complémentaires permettant une mesure quantitative et qualitative des similarités

79 L alignement de séquences Quelle préférence : faire juste ou faire vite? Les méthodes dites exactes dont le résultat est garanti pour être mathématiquement optimal : Needleman-Wunsch (global) Smith-Waterman (local) Les méthodes dites heuristiques qui font rapidement des hypothèses vraisemblables mais pas nécessairement optimisées : BLAST FASTA

80 Les méthodes exactes Programmation dynamique Algorithme de Needleman & Wunsch (1970) alignement global optimal de 2 séquences entre deux séquences sur toute leur longueur Algorithme de Smith & Waterman (1981) alignement local optimal de 2 séquences entre une séquence et une partie d une autre séquence

81 Comparaison des 2 algorithmes Exemple avec la matrice de score suivante : Match = +1 Mismatch = -1 Gap = -1

82 Needleman & Wunsch Algorithme de Needleman & Wunsch Exemple de «programmation dynamique» Première application pour les séquences biologiques. Initialement développé pour les séquences protéiques Cet algorithme s appuie sur trois étapes : Initialisation : matrice avec les séquences Première ligne et colonne remplies par des «gaps»

83 Needleman & Wunsch Initialisation : matrice avec les séquences Score : remplissage de la matrice -> matrice score final

84 Needleman & Wunsch Initialisation : matrice avec les séquences Score : remplissage de la matrice -> matrice score final «Trace back» : remonte et recherche chemin optimal (trois mouvements : diagonale, up et down) Meilleur alignment: A T C G!! _ T C G!

85 Smith & Waterman Variation de l alignement de Needleman & Wunsch Basé sur la distance de Hamming Cet algorithme s appuie également sur trois étapes : Initialisation : matrice avec les séquences Première ligne et colonne remplies par des zéros

86 Smith & Waterman Initialisation : matrice avec les séquences Score et matrice de score finale

87 Smith & Waterman Initialisation : matrice avec les séquences Score et matrice de score finale «Trace back» : remonte et recherche chemin optimal (trois mouvements : diagonale, up et down) Meilleur alignment: T C G!! T C G!

88 Resumé Needelman- Wunch Smith-Waterman GLOBAL LOCAL Meilleur alignment: A T C G!! _ T C G! Meilleur alignment: T C G!! T C G!

89 Comparer global et local LALIGN (W. Pearson, 1991) Le programme LALIGN permet de faire soit un alignement local soit un alignement global avec 2 séquences (protéiques ou nucléiques)

90 Autres outils en ligne d intérêt LALIGN (W. Pearson, 1991) METHODE MATRICE PENALITES SEQUENCES

91 Autres outils en ligne d intérêt LALIGN (W. Pearson, 1991) >seq1! GCGACTGTTCGGAGGAAAGTGAGTCTGTGGTACTGATGGAGTCACGTAC! >seq2! GCATGCGAGGACGGAAAAGTGGTCAAGGCTGCAGTCACCTACGTCGTAC! GLOBAL versus LOCAL

92 Les paramètres des alignements Pour les méthodes fonctionnant avec un fenêtre glissante comme le dot plot, deux paramètres : La taille de la fenêtre et Le pas de glisse Taille = 3 Pas = 2 Taille = 3 Pas = 3 88, 96, 92, 74, 56, 66, 85, 97, 82, 88, 96, 92, 74, 56, 66, 85, 97, 82, 77 Trop d informations Perte d informations

93 La pénalité des indels Insertions ou délétions : indels (gap) La fonction linéaire de pénalité d'un gap est définie par : n = longueur du gap d = pénalité d'ouverture d'un gap e = pénalité d'extension d'un gap Exemple : un gap de longueur n = 3, avec une pénalité d'ouverture de -10 et d'extension de -2, aura un score de f = (-2 x 2) = -14 La fonction de pénalités des gaps sontdifférentes selon les algorithmes : Fonction affine (plus réaliste) : f(n)=d+e*n mais aussi fonctions logarithmiques

94 La pénalité des indels La fréquence moyenne observé pour les gaps et de 1/10, de sorte qu'ils sont communs dans la plupart des alignements. Symbolisé par des tirets (---) jumelé avec des résidus: décalage avec un espace vide. GAP OPEN (GOP): GAP EXTENSION (GEP) : valeur de la pénalité pour l'ouverture d'un gap. valeur de la pénalité pour l'extension d'un gap. GOP : -3 GEP : -1 Identité = 4 Calculez les scores? Quel alignement est le moins «pesant»?

