Recherche sur les origines génétiques de l obésité

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1 Recherche sur les origines génétiques de l obésité Extrayez votre propre ADN Atelier d expérimentation PROTOCOLE

2 Introduction L incidence de l obésité tend à augmenter dans le monde entier. Les scientifiques et les médecins s inquiètent de la menace que représente l obésité pour la santé et tentent d'en comprendre les causes, afin de concevoir des stratégies de traitement et de prévention. Dans certains cas, l obésité peut entraîner un diabète sucré de type 2 (DS2). Le diabète est une maladie caractérisée par l augmentation du taux de glucose dans le sang. Les personnes en surpoids présentent davantage de graisse autour des cellules, ce qui rend l utilisation de l insuline par l organisme plus difficile. L insuline est une hormone qui permet au glucose sanguin d'entrer dans les cellules du foie, des muscles et du tissu adipeux, elle permet le stockage du glucose sous forme de glycogène dans le foie et les muscles et interrompt l utilisation des graisses comme source d énergie. Données essentielles sur l obésité et le surpoids : L obésité a plus que doublé depuis En 2008, 1,5 milliard d adultes âgés de 20 ans et plus étaient en surpoids. 65 % de la population mondiale vit dans des pays où le surpoids et l obésité sont l une des principales causes de mortalité. Environ 43 millions d enfants âgés de moins de 5 ans étaient en surpoids en 2010 (source : Nations Unies, mars 2011). L existence d antécédents familiaux est un important facteur de prédisposition à l obésité et au diabète de type 2. Avoir des membres de sa famille obèses et présentant ce type de diabète augmente considérablement le risque de développer soi-même la maladie. 2

3 Recherche sur les origines génétiques de l obésité Afin d étudier le risque potentiel de développement de diabète sucré de type 2 lié à des facteurs héréditaires, les scientifiques ont appuyé leurs recherches sur l ADN. Ils étudient des échantillons d ADN prélevés sur des personnes obèses et diabétiques et les comparent à ceux de personnes normales pour en déterminer les différences. Les recherches sont d abord menées sur des rats. L ADN est extrait des cellules des muscles et du tissu adipeux. L ADN des rats est séquencé pour obtenir l ordre linéaire des nucléotides. Cet axe de recherches a déjà permis l identification d un gène, auquel on a donné le nom de DOR (de l anglais «Diabetes and Obesity Regulated» ou Gène régulant le Diabète et l Obésité) et qui se comporte de façon différente chez les rats obèses et chez les rats normaux (chez ces derniers, le gène s exprime moins). Afin de séquencer ces gènes, les scientifiques doivent d abord extraire l ADN. Chromatide Télomère Cellule Centromère Noyau Télomère Histones Paires de base ADN (double hélice) 3

4 Qu est-ce que l ADN? L ADN ou l'acide désoxyribonucléique est une molécule biologique responsable du stockage de l information génétique dont tous les organismes vivants, à l exception de certains virus, ont besoin pour se développer et fonctionner. Où se trouve-t-il? Il est présent dans tous les organismes vivants. Chez les bactéries, l ADN se trouve dans le cytoplasme, tandis que chez les organismes plus complexes comme les plantes, les animaux et autres organismes multicellulaires, la majeure partie de l ADN se trouve dans le noyau de la cellule. L ADN est contenu, sous forme compacte, dans les chromosomes, qui détiennent les codes des instructions essentielles permettant à l organisme de se développer et de pouvoir vivre. Ces instructions, ce sont les gènes qui stockent l information et sont chargés de la transmettre aux descendants. De quoi l ADN est-il fait? L ADN est une molécule composée de répétitions de trois types de molécules : une base azotée, un groupe phosphate et un pentose. Chaque unité formée de ces trois types de molécules est appelée monomère. Comme l ADN contient de nombreux monomères qui se répètent, on peut appeler celui-ci un polymère. Chacun de ces monomères est ce que l on appelle un nucléotide. Les nucléotides contiennent différentes bases (désignées par les lettres A, C, G, T) ordonnées en séquence, formant une sorte de code-barres. Thymine Adénine Extrémité 5 Extrémité 3 Phosphate Squelette Désoxyribose phosphate Extrémité 3 Guanine Cytosine Extrémité 5 Désoxyribose (pentose) 4

