Nouvelles stratégies de vectorisation de l'antigène. et application à la vaccination anti-vhc. UPMC DIU Biothérapies Module 6

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1 UPMC DIU Biothérapies Module 6 Nouvelles stratégies de vectorisation de l'antigène et application à la vaccination anti-vhc Bertrand Bellier UPMC CNRS UMR7211 I3-Pitié-Salpétrière - Paris - France bertrand.bellier@upmc.fr

2 Les limites des vaccins classiques B. Bellier Attenuated Killed Purified subunit Recombinant VLP Influenza Polio Salk Yellow fever Rubella Mumps Measle Polio Sabin Hepatitis A Hepatitis B Hepatitis B Pneumococcal papillomavirus Hep A/B DTP Haemo Infl b Cholera Tetanus Tuberculosis Pertusis Plague Smallpox Diphteria Typhoïd Immunogénicité Sécurité CTL

3 Réponse immunitaire incomplète: RIH >> RIC Limites des vaccins classiques «non-vivants» CTL CD4 Vaccins Inactivés/ Ss-U + alum TH2 RIH

4 Inadéquation des vaccins classiques non-vivants Réponse CTL insuffisante Limite pour la production d AC neutralisants Profil TH2 Justifications de l absence de vaccin contre micro-organismes émergents Inadéquation pour la lutte Infections intracellulaires: bactériennes virales chroniques parasitaires Anti-tumorale Absence des vaccins correspondants: HIV, HCV, Respiratory Syncytial Virus (RSV); Epstein Barr Virus; Cytomegalovirus Plasmodium,.. Adaptation des Pathogènes Echappement au système immunitaire Perturbations immunologiques Infections chroniques

5 A la recherche du vaccin idéal + Immunogène Protection à long-terme Réponse immunitaire complète: ImmunoG ADCC = antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity 14 Anticorps neutralisants (a) Anticorps (b) T helper : cytokines CTL (c) Immunité anti-virale Immunité anti-parasitaire Immunité anti-tumorale CTL Production simplifiée Coûts limités Stable - Stock

6 Renforcement de l immunogénicité B. Bellier Nature de l Ag Ag complet Ag incluant les épitopes immunodominants (HLA-A2) Epitopes neutralisants Formulation de l Ag Quantité / Voie d injection / Schéma d immunisation Empirique Systémique vs locale Augmenter l immunogénicité: Adjuvants Présentation de l Ag Activation T: Règle des 3 signaux : TCR-CMH / Co-stimulation / Cytokines : contribution des adjuvants Présentation par APC: Vectorisation Ag vers APC Vectorisation Ag par APC Génération des AC neutralisants Respect de la conformation des antigènes

7 Renforcement des réponses CTL B. Bellier Nature de l Ag Épitopes CD8-spécifiques = Vaccination peptidique Chargement direct du CMH-I Localisation Intracellulaire et Processing CMH-I Ag endogènes: Ag protéiques intracellulaires Séquence nucléique Vaccins ADN Vecteurs viraux Ag modifié pour augmenter présentation CMH.I Vaccins CTL + adjuvant TH1 Formulation de l Ag Adjuvants de type TH1 Cytokines Th1 Présentation de l Ag Favoriser la cross-présentation RIC +RIH

8 Application au modèle HCV Virus VHC Flaviviridae, virus Env à ARN + Découvert en 1989 (Choo et al) Core Env E1 E2 NS Epidémiologie 180 M personnes infectées dans le monde 0.8M en France; 3,9M aux USA Transmission : Sang : intervention médicales sécurisées dès 1992; 40% usage drogue iv, Tatouage-piercing, cas transmission mère-enfant (10%), Physiopathologie 80% infection chronique Inflammation chronique -> fibrose cirrhose (20%) et cancer du foie (3-10%) Traitement 6 mois : Interféron-a + ribavirine (analogue nucléosidique) : efficace à 55% Limites au développement d un vaccin: Capacité de mutation de HCV -échappement à la neutralisation (HVR1 E2) Diversité: 6 génotypes et nombreux sous-génotypes (>100 génotypes ) Corrélat RI et protection? Phase aigue: Guérisons spontanées: CTL anti-ns3, Th1 Phase chronique: Ig anti-e2 (HVR1) et CTL anti-ns4 Modèles expérimentaux Pas de multiplication en culture cellulaire Manques d outils expérimentaux : pas de challenge viral chez les petits animaux ; chimpanzé