95 La pénalité des indels GAP OPEN (GOP): valeur de la pénalité pour l'ouverture d'un gap. GAP EXTENSION (GEP) : valeur de la pénalité pour l'extension d'un gap. GOP : -3 GEP : -1 Identité = 4 Score = 9 Score = 7

96 La pénalité des indels En programmation dynamique, changer la pénalité de gap revient à changer le chemin parcouru et donc l alignement Gap penalty = -4 Gap penalty = -8

97 Effet de la pénalité des indels 2 protéines LALIGN global.

98 Choix des matrices Il existe de nombreuses matrices Il est difficile de savoir laquelle utilisée Les premières études comparatives sur l'utilisation de différentes matrices (Feng et al., 1985 ; Taylor, 1986 ; Argos, 1987 ; Risler et al., 1988) montraient qu'il n'existe pas de matrice idéale.

99 Choix des matrices Il existe de nombreuses matrices Il est difficile de savoir laquelle utilisée Les premières études comparatives sur l'utilisation de différentes matrices (Feng et al., 1985 ; Taylor, 1986 ; Argos, 1987 ; Risler et al., 1988) montraient qu'il n'existe pas de matrice idéale.

100 PAM120 vs BLOSUM 35 2 protéines LALIGN global. PAM120 BLOSUM35

101 ALIGNEMENT de SEQUENCE DEFINITION ALIGNEMENT RECHERCHE DE SIMILARITES MULTIPLE

102 Prédiction de fonctions par ressemblance RESSEMBLANCE HOMOLOGIE FONCTION CONSERVEE Concept de fonction est flou : Activité biochimique identique? Distribution tissulaire identique? Compartimentation identique?

103 Remarque : L homologie de séquence traduit la parenté -> On est homologue ou on ne l'est pas -> On ne dit pas: "très homologue", "faible homologie", etc Dans ces cas là, on parle de similitude ("très similaires", etc.).

104 Identifier les similarités Par alignement de séquences 2 à 2 : A l aide des algorithmes Needleman-Wunsch Smith Waterman Et des outils BLAST FASTA

105 BLAST et FASTA sont des heuristiques BLAST : Basic Local Alignment Search Tool (Lipman, Karlin, Altschul, 1990) FASTA : FAST-ALL (David J. Lipman and William R. Pearson in 1985) Programmes d'alignement local de séquences basé sur une heuristique. Une heuristique est un algorithme qui fournit rapidement une solution qui n est pas nécessairement optimale. Une heuristique et donc une méthode approximative, qui s oppose aux algorithmes exacts (trop lents ou trop gourmands). Uniprot 02/2013= 29,769,971 protéines (9,585,856,378 aa) Si chaque comparaison prend 0,01 seconde, une requête (tt les comparaisons 2 à 2) prendrait 82 heures (plus de 3 jours)

106 FASTA La programmation dynamique calcule des scores sur des espaces inutiles pour la recherche du score optimal FASTA se concentre sur la diagonale

107 FASTA La programmation dynamique calcule des scores sur des espaces inutiles pour la recherche du score optimal FASTA se concentre sur la diagonale

108 FASTA L'algorithme du programme FASTA peut se résumer en quelques étapes: Etape 1 : Recherche dans un «dot plot» des hot spot qui sont des appariements parfaits (identiques) de mots de longueurs k.

109 FASTA Etape 2 : Score chaque hot spot (gap penalty et matrice) et garde les 10 meilleurs diagonales

110 FASTA Etape 2 : Score chaque hot spot (matrice) et garde les 10 meilleurs diagonales Etape 3 : Combine ces segments (sous-alignement) en un alignement unique avec gaps (gap penalty) et recherche le meilleur alignement (meilleur score)

111 FASTA sur le web Choix du programme

112 Choix du programme FASTA SEQUENCE BANQUE Protéique FASTA Protéique T T Nucléique FASTA Nucléique TFASTX ne tolère pas les décalages de phases (frameshif) TFASTY tolère pas les décalages de phases

113 Autres programmes Choix du programme SSEARCH : GGSEARCH: Utilisation de l algorithme de Smith-Waterman Utilisation de l algorithme de Needleman-Wunsch GLSEARCH : Alignements global dans la query et local dans la database

114 Parametres de FASTA Paramètres cachés

115 Paramètres de FASTA Paramètres cachés

116 Paramètres de FASTA Paramètres cachés VTML ou VT décrites par Muller et al. (2002). Maximum de vraisemblance ou maximum like- lihood approach. VTML est adéquat pour les petites jeux de données MDM sont les matrices PAM réactualisés par Jones et al. (Jones et al., 1992). Parfois appelées matrices JTT Clic on matrix

