Becton Dickinson Proteomics Munich / Germany Dipl. Biol. Monika Hauptmann

Transcription

1 BD Diagnostics Preanalytical Systems Becton Dickinson Proteomics Munich / Germany Dipl. Biol. Monika Hauptmann

2 BD Diagnostics Preanalytical Systems BD Free Flow Electrophoresis System Des particules aux molécules: Séparation en haute résolution dans un milieu liquide

3 Les paramètres de séparation Matrice de chromatographie IEF PAGE SDS - PAGE (2D - PAGE) Gel de polyacrylamide Gel - Électrophorèse Chromatographie HPLC Centrifugation Sans matrice Free Flow Electrophorèse ZE - FFE IEF - FFE ITP - FFE Sans matrice 3 Les paramètres de séparation: charge, dimension, poid moléculaire culaire, solubilité

4 Principe du FFE Electrophorèse dans un flot continu liquide sans matrice solide Conditions du flot - Solutions aqueuses - Flot continu - Film fin / conditions laminaires - Entre deux plaques parallèles Champ électrique perpendiculaire au flot laminaire - Chambre de séparation encadrée des électrodes Séparation: déflexion des molécules chargés perpendiculairement au flot 4

5 Les différents modes de separation du FFE IEF-FFE (point isoélectrique) Isoelectric Focusing ZE-FFE (charge) Zone Electrophoresis ITP-FFE (mobilité électrophoretique) Isotacho- Electrophoresis ph ph ph 5 Séparation des protéines et peptides selon le pi Séparation des organelles et protéines selon leurs densités de charge Méthode spécifique pour protéines, peptides et organelles

6 Séparation des molécules chargées et chargeable Échantillons complexes (liquides corporels, extraits cellulaires, tissus de toute origine, protéines recombinées) Séparation, purification, enrichissement Analyse (Compatibilité avec les différentes techniques d analyse) Protéines solubles Protéines complexes Protéines membranaires Isoformes de protéines Peptides Organelles Cellules/Virus Particules chargées Autres Essai immunologique (ELISA) Essai enzymatique Gel Électrophorèse Chromatographie Spectroscopie Spectrométrie de masse Cytrométrie en flux Une technologie à haute résolution: séparation des diverses molécules d un échantillon complexe 6

7 BD Free Flow Electrophoresis Caractéristiques Séparation en vrai milieu liquide Fractionnement dans une plaque de 96 puits Conditions natives ou dénaturantes Application permanente de l échantillon Séparation de toutes molécules chargées et chargeable Conditions de séparation stables Avantages Pas d interaction avec une matrice solide pas de pertes non spécifiques Gain de temps Haute résolution (p.ex. pour séparation des isoformes) Préservation des activités biologiques en utilisant des conditions natives Échantillon en quantités analytiques et préparatives Beaucoup d applications possible: organites, protéines membranaires, phosphopeptides, complexes de protéines, etc Bonne reproductibilité 7

8 The BD Free Flow Electrophoresis System Application: Exemples et Résultats 1. Séparation des organelles (ZE FFE) Amélioration de la pureté et de l intégrité des mitochiondries Séparation des sous-populations (mitochondries, peroxisomes) 2. Séparation des protéines (IEF FFE / ZE FFE) Séparation de mixture complexe Double séparation par le FFE: 1) séparation des protéines (dépletion d albumine), 2) séparation des peptides (2D FFE) Séparation des protéines membranaires Séparation des isoformes 8 3. Séparation des peptides (IEF FFE)

9 1. Les avantages du FFE pour la séparation des organelles Extrait cellulaire Centrifugation FFE Enrichissement Accès aux sous-populations Purité Intégrité Le FFE permet la purification et l enrichissement des organelles intactes et de leurs sous-populations donnant accès à une analyse des sous-protéomes 9

10 1. FFE Amélioration de la pureté et de l intégrité des mitochiondries Un concentré des mitochondries après centrifugation FFE fraction 41: organites pures, intactes et enrichies FFE F41 contamination mitochondries purifiées Résumé: La séparation native maintient le contexte biologique et permet des recherches fonctionelles Haute pureté: Dépletion de protéines non-mitochondriales et tronquées Reduction significative des protéines degradées grace à l élimination des protéases endogènes Enrichissement des organelles due à l application continue de l échantillon Zischka et al., Proteomics

11 L Hétérogénéité des mitochondries cardiaques Traitement des mitochondries intactes avec du calcium Centrifugation FFE Professor Peipei Ping & Dr. Oliver Drews Cardiac Proteomics & Signaling Laboratory, David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA FFE fraction I FFE fraction II Résumé: EM 19,000x Des sous-populations dont l état physiologique est modifié sont séparées par FFE Une séparation en haute résolution des mitochondries intactes dont l activité biologique est préservée 11