9 Vectorisation et Formulation des antigènes protéiques Liposome-Virosome Cellules Dendritiques VLP

10 Vectorisation des peptides et protéines (1) Liposome bicouche de phospholipides obtenus par "sonication" d'un mélange d'un soluté aqueux et de phospholipides (Cholestérol + Phosphatidylcholine). Améliorations: Lipides-PEG (limite interaction avec macromol : + biodistri) Immune-stimulating complexes (ISCOMS) Structure «cage»; 35nm générée par un mixte de Quil-A (saponine) + Cholestérol + Phosphatidylcholine Avantages Limitent la dégradation des Ag Véhiculent jusqu au ganglions (pas de dépôt) Délivrent Ag dans cytoplasme des cellules Renforce réponses CTL Targeting optionel: Ciblage APC: si couplage avec : AC monoclonaux, Ligands, Peptides, Limites Pas d effet de dépôt Fusion non-spécifique et non-contrôlée Renforce pas l immunogénicité des Ag Production et Encapsulation limitantes

11 Données expérimentales pour VHC

12 Vectorisation des peptides et protéines (2) les Virosomes Virosome = Liposomes + enveloppes virales Systèmes: 1 ère génération: Influenza Liposomes + HA+NA (H1N1) (Almeida 1975) Autres : Epstein-Barr virus (Grimaldi 1995), HIV (Cornet 1990), VSV, Sandai Transport des antigènes: Protéines dans membrane (incorporées / couplage chimique) peptides, protéines, ADN, ARN encapsulés Avantages Limite dégradation des Ag Administration intracellulaire des Ag encapsulés Renforce réponses CTL Ciblage cellulaire ligand récepteur - couplage AC Immunogénicité accrue: effet adjuvant des protéines virales Limites Encapsulation : étape limitante Fragilité des enveloppes virales (PH, )

13 Données expérimentales pour VHC

14 Vectorisation des peptides et protéines (3) Virus like particles Pseudo-particules: Complexe protéique de taille et de structure comparables aux particules virale mais dépourvu de génome viral (déficients pour la réplication) Production: Auto-assemblage des protéines de la capside virale Hépatite B, Papillomavirus (HPV), Parvovirus Système de production: E.Coli, Levure, Baculovirus, Cellules mammifères Généralisation à +30 virus différents par assemblage des protéines de capside et d enveloppe SIV-HIV, HCV, Influenza, Vaccins VLP: VLP homologues VLP hétérologues transporteurs d Ag Intérêts: Sécurité (pas réversion, compatible ID) Poids moléculaire > Présentation dans contexte naturel; bonne immunogénicité (Bachmann M; Science, 1993) Réponses AC neutralisants Cross-présentation / CMH-I

15 B. Bellier

16 Vaccin avec VLP homologues Papillomavirus Vaccin contre «le cancer du col de l utérus» Human papillomavirus (HPV-6, 11, 16, 18) 20% pop HPV-16 sero+ Risque associé de cancer du col de l utérus (2nd cause de mortalité dans les cas de cancer chez la femme Essai vaccinal: VLP formées par la capside L1 du virus papillomavirus de type 16 ou 18 Schéma thérapeutique: 40mg VLP à J0, 2 et 6 mois vs placebo Résultats: Phase II: N. Engl. J. Med (VLP-16) n=1200 Phase II: Villa LL; Lancet Onc 2005 (VLP 6, 11, 16, 18) n=277 Phase III: 7 oct 2005, USA Vaccins: Gardasil : Merck. Vaccin quadrivalent produit chez la levure contre les HPV- 6, 11, 16, 18. Essai phase III sur 6082 femmes : protection 100 % des pré cancers du col et des cancers cervicaux non invasifs. Commercialisation nov 2006 du vaccin Gardasil (développé par Merck et Sanofi-Pasteur) Cervarix: Glaxo-Smith-Kline (GSK). Vaccin produit par baculovirus contre les HPV-11,16 et 18. Essai phase III. Commercialisation mars 2008