117 Matrices de FASTA?? Comparons : PAM120 et VTML120 (sinon défaut)

118 Matrices de FASTA Comparons PAM120 et VTML120 1 séquence protéique de 234 aa / Banque par défaut (uniprotkb) PAM120 Durée du travail : 1min 44

119 Matrices de FASTA Comparons PAM120 et VTML120 1 séquence protéique de 234 aa / Banque par défaut (uniprotkb) VTML120 Durée du travail : 3 min 30

120 Autres paramètres FASTA GOP GEP E-value KTUP

121 Remarque sur la longueur du k-tuple Sensibilité (Sensitivity): Aptitude à détecter toutes les similarités «significatives» (minimiser les faux négatifs) Sélectivité (Selectivity): Aptitude à ne sélectionner que des similarités «significatives» (minimiser les faux positifs) K-tuple est grand Sélective faible' Sensibilité forte Je risque de recruter des mauvais candidats Sélective forte' Sensibilité faible Je risque de perdre des bons candidats K-tuple est petit

122 Les sorties de FASTA

123 FASTA (Submission details)

124 FASTA (Submission details)

125 FASTA (Tool output)

126 FASTA (Tool output)

127 FASTA (Visual output)

128 FASTA (Functional predictions) Base de données de domaines protéiques

129 BLAST L'algorithme du programme BLAST peut se résumer en quelques étapes: Etape 1 : La séquence est filtrée par défaut (optionnel) afin d'enlever les régions de faible complexité. Ex : AAAAAAA Etape 2: Une liste contenant tous les mots de k lettres de cette séquence est construite (hachage) ATGCTGCCTGATCGCTTTATCTGCGCGTGCTGAACTGGGCCTA k

130 Remarque sur la longueur du mot k Sensibilité (Sensitivity): Aptitude à détecter toutes les similarités «significatives» (minimiser les faux négatifs) Sélectivité (Selectivity): Aptitude à ne sélectionner que des similarités «significatives» (minimiser les faux positifs) k est grand Sélective faible' Sensibilité forte Je risque de recruter des mauvais candidats Sélective forte' Sensibilité faible Je risque de perdre des bons candidats k est petit

131 Algorithme du programme BLAST Chacun de ces mots est alors comparé à tous les mots de longueur k des bases de données en utilisant la matrice de substitution choisie (les bases de données contiennent des séquences indexées) ATGCTGCCTGATCGCTTTATCTGCGCGTGCTGAACTGGGCCTA TGGGCC Seq 98 Seq 22.. GCTGCC Seq 58 Seq 556 GATCGC Seq 96 Seq 22.. TTTCTC Seq 243 Seq TTTATT Seq 2 Seq 5686 ATGCTG Seq 56 Seq 22

132 Double critère Sélection des séquences qui partagent au moins 2 hits ATGCTGCCTGATCGCTTTATCTGCGCGTGCTGAACTGGGCCTA TGGGCC Seq 98 Seq 22.. GCTGCC Seq 58 Seq 556 GATCGC Seq 96 Seq 22.. TTTCTC Seq 243 Seq TTTATT Seq 2 Seq 5686 ATGCTG Seq 56 Seq 22

133 HSP : High Scoring Pairs Ces hits ou segments similaires sont appelés High Scoring Pair (HSP). ATGCTGCCTGATCGCTTTATCTGCGCGTGCTGAACTGGGCCTA HSP1 HSP2 HSP3 ATGCTGCTTTCCCCCCTGATCGCTGAGCTGGGCC

134 Elongation des HSP Chacun des HSP à un score initial (> seuil) Ces HSP sont prolongés des deux sens afin d'obtenir des alignements plus longs ayant des scores maximaux supérieurs au seuil fixé Cette procédure d'élongation s'arrête lorsque l'alignement génère un score inférieur au seuil (non significatif) ou lorsque 2 HSP se rejoignent ATGCTGCCTGATCGCTTTATCTGCGCGTGCTGAACTGGGCCTA ATGCTGCTTTCCCCCCTGATCGCTGAGCTGGGCC

135 BLAST sur le web Choix du programme

136 Choix du programme SEQUENCE BANQUE Protéique BLASTP Protéique T T Nucléique T BLASTN TBLASTX T Nucléique

137 Les 6 phases de lecture Un brin d ADN peux donc être divisé en 3 chaines de triplets appelés «phases de lecture» ou «reading frames»

138 Les 6 phases de lecture Un brin d ADN peux donc être divisé en 3 chaines de triplets appelés «phases de lecture» ou «reading frames» L ADN est bicaténaire, les deux brins sont codants, ce qui donne non pas 3 mais 6 phases de lecture

