Support d échange ionique HyperCel STAR AX

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1 Life Sciences USD 2831(2) Support d échange ionique Support de chromatographie d échange d anions «tolérant aux conditions salines» Support de chromatographie d échange d anions utilisable à l échelle industrielle, conçu pour la capture à haute productivité de protéines et pour l élimination d impuretés en conductivité élevée ou modérée (2 à 1 ms/cm), typique des cultures biologiques non diluées (p. ex. surnageants de cultures de cellules de mammifères, culture de E. coli, plasma, autres ). Filtration. Separation. Solution.SM

2 Produit à l échelle industrielle par Pall, le support répond aux besoins des utilisateurs en production et des organismes de réglementation. Un dossier d assistance réglementaire (RSF) est disponible pour aider les utilisateurs à développer des procédures de validation. Ce support offre les avantages suivants : Haute capacité dynamique (DBC) pour temps de résidence courts (1-2 minutes) Capture directe de protéines ou élimination d impuretés à partir de liquides biologiques non dilués ou dilués (conductivité élevée ou moyenne) Excellentes propriétés de débit, permettant un traitement rapide de grands volumes de liquides biologiques Sélectivité différenciée, constante sur une large plage de conductivité (2-1 ms/cm) Économie de procédé améliorée Le support est constitué d une matrice en cellulose rigide aux excellentes propriétés de débit et générant une faible contre-pression, compatible avec les besoins d une production de protéines à l échelle industrielle. Le support est disponible en divers conditionnements, tels que les plaques 96 puits AcroPrep ScreenExpert conçues pour la sélection rapide de supports de chromatographie pour la purification des protéines, ainsi qu en colonnes préremplies PRC de 1 et ml conçues pour l optimisation ou le criblage rapide ou encore la purification de petites quantités de protéines. est aussi fourni sous forme de suspension dans 1 M de NaCl contenant % (v/v) d éthanol ou sous forme de «pâte essorée» pour des productions à large échelle (cette dernière facilite le transfert du support en évitant la manipulation de grands volumes de produit). Le support a une stabilité chimique qui garantit un nettoyage en place (CIP) et un stockage simples. Pour un CIP standard, un traitement avec,-1 M de NaOH est recommandé ; un stockage à long terme dans - mm de NaOH est possible. Tableau 1 Propriétés principales Taille moyenne des particules Nature du ligand échangeur d ions Capacité dynamique 1 Plage de conductivité recommandée Conditions de nettoyage recommandées 2 8 μm Amine primaire > mg BSA/mL pour un ph entre 7, et 8, et une conductivité de 1 ms/cm 2-1 ms/cm 1 M de NaOH 1. Déterminée avec mg/ml BSA dans 2 mm Tris-HCl,,1 M NaCl pour un temps de résidence de 2 minutes. 2. Injection de volumes de colonne (CV) de,-1 M NaOH, 1 heure de contact. Le support est très facile à packer et dépacker en colonnes à l échelle laboratoire, pilote et production. Il fait preuve d excellentes propriétés de débit compatibles avec les exigences des procédés de production industriels. Le support peut être conditionné dans des tampons standard peu coûteux. Par exemple, une colonne de mm de diamètre intérieur et de 1 mm de hauteur conditionnée dans un tampon de mm de NaCl peut être utilisée à moins de 1, bar (22 psi) de contre-pression (Figure 1). La performance de package est constante qu il s agisse de colonnes à l échelle laboratoire ou à grande échelle (diamètre intérieur de mm). Les valeurs typiques de N/m sont > plateaux et les facteurs d asymétrie (AF) sont dans la plage 1, < AF < 1,. Figure 1 Pression en fonction du débit du support Pression (bar) Vitesse linéaire (cm/h) Colonne : D.I. mm, hauteur de lit 1 mm. Tampon de package : mm NaCl Caractéristiques et avantages Une capacité dynamique élevée dans une large plage de conductivité évite la dilution ou l UF/DF du liquide biologique, simplifiant le procédé en aval Figure 2 Capacité dynamique en fonction du temps de résidence, par rapport au ph et à la conductivité Conductivité Temps de séjour = 1 min Temps de séjour = 2, min Temps de séjour = min ph ph ph Colonne : D.I., cm, hauteur de lit cm (~1 ml). Échantillon : mg/ ml BSA en tampon d équilibration. Tampon d équilibration : 2 mm Tris-HCl, ph 7,-8,. Conductivité : 3- ms/cm. Temps de résidence 1- min (,2-1 ml/min). Les valeurs indiquent la capacité en BSA en mg/ml de support