17 Vaccin avec VLP homologues Hepatitis C AS01: monophopshoryl lipid A +QS21 (saponine)

18 Utilisation des VLP comme transporteur d antigènes Intérêts: Augmenter l immunogénicité des antigènes Signal de danger Possibilité d induire des RIH et RIC Vaccin avec VLP hétérologues Origine des VLP: HBV : HBc (Pumpens P, Intervirol 2002) HPV Rétrovirus Accrochage antigénique: Chimique ou Recombinaison Génétique Chimique Génie génétique

19 VLP HBV - Ag HCV: HVR1-1a HVR1-1b

20 Vectorisation des peptides et protéines (4) vers les APC Ciblage en utilisant des ligands des DC CD40L CTLA-4 OmpA Adenylate Cyclase Anticorps Anti-CD11c Anti-DEC205 Anti-DC-SIGN Anti-NKG2D Adenylate cyclase Bordetella Pertussis CTLA-4 B7-1 CD11b Klebsiella pneumoniae TLR2 ompa Tropisme naturel des virus VSV, HSV Sindbis Modification génétique des GP d enveloppe Tropisme exclusive pour DC-SIGN (D. Baltimore)

21 Vectorisation des peptides et protéines (5) par les APC Présentation des Ag par les APC APC : Cellules dendritiques à partir des monocytes du sang périphérique Maturation des DC Chargement antigènes: Antigènes peptidiques Protéines : Lysat tumoral Fusion cellulaire Transfection -Transduction (pour Ag nucléiques) Injections (SC, IV, Intra LN) Applications: Vaccination thérapeutique anti-tumorale (50 essais cliniques en cours) Avantages Renforce efficacité de vaccination peptidique Limitations Préparation à grande échelle

22 Vaccin DC - Essais cliniques Vaccination thérapeutique anti-tumorale : approche thérapeutique personnelle, coûts élevés ( /p) >50 essais cliniques en cours : DC+gp100 vs DC fusionnées mélanomea III-IV NCI-2004 DC+lysat auto mélanome III-IV NCI-2004 Rein NCI-2001 DC+lysat allo Poumon NCI-2005 DC+RNA Rein Argos 2004 Essais pré-cliniques pour HCV

23 ADN Vecteurs viraux VLP Immunogénicité ++ CpG Réponse immunitaire CTL+++ Ac (Ag sécrété ou mbr) CTL+++ Ac (Ag sécrété ou mb) CTL +/- (cross-p) Ac neutralisant+++ Sécurité Production

24 Antigènes «nucléiques» et leurs vectorisations Vaccins ADN Vecteurs viraux PlasmoVLP

25 Vaccination ADN B. Bellier Concept de plus de dix ans (Wolff, Science 1990) L injection dans le muscle de un ou plusieurs gênes sous forme plasmidiques permet la pénétration de l ADN dans le tissu et l expression du gêne par les cellules de ce tissu. Application à la vaccination Immunogénicité des protéines exprimées (Tang et al, 1992) ADN plasmidique Gène = séquence antigénique Système d expression eucaryote Système d expression procaryote Produit par culture bactérienne Expression antigénique et présentation antigénique Expression Intracytoplasmique favorise présentation MHC classe I : réponses CTL +++ Présentation antigénique dépend de la nature de l Ag: Avantages Intracytoplasmique Membranaire Sécrété Capacité à induire RIC +++ Rapidité de production Coûts, Stockage Adjuvants génétiques