139 Nombre de comparaisons : Prog. Input Database 1 Blastn ADN ADN 1 Blastp Prot. Prot. 6 Blastx ADN Prot. 6 tblastn Prot. ADN 36 tblastx ADN ADN

140 BLAST Input Choix d une région de la séquence Base de comparaison

141 BLAST Limitation à un taxid, organisme Exclusion séquences modèles NCBI et échantillons environnementaux

142 BLAST Les paramètres Expect Taille mot (word size) Matrice Pénalité GO,GE Filtre

143 L expect value de BLAST E-value (Expect) = Nombre d'alignements attendus par hasard ayant un score supérieur au seuil dans la banque de données de taille équivalente Plus la valeur de la e-value est faible, plus l'alignement est fiable E-value de 4 e-4 : il me faudra blaster 2500 séquences au hasard pour obtenir une séquence avec un score > seuil E-value de 1 e-70 : il me faudra blaster 1 e70 séquences au hasard pour obtenir une séquence avec un score > seuil

144 L expect value E-value (Expect) = Nombre d'alignements attendus par hasard ayant un score supérieur au seuil dans la banque de données de taille équivalente Plus la valeur de la e-value est faible, plus l'alignement est fiable E-value de 4 e-4 : il me faudra comparer 2500 séquences au hasard pour obtenir une séquence avec un score > seuil E-value de 1 e-70 : il me faudra comparer 1 e70 séquences au hasard pour obtenir une séquence avec un score > seuil Attention cependant : cette probabilité de ne pas être «au hasard» dépend de la taille de la banque de données utilisée!

145 E-value et espace de requête E-value statistique de Karlin et Altschul m est le nombre de lettres de la séquence requête n est le nombre de lettre dans la base de données S est le score seuil (bit score) R est le score brut (raw score) m*n est l espace de recherche Relation linéaire avec la taille de l espace de recherche: si la taille de la banque double, la e-value double aussi. Relation exponentielle avec le score: de petits changements de score peuvent entrainer d important changement de la e-value.

146 L expect value de BLAST K et lambda sont des paramètres statistiques propres à l algorithme

147 Les scores de BLAST Le score final de l alignement dépend de la matrice utilisée ainsi que des pénalités de gap. Pour comparer 2 alignements obtenus à partir de paramètres différents, on va devoir «normaliser» les scores Cette normalisation s effectue à partir de facteurs pré-calculés par Blast et est exprimé en bit (unité standard d information, un bit étant une quantité d information nécessaire pour distinguer 2 possibilités) Ce score permet de faire varier les paramètres matrice-gap penalty, de comparer les alignements et de dire lequel est le meilleur

148 Exemple usage «bit score» BLOSUM 80 (10,1) BLOSUM 45 (15,2)

149 La sortie de BLAST (output) input Base de données programme

150 «Search Summary» Taille mot w = 3 E value seuil Pénalité Gap Matrice Score seuil = 11 Taille de la base de données Prendre l habitude de sauvegarder le summary

151 La sortie «Taxonomy» BLAST présente les séquences trouvées en fonction de leur appartenance taxonomique. Les valeurs représentent (de gauche à droite) : Le meilleur score pour chaque espèce, le nombre hits par espèce et la description du meilleur hit

152 La sortie «Taxonomy» Les résultats sont ensuite détaillés organisme par organisme Tous les hits du même organisme apparaissent ensemble, rangés par score Les organismes étant rangées en fonction du score également

153 La sortie «Taxonomy» BLAST présente les séquences trouvées en fonction de leur appartenance taxonomique. Les valeurs représentent (de gauche à droite) : Le meilleur score pour chaque espèce, le nombre hits par espèce et la description du meilleur hit

154 La sortie «Tree» Arbre des séquences regroupées en fonction de leurs distances (Arbre des distance) Cet affichage peut permettre de reconnaître la présence de séquences aberrantes ou inhabituels ou d observer graphiquement les membres d'une famille de gènes homologues provenant d'autres espèces.

155 La sortie «Graphique» Domaines Sortie graphique Chaque ligne représente un hit La couleur représente le bit score Si on passe la souris sur la ligne, on voit la description. Si on clic, on obtient l alignement concerné

156 La sortie «Table» Max score: Score meilleur HSP Total score : Somme des scores des HSP Query coverage : % query dans l alignement

157 BLAST ou FASTA FASTA (Pearson 1995) BLAST (Altschul 1990, 1997) Utilise une heuristique pour éviter le calcul complet de la matrice de programmation dynamique Utilise une heuristique de recherche de mots permettant d exclure rapidement la plupart des entrées de base de données Rapide 1X plus rapide que Smith-Waterman Extrêmement rapide 1X plus rapide que FASTA 2X plus rapide que Smith-Waterman Statistique meilleur que celle BLAST Presque aussi sensible que FASTA

158 BLAST ou FASTA uniprotkb/swissprot / PAM250 / GOP -14 / GEP -2 FASTA : 7 secondes BLAST : 5 secondes

159 BLAST ou FASTA uniprotkb/swissprot / PAM250 / GOP -14 / GEP -2 FASTA : 7 secondes BLAST : 5 secondes

160 Interprétons des alignements Jouons avec FASTA et Blast Les questions : Quel programme utilisé? Quelle base de données? Quels paramètres? Comment interpréter les résultats?