5 Objectifs Notre objectif est d extraire l ADN de nos propres cellules de manièreet facile. Vous êtes-vous déjà demandé comment la police extrayait l ADN des échantillons qu elle préleve sur les scènes de crime? Comment les scientifiques séparentils l ADN des cellules et l isolent-ils au milieu des lipides, protéines, hydrates de carbone et sels? Méthode 1 Prélever l échantillon La première étape est d obtenir les cellules à partir desquelles nous extrairons l ADN. Ces cellules peuvent être obtenues facilement en raclant la langue et les parois intérieures de la bouche. compacte. Sous son action, l ADN est donc décompacté et d autres molécules biologiques de notre échantillon sont également dégradées. L une de ces enzymes est appelée DNase ; son rôle est de couper l ADN. 3. Neutralisation de la charge portée par l ADN : Pour ce faire, on utilise un sel aux nombreux usages différents : l acétate de sodium (NaAc). Les ions Na+ se lient aux groupes phosphate présents dans l ADN, qui sont fortement chargés négativement. 2 Libérer le contenu des cellules Nous commençons aussitôt à traiter notre échantillon en respectant les étapes suivantes : 1. Lyse : C est le processus qui permet d ouvrir, en les rompant, la cellule et les membranes du noyau. Les membranes sont rompues sous l action de détergents et l ADN est alors libéré dans la solution. 2. Décompactage de l ADN : On utilise de la protéinase K, une enzyme qui va dégrader les protéines liées à l ADN et qui le maintenaient sous une forme 3 Précipitation de l ADN Avant l ajout de l éthanol L étape finale est la précipitation de l ADN, qui rend l invisible visible. Pour cela, nous utilisons de l éthanol. L ADN est soluble dans l eau, mais lorsque l on ajoute de l éthanol, il se sépare et précipite. Après addition de l éthanol, des filaments blancs commencent à apparaître en suspension. Voici notre ADN. Après ADN précipité 5

6 Équipement et matériel nécessaire Instruments et équipement de laboratoire Micropipette de 20 à 200 μl Micropipette de 1 à 5 ml Minuteur Matériel à usage unique Anse pour racler l intérieur de la bouche Pipettes Pasteur en plastique Embouts de micropipette Embouts pour micropipette plus grande Tubes Falcon de 15 ml Feutre permanent Gants, blouse et lunettes de protection 6

7 Réactifs et solvants NaAc Protéinase K Solution de protéinase K -20ºC Solution de lyse à base de sels et de détergents Solution d acétate de sodium (NaAc) Éthanol froid (conserver au congélateur à -20 ºC) 7

8 Procédure A Extraction des cellules épithéliales La première étape consiste toujours à obtenir un bon échantillon. Pour cela, nous prélevons des échantillons dans la bouche. Il y a de nombreuses cellules mortes prêtes à se détacher et elles contiennent une grande quantité d ADN. 1 Prépare un tube Falcon avec 1 ml de solution de lyse. Laisse le tube ouvert pour faciliter la suite des opérations. 2 Racle bien l intérieur de ta bouche pendant 2 minutes, en frottant avec l extrémité de l anse à l intérieur de tes joues et en particulier sur le dessus de la langue. De cette façon, tu obtiendras assez de cellules. 1 ml de solution de lyse Place le grattoir dans le tube Falcon avec la solution de lyse et mélange un peu. 3 Retire le grattoir du tube et jette-le aussitôt (ne le remets surtout pas en bouche). Suce tes joues de façon à ce que la salive entraîne les cellules qui se sont détachées de l épithélium. Prélève la salive avec une pipette Pasteur et mets le tout dans le tube avec le premier échantillon. 4 Replace fermement le bouchon sur le tube et mélange la solution en agitant vers le haut et vers le bas. Plus il y a de salive, plus il y aura d ADN! 8

9 B Libération du contenu des cellules 1 Ajoute 20 µl de protéinase K pour couper les protéines, en faisant reposer la pipette sur la paroi du tube et en versant son contenu. 2 Replace fermement le bouchon sur le tube et mélange la solution en agitant vers le haut et vers le bas. Laisse incuber pendant 10 minutes. C Précipitation de l ADN 1 Calcule le volume approximatif (V) prélevé en utilisant la graduation indiquée sur le tube. Indique ici le volume : V= ml 9

10 2 Ajoute un dixième du volume (V/10) de solution de NaAc à l échantillon. Par exemple, si tu as un volume initial de 1 ml, ajoute 100 µl d acétate de sodium : 1 ml=1000 µl 1000 µl/10=100 µl qui doivent être ajoutés. Fais tes calculs ici : Replace fermement le bouchon sur le tube et agite-le bien, vers le haut et vers le bas. 3 4 Ajoute un volume d éthanol équivalent à 3 fois le volume initial (Vx3). Par exemple, si tu as un volume initial de 1 ml, tu dois ajouter 3 ml d éthanol : 1 ml x 3 = 3 ml d éthanol Agite le tube tout doucement vers le haut et vers le bas pour mélanger la solution. Ton ADN apparaitra sous forme de précipité blanchâtre. Fais tes calculs ici : ADN précipité 10

11 Résultats et conclusions 1 À la fin de la séance, qu as-tu observé? Qu est-ce qui est à l origine de ce résultat? Pourquoi? 2 Que se serait-il passé si tu avais réalisé la dernière étape de précipitation en utilisant de l eau froide au lieu de l éthanol? 3 À ton avis, si tu n avais pas réalisé la première étape de lyse, que se serait-il passé? 4 À ton avis, pourquoi l ajout de la protéinase K est-il important? Fais un schéma pour montrer ce qu il s est produit lorsque tu as ajouté la protéinase K. 11