3 Un plan d expériences (DoE) a été effectué dans le but d explorer l influence de divers ph (entre 7, et 8,), conductivités (entre 3 et ms/cm) et temps de résidence (entre 1 et minutes) sur la capacité dynamique de l albumine bovine (BSA) utilisée en tant que modèle. Les données montrent l impact du ph et de la conductivité sur la DBC du support pour la BSA. Les tracés de contour à la Figure 2 indiquent que le support a une DBC élevée (> mg/ml) sur une large plage de ph et de conductivité pour un temps de résidence court, ce qui permet une flexibilité et une productivité optimales. Figure 3 Capacité dynamique du support pour la sérum-albumine humaine (HSA) issue de plasma non dilué et dilué HSAmg/mL ercel AX 7 ms/cm 11 ms/cm DEAErigid agarose agarose rigide La Figure 3 indique la DBC du support pour la HSA en comparaison à celle d un support échangeur d anions classique (DEAE agarose rigide), pour des conductivités correspondant à un plasma non dilué (11 ms/cm) et dilué (7 ms/cm). Les données indiquées à la Figure 3 confirment que dans le cas du support la DBC est moins affectée par la conductivité (entre 7-11 ms/cm) qu elle ne l est sur un support classique. Ceci indique qu il est possible de charger le plasma non dilué directement sur le support. Grâce aux excellentes propriétés de débit à faible contre-pression (Figure 1), de larges volumes de culture peuvent être traités directement et rapidement, augmentant ainsi la productivité globale du procédé et limitant le risque de dégradation des protéines. La haute capacité dynamique facilite l utilisation de colonnes à volume et encombrement modérés, ce qui permet une réduction des volumes de tampon nécessaires, conduisant à des économies en matière d équipements et de consommables. Excellente sélectivité et efficacité de séparation sur une large plage de conductivité Figure Séparation d un mélange de protéines sur un support STAR AX à ms/cm. mua 8 6 Cytochrome C Transferrine Albumine 3 6 ml Gradient de conductivité Colonne préremplie PRC de 1 ml ; µl de mélange (2 mg/ml de cytochrome C, mg/ml de transferrine humaine, mg/ml d albumine bovine [BSA]). Charge : 2 mm Tris-HCl ph 8,, ms/cm. Éluant : gradient - % 2 mm Tris-HCl, ph 8, + 1 M NaCl. La sélectivité du support est un paramètre clé pour distinguer la protéine cible des contaminants. Le criblage (screening) de différents supports chromatographiques est fortement recommandé aux stades précoces du développement d un procédé. Une analyse rapide et l optimisation des conditions peuvent être faites en utilisant une colonne préremplie PRC de 1 ml. Une fois le ligand sélectionné, les conditions d utilisation peuvent être optimisées dans une colonne PRC de ml en doublant la hauteur. Deux colonnes de ml peuvent être raccordées en série pour atteindre une hauteur du lit de colonne de cm et se rapprocher ainsi des conditions réelles à l échelle pilote ou dans des applications à échelle réduite. Les colonnes de 1 ml peuvent aussi être raccordées en série. Les exemples montrés à la Figure, indiquent que la sélectivité et l efficacité de séparation du support sont maintenues sur une large plage de conductivité. Applications et exemples Les applications incluent la capture directe de la cible ou l élimination d impuretés de protéines recombinantes, d anticorps monoclonaux et polyclonaux, de dérivés de plasma ou d autres liquides bioolgiques. Grâce à sa capacité à capturer directement des protéines dans des surnageants de culture non dilués, le support peut aussi être utilisé pour l élimination précoce de contaminants (p. ex. protéines de cellules hôtes CHO), avant la purification de la cible, p. ex. avant la capture d un anticorps monoclonal par chromatographie d affinité sur protéine A. 3