26 Injection d ADN nu en clinique Nature Rev Genet 2008

27 Conclusion des premiers essais B. Bellier Essais Pré-cliniques encourageants: Développement d une RIC, RIH, AC neutralisants après 1 à 3 injections d ADN en intramusculaire (100µg/souris ± Cardiotoxine) Protection dans modèles infectieux multiples: vaccins préventifs et thérapeutiques Premiers essais cliniques décevants: Essais cliniques Ebola; 2003 (USA) Malaria (Wang, Science 1998) Porteurs chroniques du virus HBV; 2002 (Fr; IP) Porteurs chroniques de HSV-2 (PowderMed, oct 2004) HIV : ADN-Env, 2005 (USA) Prime ADN-boost proteique, 2000 (Europe, USA, Kenya) Prime ADN -boost rad, 2005 (USA) Prime rad - boost ADN, 2005 (Kenya) Induction d une réponse immunitaire +/- importante mais aux conséquences cliniques toujours limitées chez les porteurs chroniques Limites: Quantités d ADN Transposition souris - Homme Augmenter l efficacité de transfection : électroporation, vectorisation de l ADN Modalités d injection : Pourquoi choisir le muscle? Autres sites?z

28 Choix du site d injection Intra-Musculaire Plasmide épisomal stable Expression de l Ag durable (plusieurs mois) Mais étape d initiation de la réponses limitante Peu d APC résidantes Intra-Dermo/Cutané Tissus «immunogène» : Langerhans (DC peau) en plus des kératinocytes Sécrétions cytokiniques (K+LC) Mais durée de vie des cellules courte Nécessite de rappel Skin Section Vertical section of human thigh skin showing Langerhans cells (Cy2, green) in the epidermis with a few migrating to the superficial dermis. Basement membranes (Cy3, red) delineate the capillaries and the boundary between the epidermis and the dermis. Mast cells (Cy5, recolored blue) are present near vessels. Secondary antibodies conjugated with Cy2, Cy3, and Cy5 were from Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. Intra-Tumoral Intra-ganglionaire

29 ADN nu intramusculaire Q = 100µg (souris) + Cardiotoxine (modèles animaux) ± adjuvants Modalités d injection de l ADN Cd Ep Dj Gg Electroporation IM Après IM Perméabilisation membranes cellulaires Q= 10µg DNA (µg) injection Carditoxin 100 IM Electropo 10 IM Dermojet 10 ID Gene gun 0.5 ID Injection par jet Biojector-2000 ; Dermojet Injection sous pression sans aiguille Q=10µg Biobalistique Gene Gun, PowderJect ADN sur billes d or Injection sous pression de gaz Q= 1µg Autres: Patch, Dermographe Vectorisation de l ADN Liposomes, Virosomes, ISCOM Vecteurs viraux ou bactériens Patch Jet injector Microinjector Biolistic

30 CHRONVAC-C B. Bellier Vaccin ADN thérapeutique anti-hcv Codon optimized NS3/4A-pDNA Medpulser DNA delivery system : IM+EP Développement par Tripep depuis 1999 Phase I/IIa en cours (oct 2007) Expected data in 2010

31 Optimisation des vaccins ADN

32 ADN Vecteurs viraux VLP Immunogénicité +/- CpG Réponse immunitaire CTL+++ Ac (Ag sécrété ou mbr) CTL+++ Ac (Ag sécrété ou mb) CTL +/- (cross-p) Ac neutralisant+++ Sécurité Production

33 Favoriser l entrée de l ADN Vectorisation de l ADN (ADN) Véhicule l ADN dans la cellule Liposomes, ISCOM, Virosomes Vecteurs bactériens Vecteurs viraux Adénovirus Rétrovirus Oncorétrovirus MLV Lentivirus: HIV, SIV, FIV Poxvirus Vaccine : MVA, NYVAC Canarypox: ALVAC Parvovirus AAV (dépendant) MVM Herpès HSV-1 Sindbis VSV Rougeole (MV) Sandaï Poliovirus Augmente l efficacité de transduction Permet de diminuer les quantités d ADN Renforce l immunogénicité: «visibilité» des complexes ISCOM, des vecteurs viraux ou bactériens Prise en charge préférentielle par les APC