12 5. Quels sont les composants qui ont neutralisé les charges? À ton avis, pourquoi cette étape est-elle importante? 6. À ton avis, ce protocole fonctionnerait-il également en utilisant un cheveu? Et en utilisant des cellules végétales? 7. Il existe un protocole similaire pour l extraction de l ADN, qui utilise de l eau salée, du liquide vaisselle et de l éthanol. Associe chacun de ces composants avec l un de ceux utilisés pendant cette séance. 12

13 Annexe 1 Consignes de sécurité Informez-vous Localisez les éléments de sécurité du laboratoire ou de l espace prévu pour effectuer les expériences (extincteurs, douches ou bain, sorties, etc.). Veuillez lire attentivement les instructions avant de commencer une expérience. N oubliez pas de lire les étiquettes de sécurité des réactifs et des appareils. Utilisez des vêtements adéquats Gants, blouse et lunettes de protection. Règles générales Il est interdit de fumer, de manger ou de boire dans le laboratoire ou l espace prévu pour effectuer des expériences. Travaillez de manière ordonnée, proprement et calmement. Si un produit se renverse, nettoyez-le immédiatement. Laissez toujours le matériel propre et bien rangé. N utilisez jamais un équipement ou un appareil sans en connaître parfaitement son fonctionnement. Lavez-vous les mains avant de sortir du laboratoire. Manipulation du verre Protégez-vous les mains lorsque vous manipulez du matériel en verre et faites attention à sa température vous ne pouvez deviner s il est chaud ou froid simplement en le regardant. N utilisez pas du verre fissuré. Produits chimiques N utilisez jamais un flacon de réactif qui ne porte pas d étiquette ou qui n est pas correctement identifié. Ne sentez, n inhalez, ne goûtez et ne touchez jamais les produits chimiques. Ne pipetez jamais avec la bouche. Mettez des gants et lavez-vous souvent les mains si vous utilisez des produits toxiques ou corrosifs. S ils entrent en contact avec vos yeux, rincez-les immédiatement avec de l eau abondante. N approchez pas des récipients contenant des réactifs d une flamme. Ne chauffez pas des liquides inflammables. Transportez les flacons en les tenant par le fond, en aucun cas par l ouverture. Élimination des déchets Déposez dans des conteneurs dûment identifiés prévus à cet effet les déchets solides et les déchets liquides. En cas de doute, consultez votre professeur. Ne jetez jamais des résidus solides dans l évier. Rappel En cas d accident, prévenez immédiatement le professeur. PRÉCAUTIONS SPÉCIFIQUES À PRENDRE LORS DE CET ATELIER SDS : toxique en cas d ingestion, d inhalation et de contact avec la peau. Tris-Base : toxique en cas d ingestion, d inhalation et de contact avec la peau. Irritant. HCl : toxique en cas d ingestion, d inhalation et de contact avec la peau. Irritant et corrosif. Acétate de sodium : toxique en cas d ingestion, d inhalation et de contact avec la peau. Proteinase K : toxique en cas d ingestion, d inhalation et de contact avec la peau. Éthanol : inflammable. 13

14 Annexe 2 Procédures pour la préparation des solutions Recette pour la solution de lyse (vu la toxicité de certains des composés à des concentrations élevées, nous recommandons la préparation à l avance de cette solution par le professeur. Porte un masque pendant la préparation de la solution. Une fois la dissolution faite, le port du masque n est plus nécessaire). Pour 50 ml : - NaCl = 0,292 g - SDS = 5 ml 10 % SDS - Tris HCl = 2,5 ml ph 8 Recette pour le NaAc Pour 40 ml : - 9,84 g de NaAc. Ajoute du HCl jusqu à atteindre un ph de 5,2. Recette pour la protéinase K μg/ml (garder congelé) Annexe 3 Références pour l achat des réactifs et une partie du matériel nécessaire NOM RÉFÉRENCE FABRICANT NaCl Fluka-Sigma SDS Fluka-Sigma Tris-Base Fluka-Sigma HCl Sigma-Aldrich NaAc S G Sigma-Aldrich Protéinase K P mg Sigma Éthanol Panreac Anse de culture stérile Sanilabo 14

15 Continuez vos recherches sur Xplore Health! Chercheurs ayant collaboré aux contenus : Lorena Valverde, chercheuse à l Université de Barcelone ÉLABORÉ PAR FINANCÉ PAR Ces travaux sont protégés par un contrat Creative Commons Paternité - Pas d'utilisation Commerciale Partage des Conditions Initiales à l'identique 3.0. Pour voir une copie de la licence, consultez le site 15