Biologie Moléculaire 6 GT SG FWB Leçon n 5

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1 Biologie Moléculaire 6 GT SG FWB Leçon n 5

2 Tests de paternité (fin labo électrophorèse) Un test de paternité consiste à analyser l'adn de deux personnes dans le but d'établir un lien de parenté génétique. Des tests assez simples ne requérant aucune analyse poussée peuvent donner de premières conclusions. Cependant, ils ne permettent jamais de confirmer un lien de parenté, ils ne peuvent qu'exclure certaines hypothèses. Produit de PCR obtenu à partir de l ADNg Amplification d une région variable de 7.0 Kb (7,000 bp) 2 produits de PCR car 2 allèles (homme diploïde) Séquences nucléotidiques différentes R M P B G Hypothèse de départ: Les 2 enfants sont issus du père et de la mère Caractérisation des différences / ressemblances Digestion de restriction / électrophorèse sur gel d agarose Mère (M n 8) 4.0 Kb 1.75 Kb 1.25 Kb 7.0 Kb Total = 14.0 Kb = 2 x 7.0 Kb Père (P n 9) 3.0 Kb 2.5 Kb 1.5 Kb 5.0 Kb 2.0 Kb Question: Nombre de sites de restriction? Parents: Mère (n 8) 7.0 Kb Kb Kb Kb Père (n 9) 5.0 Kb Kb Kb Kb Kb Enfants: Boy (N Kb Kb Kb Girl (n 11) 5.0 Kb Kb Kb Kb Kb Mendel: 2 allèles de l enfant (F1) = 1 allèle de la mère (ovocyte) + 1 allèle du père (spermatozoide) Et on commence par identifier l allèle provenant de la mère chez les 2 enfants Ensuite on passe à celui du père Conclusion: Le fils possède un allèle qui n est pas un de ceux du père (un site de restriction a disparu) ATTENTION! La région amplifiée est choisie parce qu elle est variable! Donc mutations fréquentes. Peut-être lors de la génération des spermatozoïdes du père! «Les Experts : 97.8% Match» Statistiques!

3 Le plasmide pglo (fin labo Transformation) Le plasmide pglo: structure, fonctionnalités et utilisations MCS Origine de réplication du plasmide. Nécessaire pour permettre aux plasmides de se multiplier au sein de la bactérie hôte. Gène codant pour la β-lactamase conférant la résistance à l Ampicilline. Sélection des bactéries transformées. Opéron Arabinose. En présence d Arabinose il active le promoteur Pbad via un mécanisme assez complexe. Promoteur Pbad. Un élément qui régule la transcription d un gène situé généralement en aval (3 ) et donc l expression de ce gène (ex. protéine). Gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP). Gène «rapporteur» permettant de visualiser et/ou mesurer l'expression d'un gène d'intérêt où la localisation d une protéine (fusion à la GFP) Multiple Cloning Site. Courte région de l ADN où l on retrouve des (souvent 10 à 20) sites reconnus par des enzymes de restriction. Ces sites sont généralement uniques sur le plasmide et facilitent donc le clonage. Ici, situé juste en aval du gène GFP, il permet éventuellement de fusionner un gène d intérêt à la GFP. Transfection? Correspond à la transformation bactérienne. C est un transfert de gènes, c'est-à-dire l'introduction d'adn exogène dans des cellules eucaryotes (non médié par un virus Thérapie virale).. Le pglo est un vecteur qui a été utilisé dans de nombreuses expériences de transfection pour par exemple créer des OGM (et la GFP permettait de visualiser le succès de la transfection). Exemple pglo bien connu: Le Lapin Fluo «Alba»

4 Enzymes de Restriction & Clonage Plasmidien Une enzyme de restriction est une protéine qui peut couper un fragment d'adn au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique. 5 ACGTCGTG 3 3 TGCAGCACTTAA 5 1. Les Enzymes de Restriction 5 ACGTCGT G AATTC CGTCTC 3 3 TGCAGCA CTTAA G GCAGAG 5 5 AATTCCGTCTC 3 3 GGCAGAG 5 L enzyme EcoRI reconnait la séquence 5 GAATTC 3 (vert) dans l ADN et coupe à celui-ci à un endroit et d une façon spécifiques (rouge) Utilisation très, très fréquente: le Clonage dans un plasmide + Le plasmide se referme sur lui-même sans incorporer le fragment Le fragment se referme sur lui-même

5 Le Séquençage d ADN (Sanger) Le séquençage d ADN selon la méthode développée par l équipe de Fred Sanger (Cambridge University UK; prix Nobel ) Regardez la vidéo et prenez des notes. C est très proche d une réaction PCR (utilise aussi une ADN polymérase). La seule chose à savoir c est que les dideoxynucleotides (ddntp) vont «bloquer» la réaction et qu ils sont soit radioactifs soit «fluorescents».