161 Cas n 1 Fragment d ADN anonyme : Quel programme utilisé? Si on utilise BLAST en premier

162 Cas n 1 Fragment d ADN anonyme : Quel programme Blast utilisé? Protéique T Nucléique T BLASTN TBLASTX T Nucléique

163 Cas n 1 : Les questions : Quel programme Blast utilisé? > BlastN puis BlastX et en dernier recours tblastx Quelle base de données? Mon ADN provient d une bactérie : Banque nr bacteria (Taxid ) Quels paramètres? Je ne sais rien : je commence par les parametres par defaut

164 Cas n 1 : BlastN Il existe des séquence hautement similaires 2 régions avec 2 niveaux de conservation Il existe un grand gap dans certaines régions similaires (grande ligne continue entre 2 régions) Il existe une rupture dans la zone «rose» (trait vertical) Regardons de plus près

165 Cas n 1 : BlastN : la partie «rose»

166 Cas n 1 : BlastN : résultat 1

167 Cas n 1 : BlastN la partie «rouge»

168 Cas n 1 : BlastN la partie «rouge»

169 Cas n 1 : BlastN la partie «rouge» A la sortie du BlastN Je sais qu il y a sur ma séquence, une région répétée dans d autres génomes mais je ne connais pas sa fonction Je sais que je dois avoir une gène ou un pseudogène codant une protéine impliqué dans le transport mais je n ai ni ces bornes, ni son brin -> BlastX

170 Cas n 1 : BlastX Domaine Cassure

171 Cas n 1 : BlastX Description variée pour même score

172 Cas n 1 : BlastX Similarité avec protéine bien conservée (rouge) Zone de rupture (trait vertical) semble indiqué que sur mon fragment, il s agirait d un pseudogene -> vérification dans l alignement

173 Cas n 1 : BlastX

174 Cas n 1 : BlastX A la sortie du BlastX Je sais que ma séquence contient un pseudogène, par frameshift, d un gène codant un transporteur Je ne sais toujours l identité de ma région répétée mais à priori, il ne s agit pas d une région codant Je peux donc la comparer avec des régions non codantes = RFAM (banques de petits ARN) ou tester s il s agit d un trna par exemple (trna val)

175 BlastX (autre cas de pseudogene) Stop in frame - phase ouverte interrompue par stop

176 Cas n 1 Fragment d ADN anonyme : Et si j utilise FASTA Quel programme utilisé?

177 Cas n 1 Fragment d ADN anonyme : Quel programme Blast utilisé? Protéique T Nucléique FASTA Nucléique

178 Cas n 1 : Les questions : Quel programme Blast utilisé? > FASTA (onglet nucléotide) puis FASTX Quelle base de données? Mon ADN provient d une bactérie : EMBL prokaryotes Quels paramètres? Je ne sais rien : je commence par les paramètres par défaut

179 Cas n 1 : FASTA

180 Cas n 1 : FASTA

181 Cas n 1 : FASTX

182 Cas n 2 Séquence protéique >Seqinconnue MNTYVTGSTIRQLREAKGLTQAELAGTLSVSAKTIS WETAKGLPDISLLEPLAAALGVSVLELMQGEPIINRN AANLLRSKLYVCPLCGNVLHATGQAVVSCCGITLPA DIAEAEDADEHHQLTVERVEDELFVTLHHPMEKNH SFLAYLTGDKLQLVKLYPEGDASARFSLRGAGVLYF CNCHGLMKAPDFRTATRRTSPQKIHLREPDEGDRE VMAYREEFLAINSRMDGTSALDKYADFDAWLAQ Test de BlastP vs FASTA Test de FASTA (protéique), de TFASTX et TFASTY

183 Cas n 2 : BlastP (banque nr) Seqinconnue apparaît comme une protéine fusionnant 2 domaines 1-80 : Un domaine N-terminal de type HTH_XRE (régulation) : Un domaine C-terminal de dfx_rob (desulforedoxin, detoxication)