12 La composition protéique de la membrane extérieure détermine la migration des mitochondries 1,8 1,6 OD 260 nm 1,4 1,2 1 0,8 0,6 Glu Lac 0,4 0, Fractionnement (Lac = Lactate, Glu = Glucose) Glu mitochondrie: respiration diminuée Lac mitochondrie: respiration élevée Résumé: Le FFE sépare différentes populations mitochondriales Zischka et al.; MCP

13 Séparation des sous-populations de peroxisome Deux sous-populations de peroxisome séparées et purifiées Sous-population I peroxisomes du foie de rat après centrifugation Détection des sous-populations par l utilisation de l activité d un marqueur endogène peroxisomal (catalase) 0,03 FFE Sous-population II Catalase assay BU/ml 0,025 0,02 0,015 0,01 0, Fraction No. Résumé: 13 Séparation en haute résolution des sous-populations qui diffèrent en structure, en contenu protéique et en activité biologique Les conditions de séparation natives conservent la structure et la fonctionnalité des organelles L hétérogénéité des organelles pourrait être un marqueur de pathologies

14 2. Les étapes essentielles de la protéomique Prélèvement & Préservation de l échantillon Séparation Identification et Caractérisation des Protéines Analyses des données & Bioinformatique 14

15 Séparation des mixtures complexes avec des gradients de ph linéaires: Accéder aux protéines peu abondantes Extrait cellulaire FFE 2D-PAGE (ph 3-10) Extrait entier sur un gel env spots chaque fraction contient env.. 50 protéines F35 F36 F37 F38 F39 F40 Analyse de 2D-PAGE des fractions acides du FFE (ph 3-10) 15

16 Le plasma d origine humaine séparation en 2D avec le FFE Plasma ph Exp 1 Exp 2 Exp 3 4 FFE "Dépletion d albumine" 2 0 Albumine FFE fraction number Digestion ph Exp 1 Exp 2 Exp 3 FFE Peptides 4 2 MS FFE fraction number 16

17 Identification de protéines peu abondantes du plasma (ph 4-5) 17 ng/ml 30 ng/ml 94 ng/ml 17

18 Enrichissement des protéines membranaires Enrichissement des membranes de plaquettes selon leur composition en protéines membranaires Comparaison de 3 methodes différentes pour enrichir les protéines membranaires Lectin affinity chromatography (WGA) Biotin/NA affinity chromatography Free Flow Electrophoresis WCL: control PM: plasma membrane IM: inner membrane IM enrichment Résumé: Le FFE permet l identification d un plus grand nombre de protéines membranaires La séparation des protéines membranaires plasmatiques et des protéines membranaires internes ne peut se faire que par l utilisation du FFE 18 PM IM other Total Senis et al. (2007) Mol. Cell Proteomics. Copyright by the Am Soc Biochem Mol Biol, Inc. Reproduced with permission

19 Séparation des complexes membranaires Séparation des complexes de la chaîne respiratoire en ph 7.6 et 4.5 Les solutions natives permettent de conserver des complexes membranaires intactes Les complexes qui ont différentes densités de charges migrent de façon distincte sous deux conditions de ph V (FoF1 ATP-Synthase) FFE Fractions 19 a-e I (1000) V (700) III (490) IV (200) II (130) FFE Fractions a-e I (1000) V (700) III (490) IV (200) II (130) S II (Succinat Dehydrogenase) ph 7.6 S IV (Cytochrom c Oxidase) ph 4.5 Legend: I (NAD Dehydrogenase), II (Succinate Dehydrogenase), III (Cytochrome bc 1 ), IV (Cytochrome c Oxidase), V (F0F1-ATP-Synthase), a-e (supercomplexes (I 1 III 2 IV 0-4 )) Résumé: La seule méthode pour séparer des complexes membranaires en quantité suffisante et en état intact en solution Compatibilité avec toutes les méthodes en aval due a des tampons sans détergent Nouvelle approche (ZE FFE) pour une solubilité améliorée et une résolution optimisée Flexibilité pour combiner diverses conditions de ph et garantir une isolation optimale des complexes

20 La Séparation des Isoformes Anticorps purifiés IEF-FFE ph- Gradient 6-8 IEF-Native-PAGE Fraction: Résumé: - La séparation en haute résolution des isoformes d anticorps est facilitée par un gradient de ph étroit Des gradients sont disponibles pour des applications spécifiques (acide, neutre et basique) Point isoélectrique + ph 6.89 ph 7.03 avant FFE 20