4 . (%) urs antes 3, 2, Application 1. Capture directe de l albumine à partir de plasma non dilué L objectif est d évaluer le support comme première étape dans une séquence de purification en deux étapes de la sérum-albumine humaine (HSA) à partir de plasma non dilué (conductivité 11 ms/cm). Le support a été utilisé comme première étape de capture, suivie d un échange de cations orthogonal réalisé sur un support S, sans ajustement de ph ou de conductivité. Le plasma pur non dilué (ph 7,6, 11 ms/cm) a été chargé, avec une DBC de 3 mg/ml (se reporter à la Figure 3). Le plan d expériences (DoE) dans des plaques 96 puits (plaques AcroPrep Advance, Pall) a été réalisé pour déterminer les conditions optimales permettant d atteindre le meilleur rapport rendement/pureté (voir un exemple de l optimisation des conditions de lavage/élution à la Figure ). Ces conditions ont ensuite été transposées à une chromatographie sur colonne avec des colonnes préremplies PRC Pall (Figure 6). Figure Impact des conditions de lavage (L) et d élution (E) sur la pureté en HSA et sur le rendement d élution (en pourcentage) avec un support (plan d expérience sur des plaques 96 puits) La HSA a été éluée par simple diminution de ph (,), Pureté (%) sans ajout de sel, ce qui Rendement a permis une (%) charge directe < 88 < 88 9 («orthogonale») sur une colonne 6 d échange de cations (support S ). 6 8 Conditions de 92 9 Conditions 8 9 lavage optimales d élution > optimales Cette dernière étape de polissage sur support S > 98 a permis d obtenir une fraction purifiée de HSA éluée à Valeurs un ph de 7, d une pureté Valeurs constantes > 99 % ainsi qu une capacité constantes de 6 mg/ml environ (Tableau ph L 2). 7, ph E 3, Cond. L 2, Cond. E 2, Conductivité du lavage (ms/cm) Conductivité de l élution (ms/cm) ph du lavage Conditions d élution optimales... ph de l élution 7.. Rendement (%) < > 9 Valeurs constantes ph L 7, Cond. L 2, Conductivité de l élution (ms/cm) La Figure montre que le rendement de HSA est influencé principalement par les conditions d élution (zone optimale : ph 3,-,2 et de conductivité 2-27 ms/cm) tandis que la pureté est principalement influencée par les conditions de lavage (un lavage à conductivité élevée >1 ms/cm améliore la pureté). 3. Figure 6 Transposition des conditions déterminées sur des plaques à 96 puits à une colonne préremplie PRC. de 1 ml. mua 2 1 Lavage 2, Fraction non retenue (FT) Lavage 1 ph 7,, ms/cm FT W1 W2 Élution, ph,, 2 ms/cm. Tableau. 2.. Purification ph de l élution en deux étapes de la sérum-albumine humaine dans un plasma non dilué. E Albumine IgG Transferrine Albumine ml FT W1 W2 E P P = Plasma Les conditions déterminées sur les plaques à 96 puits ont été appliquées à la chromatographie du plasma non dilué sur un support dans une colonne préremplie PRC de 1 ml. Le chromatogramme (Figure 6) et l analyse SDS-PAGE de fractions a confirmé que la plupart des contaminants ont été éliminés par un lavage à haute conductivité, menant à une fraction de HSA pure à 99 % en une seule étape, avec un rendement de 9 %. De plus, comme indiqué précédemment à la Figure 3, le support utilisé pour l étape de capture avec du plasma non dilué présentait une DBC > 3 mg/ml, soit plus de 2 fois supérieure à celle d un support classique en DEAE agarose testé dans les mêmes conditions. Capture sur support Polissage sur support S Charge Plasma non dilué Éluat à ph, du support Capacité (mg/ml) Rendement Pureté > 3 mg/ml 9 % 99 % 6 mg/ml 9% > 99%