184 Cas n 2 : BlastP (banque nr) Cette fusion n apparaissent pas sur cette représentation, hormis l information de séquences homologues plus courte en C-term

185 Cas n 2 : BlastP (banque nr) Reformat

186 Cas n 2 : BlastP (banque nr)

187 Cas n 2 : BlastP (banque nr) Seqinconnue

188 Cas n 2 : FASTA (sur Uniprot Knowledgebase) Sur la représentation graphique FASTA, je ne vois que HTH

189 Cas n 2 : FASTA (sur Uniprot Knowledgebase) Sur la représentation «funtionnel», je ne vois 3 informations

190 Cas n 2 : FASTA (sur Uniprot Knowledgebase) Si je décoche GENE3D, j obtiens non pas 2 mais 3 domaines

191 Dérivés de BLAST et de FASTA DEFINITION ALIGNEMENT MULTIPLE

192 Dérivés de BLAST et de FASTA PSI-blast (NCBI) et PSI-search (EBI, PSI-fasta) PHI-Blast DELTA-Blast

193 PSI-BLAST (PSI-search) PSI-BLAST (Position-Specific Iterative) est un programme basé sur BLAST et qui donne la possibilité de relancer les comparaisons de séquences de façon itérative. Avec PSI-BLAST la séquence query est d abord comparé aux banques de données à l aide d un BLAST normal. Cette itération produit une matrice de distance (PSSM) qui sert ensuite aux autres itérations. A chaque nouvelle itération, un nouveau profil PSSM est construit et la recherche est réitérée avec ce profil comme requête, sur la banque choisie initialement. PSI-BLAST est très utile pour : Identifier les membres éloignés d une même famille Créer des PSSM

194 Les PSSM en bref PSSM pour "position-specific scoring matrix», équivalent à "position-dependent weight matrix". Position ou colonne Lettre possible Probabilité

195 PSI-BLAST Séquence QUERY Blast «régulier» PSSM Séquences similaires

196 PSI-BLAST Séquence QUERY PSSM Blast «régulier» PSSM PSSM2 Séquences similaires Séquences Avec profils

197 A la découverte de PSI-Blast

198 PSI-Blast - results

199 PSI-Blast - results Etc Les itérations s'arrêtent lorsqu'il y a convergence, c'est à dire lorsque les séquences résultats de l'itération n sont identiques à celles de l'itération n-1.

200 PSI-BLAST Avantages: PSI-BLAST permet de trouver des séquences qui sont proches de la séquence query, et apprend comment élargir ce cercle de séquences proches. Inconvénients: Si l on «attrape» un faux positif, on attrapera tous les séquences qui lui sont proches -> phénomène de contamination qui risque d être de pire en pire à chaque itération.

201 PSI-BLAST et valeur seuil

202 PHI-BLAST PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated) est un programme basé sur BLAST2.0 qui permet de spécifier soi-même un motif qui sert de critère de présélection pour la comparaison de séquences Avantage : PHI-BLAST est plus rapide que BLAST, puisque le motif donné est nécessairement moins complexe que le modèle construit par l'heuristique. Inconvénient : il faut connaître un motif caractéristique de la séquence requête. Notons que cette méthode n'est pas nécessairement «meilleure» par rapport à la méthode blast classique ; elle est simplement différente.

203 Jouons avec PHI-BLAST Pattern au format PROSITE : Séquences requêtes : ZP_ Attention : le motif doit exister dans la requête.

204 Jouons avec PHI-BLAST

205 DELTA-BLAST DELTA-BLAST (Domain enhanced lookup time accelerated BLAST) est un programme qui recherche une base de données de PSSMs pré-construites avant de chercher dans la base de données de séquence protéique, pour obtenir une meilleure détection d'homologie. Pour ses PSSMs, DELTA-BLAST utilise un sous-ensemble de base de données de domaine conservé de NCBI (CDD).

206 DELTA-BLAST DELTA-BLAST (Domain enhanced lookup time accelerated BLAST) est un programme qui recherche une base de données de PSSMs pré-construites avant de chercher dans la base de données de séquence protéique, pour obtenir une meilleure détection d'homologie. Pour ses PSSMs, DELTA-BLAST utilise un sous-ensemble de base de données de domaine conservé de NCBI (CDD).