21 Enrichissement des Isoformes Amyloglucosidase (90 kda) IEF-FFE Gradient ph 3-4 IEF-Native-PAGE M S pi - Résumé: Gradient de 1 unité de ph en région acide (ph 3 4) Séparation de plusieurs isoformes d une protéine acide 6,0-- 5,3-- 4,5-- 4,2-- 3,5-- + point isoélectrique before FFE Amylogucosidase isoformes 21

22 Les avantages du FFE pour la séparation des protéines Accès aux protéines peu abondantes (FFE: une dimension supplémentaire avant le 2D-PAGE et la chromatographie) Séparation en haute résolution de protéines en utilisant divers gradients de ph étroits Séparation de protéines aux propriétés extrêmes: - protéines très acides et basiques - isoformes avec des points isoélectriques similaires - protéines avec des hauts poids moléculaires - protéines membranaires hydrophobes 22

23 3. Préfractionnement de peptides avec le FFE pour une meilleure identification par MS Protocole de pré-fractionnement Malmström et al.; 2006 Conventional workflow for in-solution digest Digest HPLC (IEX) HPLC (RP) FFE workflow for in-solution digest Digest FFE HPLC (RP) Electrospray LC-MALDI FFE workflow for in-gel digest In-gel Digest FFE HPLC (RP) 23 Le préfractionnement avec le FFE permet l identification de plus de peptides: ~ peptides uniques

24 Conclusions BD Free Flow Electrophoresis System permet: La réduction de la complexité des échantillons De creuser plus profondement dans le sous-protéome L enrichissement de protéines peu abondantes La séparation et le maintien du contexte biologique Le FFE est une méthode de séparation polyvalente BD and BD Logo are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD 24

25 25

26 26

27 Versatility and Compatibility Different Samples Different FFE Protocols Different Analyses Peptides Modified peptides Proteins Protein complexes Protein isoforms Organelles Nanoparticles etc ph range Resolution Denaturing Native etc LC-MS MALDI-TOF ELISA Enzyme assays HPLC etc 27

28 Compatibility Native separations Sample types: protein complexes, protein purification, plasma, isoforms, etc. Sample Preparation FFE Further Separation or or Analysis Native separations: Media components Prolytes HPMC Glycerol Directly compatible with: Gel-based analysis ELISA assays Enzyme activity assays Flow cytometry 28

29 Compatibility Denaturing separations Sample types: peptides, plasma, cell lysates, complex protein mixtures, etc. Sample Preparation FFE Further Separation or or Analysis Denaturing separations: Media components Prolytes Mannitol Urea/Thiourea Compatible with: LC-MS/MS MALDI-TOF FFE Fractions Red/Alk Digestion Clean-up MS 29

30 Technical Notes Protein Concentration Range Normally 1-5mg/ml, as low as 50µg/ml possible. Normal Run Time 30 minutes per sample, as low as 5 minutes possible. Minimum Sample Volume µl. Dilution Factor 1 in 1, but dependent on set-up (ph range, sample load etc). 30

31 Technical Notes Resolution (IEF mode) 0.1 ph units, 0.03 ph units possible. Number of wells per protein 1 or 2, dependent on set-up. Recovery Rate Typically >90%, each protein has unique adsorption properties. 31

32 Sample Preparation: General Considerations The chemical and physical properties of the sample and separation media should be as similar as possible: Density Viscosity Conductivity Temperature Solution: Dissolve the sample in separation media OR Dilute the sample with separation media 32

33 Sample Preparation: Salt Concentration Rule of thumb (IEF): Total salt concentration of sample < 25mM Solution: Dilute or desalt your sample if the conductivity is too high! 33

34 Sample Preparation: Additives Tolerable Additives: 8M Urea or 7M thiourea/2m urea Nonionic or zwitterionic detergents like CHAPS, CHAPSO, Digitonin, DDM, Octyl-β-D-glucoside, Triton-X-100 Lower concentrations of salts Sucrose DTT.. and many more. 34

35 Reproducibility 3 experiments at three different days (all within one week) Gradient: ph 3-8 urea, mannitol pi-marker test: 4455p2 35 min, 2h, 3h, 4h, 5h 4455p3 Liver lysate separated at: 35 min, 2h, 3h, 4h, 5h 4455p4 4455p5 4455p ph FFE fraction number 35

36 Reproducibility (cont.) kda M S M S kda M S M S min h 188 kda M S M S h 188 kda M S h M S 188 kda M S h M S 36