5 Application 2. Élimination précoce de CHOP avant capture sur protéine A d un anticorps monoclonal (MAb) L objectif de cette étude était d évaluer l impact d une étape de prépurification à l aide du support, avant la capture classique sur support Protéine A d un anticorps monoclonal (MAb) provenant d uune culture de culture de cellules de mammifère (Figure 7). La teneur en CHOP (protéines de cellule hôte) contaminantes a été comparée à l aide d un test ELISA commercial pour les deux séquences de purification indiquées à la Figure 7. Figure 7 Séquences de purification de MAb classique et alternative incluant une étape de prépurification sur support CCS CHOP : 13 ppm Une telle étape de prépurification pourrait améliorer l économie du procédé, en prolongeant la durée de vie de la colonne d affinité sur Proteine A. Pour commander Support Référence ml ml ml L L L Mode negatif (FT: fraction non retenue) CHOP : 362 ppm Protéine A (mode capture/élution) CHOP : ppm Protéine A (mode capture/élution) CHOP : 3 3 ppm Colonnes préremplies PRC Colonne PRC x, 1 ml Colonne PRC 8 x, ml Référence PRCSTARAX1ML PRCSTARAXML Plaques préremplies avec le support Teneur en CHOP x (ppm) Plaques AcroPrep ScreenExpert : support d échange d anions Référence 96WPSTARAX. 13 CCS Protéine A + protéine A Les données montrent que l utilisation du support avant la capture sur Protéine A entraînent une meilleure réduction des CHOP (plus de 8 fois supérieure). Compte tenu de cet effet synergétique, en partant d une teneur initiale en protéines de cellule hôte (HCP) de 13 ppm, le niveau de CHOP final est ramené à ~ ppm (diminution de 3 log), avec une récupération des MAb de 9 %.

6 Siège social Port Washington, NY, États-Unis numéro gratuit (États-Unis) téléphone Siège de la zone Europe Fribourg, Suisse Téléphone : +1 () Siège de la zone Asie-Pacifique Singapour Téléphone : Filtration. Separation. Solution.SM Visitez notre site Internet à l adresse Prenez contact avec nous en nous envoyant un courriel à Bureaux internationaux Pall Corporation possède des bureaux et des usines dans les pays suivants : en Argentine, en Australie, en Autriche, en Belgique, au Brésil, au Canada, en Chine, en France, en Allemagne, en Inde, en Indonésie, en Irlande, en Italie, au Japon, en Corée, en Malaisie, au Mexique, aux Pays-Bas, en Nouvelle-Zélande, en Norvège, en Pologne, à Porto Rico, en Russie, à Singapour, en Afrique du Sud, en Espagne, en Suède, en Suisse, à Taiwan, en Thaïlande, au Royaume-Uni, aux États-Unis et au Venezuela. Distributeurs présents dans la plupart des pays industrialisés. Pour connaître le bureau ou le distributeur Pall le plus proche de vous, visitez notre site Les informations fournies dans cette documentation ont été révisées pour être exactes au moment de la publication. Les caractéristiques du produit peuvent être modifiées sans préavis. Pour avoir des informations à jour, consultez le distributeur Pall local ou contactez Pall directement. 13, Pall Corporation. Pall,, AcroPrep et sont des marques de Pall Corporation. indique un nom de marque enregistré aux États-Unis et TM désigne un nom de marque de droit commun. Filtration.Separation.Solution. est une marque de service de Pall Corporation. 3/13, PDF, GN USD 2831 (2)

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