34 Vecteurs adénovirus non-réplicatifs Adénovirus mutants délétés pour les régions E1-E3. ` Double délétion autorise une taille du transgène supérieure Différents sérotypes existants Adenovirus Avantage: Episomal: pas d insertion Nécessite pas de division cellulaire Forts titres viraux Injection systémique ou locale Limites: Immunité-Préexistante Transcription map of Ad5 and gene transfer vectors E1A E1B MLP E3 nucleotides L1 L2 L3 L4 L5 Ad5 genome E2B E2A E4 Transgene E1(+/-E3)-deleted vector (first-generation vector) Transgene ΔE1 ΔE2 ΔE3 ΔE4 E1(+/-E3) + E2/4-deleted vector (second generation vector) Transgene I Non-coding stuffer DNA Transgene II High-capacity vector ( gutless vector) Division of Gene Therapy, University of Ulm

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36 «Prime - Boost» Justification: Contournement de l immunité induite contre le 1er vecteur Modalités Prime: J0 / Boost J30 Avantages: Expansion des lymphocytes mémoire à haute affinité

37 ADN Application à la vaccination ADN Immunisation: OVA-DNA +/- OVA-rVV DNA DNA +rvv DNA +rvv DNA Prime boost immunization generates a high frequency, high-avidity CD8+ cytotoxic T lymphocyte population Marie J. Estcourt; Int Immunol, 2002

38 Mice HLA-A2 B. Bellier 8 weeks 8 months

39 Bilan des stratégies vaccinales Types Avantages Limites Peptide Protéine DC ADN ARN rvecteur Viral rvecteur Bacterien Facile à produire Sécurité Facile à produire Pas restriction HLA Immunogénicité Chargement Ag varié Production, Stockage RIC +++ Adjuvants génétiques Pas de risque d intégration Immunisations multiples Immunogénicité Design multiple Immunogénicité Véhicule plasmides ou protéines Faible immunogénicité Restriction HLA Induit de meilleures réponses anticorps que CTL Production limitée Homing Immunogénicité limitée RIH limitée Intégration (?) Faible efficacité de transfection Instabilité (manipulation, stock) Sécurité Immunité pré-existante (1 imm ) Sécurité Immunité pré-existante (1 imm ) VLP Immunogénicité +++ RIH +++ Sécurité Production, 1 imm RIH > RIC

40 PlasmoVLP Strategy that combines the advantages of DNA and VLP vaccines plasmid DNA VLP T cells DNA - Efficient CTL immune responses B cells - Low antibody immune responses CD8+ VLPs - Particulate form enhances immunogenicity - Natural conformation of antigen presentation favors B cells activation and neutralizing Ab production; - Easly uptake by DCs, - Cross-presentation of CTL antigen. CD4+ DCs PlasmoVLPs - Broad immune responses - Circumvent in vitro VLPs production -Flexible genetic design CD8+ Ag cross-presentation to CD8+ T cells

41 Gag HCV E1/2 HCV pseudotyped retrovlps Gag+ E1E2 Env+ No Env Env Control Env E2 Cont. HCV application Prime HCV-plasmoVLP E1 Gg Tatoo ID+EP Nd Free H-2b HCV-Adeno 10 8 pfu IM weeks DNA vaccines (10ug, needle-free injector) Naive HCV-pVLP Purified VLPs Western blot HCV.E1E2-specific IFNg ELISPOT (Week 6) Gag DNA (ug/inj) Injection ID ID ID ID HCV-Adeno DNA delivery

42 Conclusions - Perspectives We demonstrated, using different model antigens, that particulate form of the antigen is important for immunogenicity; DNA encoding VLPs appears as promising genetic vaccines, able to induce broad immunity MLV-derived plasmovlps : For priming As boost in prime-boost strategy In association with genetic adjuvants to enhance induced immune responses Optimized: adding DC-specific ligand on produced VLPs Delivered by recombinant viral vector (rad5) CD40L Anti-DEC205 ICAM-1 Vaccine applications: Versatile system HCV, HIV, H5N1 specific vaccine To induce envelope-specific neutralizing Ab To induce CTL response against conserved epitope - inserted in Gag protein