207 DELTA-BLAST vs PSI-BLAST

208 DELTA-BLAST vs PSI-BLAST 2eme meilleur hit

209 Remarque sur recherche d homologie Si possible, comparer des séquences en aa (même traduite) que des séquences en acides nucléiques Observer tous les résultats (graphiques, alignements ) Gardez à l'esprit que les séquences des banques contiennent des erreurs et/ou des imprécisions Gardez en tête les limites : Gènes inconnus : cas des gènes «orphelins Maturation post-traductionnelle

210 ALIGNEMENTS MULTIPLES DEFINITION ALIGNEMENT MULTIPLE

211 Problèmatique Pour un alignement de plus de trois séquences, chaque site est : - soit homologue (supposé présent chez un ancêtre commun) - soit délété, soit inséré, soit muté (substitution non homologue). Au delà de deux séquences, le problème d alignement devient complexe car l espace des alignements possibles explose. Le critère d évaluation est souvent une fonction de score.

212 Deux approches = deux objectifs L alignement de séquences 2 à 2 permet une détection de similarité syntaxique qui traduit éventuellement une fonction commune L alignement multiple concerne une famille de séquences supposées ayant une fonction commune et pour laquelle on recherche une éventuelle conservation syntaxique. 2 à 2 multiple Similarité syntaxique Fonction commune Fonction commune? Similarité syntaxique?

213 Alignements multiples - Permet l assemblage de génomes ou la construction de carte de contigs et de «scaffolds». Contigs Scaffolds - Permet la génomique comparative par alignement de génomes complets ou partiels.

214 Alignements multiples - Identifier des régions ou des sous-régions conservés et variables - Inférer un arbre phylogénétique à partir des sites conservés

215 Alignements multiples - Trouver des structures conservées

216 Méthodes - Comme pour l alignement 2 à 2, il s agit de «jouer au mieux» avec les matchs, les gaps et les mismatches - «Faire au mieux» consiste à scorer les colonnes puis l alignement n seq Alignement de n seq Score de l alignement Les algorithmes d alignements cherchent à maximiser le score, ce qui indique que l alignement est optimal

217 «Scorer les colonnes avec la méthode SP» La méthode la plus utilisée est le score «somme des paires» (SP Sum-of-pairs Carrillo, Lipman, 1988) Cette méthode consiste à sommer chaque colonne, à l aide d une matrice de substitution, en prenant en compte les «gap penalty» En faisant la moyenne par paire, ou la somme de l ensemble des colonnes, on obtient le score de l alignement. -La prise en compte des gaps est un point critique du calcul de score et dépend de chaque algorithme.

218 Sum of pair Séquence Colonne A Colonne B Colonne C A A A A A A A A A A A G A C C A A A le score SP A A A A A C A A A G A G Matches Mismatches Score col = =6 MATCH score = 6 MISMATCH score = -3

219 «Scorer les colonnes avec la méthode TA» Le score TA -> tree alignment - Les séquences sont liées par une histoire évolutive donc on peux les représenter suivant un arbre. - Le score est la somme des scores des couples liés par une branche de l arbre A A A A C SP score = 24 TA Score = 15 SP score = 6 A A A G C TA Score = 6 MATCH score = 6 MISMATCH score = -3

220 «Scorer les colonnes avec la méthode SA» - Le score SA (star tree) - Les séquences sont supposées liées par une séquence commune de référence (ancêtre, motif, consensus ) - Le score est la somme des scores entre les résidus et la référence consensus A MATCH score = 6 MISMATCH score = A A 6 6 A 6 6 A -3 C A SP score = 24 TA Score = 15 SA Score = 21

221 Méthodes - 4 grands principes: 1- Programmation Dynamique 2-Segmentation: 3-Progressive : 4-Iterative:

222 L alignement progressif - L alignement progressif - Approche heuristique définie par Feng et Doolittle en 1987 pour aligner progressivement plusieurs paires ou groupes de séquences. - Les problèmes sont : Par quelle(s) séquences commencer? Comment décider de l ordre d alignement? Comment mesurer la similarité entre groupes de séquences? - Cette approche ne garantit pas l alignement optimal et est sensible à l'ordre des séquences

223 Méthodes - Alignement progressif - Par quelle(s) séquences commencer? - On aligne d abord les séquences les plus proches en pratiquant un alignement 2 à 2. - La méthode d alignement pouvant être locale ou globale, par programmation dynamique ou heuristique Hbb_human 3 LTPEEKSAVTALWGKV..NVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLST.... :.. :. :. : Hba_human 2 LSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHF.DLS.... Hbb_human 1 VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLST..... : : Hbb_horse 1 VQLSGEEKAAVLALWDKVNEEEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFDSFGDLSN... Hba_human 2 LSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHF.DLSH... : :. :. :. Hbb_horse 3 LSGEEKAAVLALWDKVNEE..EVGGEALGRLLVVYPWTQRFFDSFGDLSN... etc 7 globines Exemple avec globines

224 Alignement progressif SeqA: GAAGTT! SeqB: GACTT! SeqC: GTACTG! seqd: GAACTG! GAAGTT! GA-CTT! GAACTG! GtACTG! GAAGTT! GA-CTT! GAACTG! GtACTG! Au lieu de GAAGTT! G-ACTT! GAACTG! GtACTG!