6 Le séquençage d ADN (Sanger) En biochimie, le séquençage consiste à déterminer l'ordre linéaire des composants d'une macromolécule (les acides aminés d'une protéine, les nucléotides d'un acide nucléique comme l'adn, les monosaccharides d'un polysaccharide, etc.). Le séquençage de l'adn, consiste à déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d un fragment d ADN donné. Jusque très récemment, la plupart du séquençage d ADN était réalisée par la méthode de Sanger. Dans la méthode de Sanger, la polymérisation de l ADN est initiée par un petit oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d ADN à séquencer. L élongation de l amorce est réalisée par la «séquénase» (une ADN polymérase I dépourvue d activités exonucléasiques 5 3 et 3' 5', et 100 fois plus rapide que le fragment de Klenow). Les quatre désoxynucléosides (datp, dctp, dgtp, dttp) sont ajoutés, ainsi qu en faible concentration les quatre 2'-3'didésoxynucléosides (ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp) marqués par des fluorochromes différents. Ces didésoxynucléosides, une fois incorporés à la nouvelle chaîne synthétisée, empêchent la poursuite de l élongation. Il en résulte de nouveaux fragments d ADN de taille variable, qui sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide.

7 Techniques de Biologie Moléculaire: Mise en application pour le diagnostique VIH Le diagnostique VIH se fait principalement en déterminant la séquence en acides aminés des protéines virales (Protéase, Reverse Transcriptase) et en évaluant si le fonctionnement de ses protéines peut être perturbé par les 23 médicaments (inhibiteurs de fonctionnement) disponibles sur le marché. Le virus VIH (rétrovirus à ARN, SIDA) infecte les cellules de type lymphocytaire (défense immunitaire de l organisme). Il reconnait ces cellules (Clé/ Serrure) et injecte son ARN dans la cellule. Celui-ci est traduit en protéines dont une Réverse Transcriptase (ARN -> ADN) qui va permettre d intégrer une ou plusieurs copies ADN du virus dans le génome de la cellule. Cette copie est ensuite utilisée pour produire des virus «fils» qui seront exportés (tout en tuant la cellule hôte; d où problèmes On ne meurt pas du SIDA mais d un rhume, d une grippe, etc.). Un particularité très importante est que cette Réverse Transcriptase n est pas très fiable: Elle fait des erreurs (mutations) ce qui peut engendrer une «descendance virale» très différente du virus initial. Et sur laquelle certains médicaments ne seront plus efficaces. Exemple: une mutation K->L en position 46 (référence à la séquence «sauvage») de la Protéase virale confère une résistance aux médicaments inhibiteurs de l activité de cette Protéase. Question: Quelles techniques de Biologie Moléculaire sont utilisées pour déterminer la séquence VIH et ensuite le diagnostique?

8 Techniques de Biologie Moléculaire: Mise en application pour le diagnostique VIH 1. Obtenir un échantillon tissulaire contenant le virus d un patient. Un prélèvement sanguin. Les «Fils» viraux circulent recherchant de nouvelles cibles (lymphocytes). 2. Extraire l ARN viral. Méthodologie assez proche de l extraction d ADN (5G). Toutefois l ARN est instable (ribonucléases; enzymes digérant l ARN) donc précautions particulières: à froid avec protéases dont RNAses (enzymes détruisant les ribonucléases) et en faire une copie ADN (Réverse Transcriptase fiable!) 3. Analyser l ADN copie = déterminer la séquence nucléotidique et ensuite la séquence peptidique pour permettre le diagnostique. On se focalise sur Protéase et Réverse Transcriptase (21/23 médicaments) +/ nucléotides

9 Techniques de Biologie Moléculaire: Mise en application pour le diagnostique VIH ARN simple brin viral 5 3 Protéase Réverse Transcriptase Amorce 5 RT-PCR Amorce 3 5 Copies ADN double brin de l ARN simple brin viral pour la région Protéase/Réverse Transcriptase 1. Séquençage du produit de PCR («Nested» amorces). 3 GAATTCCGATGACGAGGACATGGGA...GGCTAGTAGATAGAGAGAGTAAGCTT 3 CTTAAGGCTACTGCTCCTGTACCCT...CCGATCATCTATCTCTCTCATTCGAA 5 2. Clonage (Enzymes de restriction) puis Séquençage du produit de PCR. 5 3 GAATTCCGATGACGAGGACATGGGA...GGCTAGTAGATAGAGAGAGTAAGCTT 3 CTTAAGGCTACTGCTCCTGTACCCT...CCGATCATCTATCTCTCTCATTCGAA 5 EcorI HindIII Différence (données obtenues)? La séquence obtenue en 1) est «globale». On voit le produit de PCR de l ensemble de la population virale dans le sang. La séquence obtenue en 2) est celle d un seul virus. Lors de l infection VIH il y a très souvent plusieurs type de sous-populations. Dont peut-être une seule est résistante aux médicaments et malheureusement pas majoritaire. En utilisant la méthode 1) on ne peut détecter que les souspopulations > 20%, avec la méthode 2 si l on séquence 100 clônes on peut détecter des sous-population à 1%. ( mais c est très couteux -> NGS sequencing)