225 Alignement progressif - Problème Les alignements intermédiaires «figés» : once a mismatch, always a mismatch, once a gap always a gap SeqA: GAAGTT! SeqB: GACTT! SeqC: GTACTG! seqd: GAACTG! GAAGTT! GA-CTT! GAACTG! GtACTG! GAAGTT! GA-CTT! GAACTG! GtACTG! Au lieu de GAAGTT! G-ACTT! GAACTG! GtACTG!

226 Alignement iteratif - Le rafinement itératif : Obtenir un premier alignement multiple même de «mauvaise qualité» Améliorer cet alignement par une suite d itérations jusqu à ce que l alignement ne puisse plus être amélioré L itération peux faire appel à des mé thodes déterministes (selon des modèles) ou stochastiques (au hasard)

227 Alignement iteratif - Le rafinement itératif : - certaines séquences peuvent être ôtées puis réalignées pour améliorer le score Alignement non optimal

228 Les principaux algorithmes de MSA Alignement Progressive ClustalW / Clustal Omega MAFFT Kalign Probalign ProbCons (probabilistique) MSAProbs (probabilistique)

229 CLUSTAL Comparaison de séquences protéines et nucléiques Fonctionne sous de nombreuses systèmes d exploitation Le premier programme Clustal date de 1988 (Des Higgins) -> ClustalV (1992) -> ClustalW (Thompson et al, 1994) -> ClustalX (Thompson et al, 1997) -> Clustal W-X version 2 (Larkin et al, 2007) - W : Ligne de commande terminal - X : Interface graphique (GUI)

230 CLUSTAL Clustal en Webtool Nombreux miroirs :

231 CLUSTAL Remarque sur les miroirs : tous n offrent pas les mêmes paramètres et tous ne sont pas mis à jour EMBnet Expasy

232 CLUSTAL Alignement par paires Calcul des distances Arbre Guide (dendrogramme) Alignement Progressif (profils) Cette étape consomme environ 96 % du temps de calcul de Clustal Alignement progressif selon l arbre. Cet alignement est «fixé» et ne changera pas «one gap, always gap»

233 CLUSTAL Format d entrée >PYCDA07TF input_file_1 ATGCCCATACTACTCTTCTGGTAGTTGGAATGAAGCCCAAAATATGATAAAACCTTTTCT TACTAAAGTTTGTCAGGAAGTAGAAAGAATTGCTCATTGTGGAAAATGGGAAGAATGGAG TGAATGTTCTACTACTTGT >PYCDA08TR input_file_2 TATAGAAATAAAACTCCATTAAAAAATATTTTCCTTTTTCCTAATTATTTCTCTAAAATA TAACAATCTAATTCATATAATATCATTACAATCACATATATATCTCTTTAAATTTTGTTC CCTTTTTCCCTACGAGTTGTATCAGCAATAATCTCCTACAAGGTTAGACGTTGCTTCAAG TTATTTTCAACAAATTTGGTCATTTTCAGCAAATTTTGCCATTTTCAGCAAATTTTGCCA TTTTCAACAAATTTTGCCATTTTCAACAGATTTTGCCATTTTCAACAGATTTTGCCATTT TCAGCAAATTTTGCCATATTCAACAAATTTTGCCATTTTCAGCAAATTTTACCATTTTTA GCAAATTAGTATACCGTGTTAT >PYCDA09TRB input_file_3 GCGGGAATATAGAAATAAAACTCCATTAAAAAATATAAACCTTTTTTTTAATTATCACCC TAAAACATAACAATCTAATTCATATAATATCATTACAATCACATATATATCTCTTTAAAT AATGATCCCTTTTTCCCTACGAGTTGTATCAGCAATAATCTCCTACAACGGATAGACGTT GCTTCAAGTTCTTTTCAACAAATTGGGTCATTTTCAGCGAATTTTGCCATTTTCAGCAAA TTTGGCCATACTCAACAAATTTTGCCATTGGCAACAGATTTTGCCATTTTCAACAGATTT TGCCGTTGTCAGCAAATTTTGCCATATTCAACAAATTTTGCCAATCTCAGCAAATTTTAC CATTTTCAGCAAATTAGCATACCGTTTTATCATTATCGCCTTCACTAATG Fichiers avec des séquences au format FASTA : Ligne de titre précédée d un chevron > (max 200 caractères) puis Saut de ligne puis séquence