Pour l'obtention du Doctorat en Pharmacie

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1 UNIVERSITE MOHAMMED V FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE -RABAT- ANNEE: 200 THESE N : 64 Application des empreintes genetiques dans l'etablissement de la filiation parentale: A propos de 16 dossiers analyses a l'inh de rabat THESE Présentée et soutenue publiquement le :.. PAR Mlle Amira HORCHANI Née le 13 Novembre 1983 à Sidi Bouzid (Tunisie) Pour l'obtention du Doctorat en Pharmacie MOTS CLES Filiation Empreintes génétiques Biologie moléculaire. Mr. O. CHOKAIRI Professeur d'histologie-embryologie Mr. A. SEFIANI Professeur de Génétique Mr. A. BELMEKKI Professeur Agrégé d'hématologie Mr. L. BALOUCH Professeur Agrégé de Biochimie JURY PRESIDENT RAPPORTEUR JUGES

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3 UNIVERSITE MOHAMMED V- SOUISSI FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE - RABAT DOYENS HONORAIRES : : Docteur Ahdelmalek FARAJ : Professeur Abdellatif BERBICH : Professeur Bachir LAZRAK : Professeur Taieb CHKILI : Professeur Mohamed Tahar ALAOUI : Professeur Abdelmajid BELMAHI ADMINISTRATION : Doyen : Professeur Najia HAJJAJ Vice Doyen chargé des Affaires Académiques et Estudiantines Professeur Mohammed JIDDANE Vice Doyen chargé de la Recherche et de la Coopération Professeur Naima LAHBABI-AMRANI Vice Doyen chargé des Affaires Spécifiques à la Pharmacie Professeur Yahia CHERRAH Secrétaire Général : Monsieur Mohammed BENABDELLAH PROFESSEURS : Décembre Pr. TOUNSI Abdelkader Pathologie Chirurgicale Février, Septembre, Décembre Pr. ARCHANE My Idriss* Pathologie Médicale 3. Pr. BENOMAR Mohammed Cardiologie 4. Pr. CHAOUI Abdellatif Gynécologie Obstétrique 5. Pr. CHKILI Taieb Neuropsychiatrie Janvier et Décembre Pr. HASSAR Mohamed Pharmacologie Clinique Février Pr. AGOUMI Abdelaziz Parasitologie 8. Pr. BENKIRANE ép. AGOUMI Najia Hématologie 9. Pr. EL BIED ép. IMANI Farida Radiologie Février Mars et Novembre Pr. ARHARBI Mohamed Cardiologie 11. Pr. SLAOUI Abdelmalek Anesthésie Réanimation Mars Pr. LAMDOUAR ép. BOUAZZAOUI Naima Pédiatrie Mars, Avril et Septembre Pr. EL KHAMLICHI Abdeslam Neurochirurgie 14. Pr. MESBAHI Redouane Cardiologie

4 Mai et Octobre Pr. BENOMAR Said* Anatomie Pathologique 16. Pr. BOUZOUBAA Abdelmajid Cardiologie 17. Pr. EL MANOUAR Mohamed Traumatologie-Orthopédie 18. Pr. HAMMANI Ahmed* Cardiologie 19. Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajih Chirurgie Cardio-Vasculaire 20. Pr. SBIHI Ahmed Anesthésie Réanimation 21. Pr. TAOBANE Hamid* Chirurgie Thoracique Mai et Novembre Pr. ABROUQ Ali* Oto-Rhino-Laryngologie 23. Pr. BENOMAR M hammed Chirurgie-Cardio-Vasculaire 24. Pr. BENSOUDA Mohamed Anatomie 25. Pr. BENOSMAN Abdellatif Chirurgie Thoracique 26. Pr. CHBICHEB Abdelkrim Biophysique 27. Pr. JIDAL Bouchaib* Chirurgie Maxillo-faciale 28. Pr. LAHBABI ép. AMRANI Naïma Physiologie Novembre Pr. ALAOUI TAHIRI Kébir* Pneumo-phtisiologie 30. Pr. BALAFREJ Amina Pédiatrie 31. Pr. BELLAKHDAR Fouad Neurochirurgie 32. Pr. HAJJAJ ép. HASSOUNI Najia Rhumatologie 33. Pr. SRAIRI Jamal-Eddine Cardiologie Décembre Pr. BOUCETTA Mohamed* Neurochirurgie 35. Pr. EL OUEDDARI Brahim El Khalil Radiothérapie 36. Pr. MAAOUNI Abdelaziz Médecine Interne 37. Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajdi Anesthésie -Réanimation 38. Pr. NAJI M Barek * Immuno-Hématologie 39. Pr. SETTAF Abdellatif Chirurgie Novembre et Décembre Pr. BENJELLOUN Halima Cardiologie 41. Pr. BENSAID Younes Pathologie Chirurgicale 42. Pr. EL ALAOUI Faris Moulay El Mostafa Neurologie 43. Pr. IHRAI Hssain * Stomatologie et Chirurgie Maxillo-Faciale 44. Pr. IRAQI Ghali Pneumo-phtisiologie 45. Pr. KZADRI Mohamed Oto-Rhino-laryngologie Janvier, Février et Décembre Pr. AJANA Ali Radiologie 47. Pr. AMMAR Fanid Pathologie Chirurgicale 48. Pr. CHAHED OUAZZANI ép.taobane Houria Gastro-Entérologie 49. Pr. EL FASSY FIHRI Mohamed Taoufiq Pneumo-phtisiologie 50. Pr. EL HAITEM Naïma Cardiologie 51. Pr. EL MANSOURI Abdellah* Chimie-Toxicologie Expertise 52. Pr. EL YAACOUBI Moradh Traumatologie Orthopédie 53. Pr. ESSAID EL FEYDI Abdellah Gastro-Entérologie 54. Pr. LACHKAR Hassan Médecine Interne

5 55. Pr. OHAYON Victor* Médecine Interne 56. Pr. YAHYAOUI Mohamed Neurologie Décembre Pr. BENHMAMOUCH Mohamed Najib Chirurgie Pédiatrique 58. Pr. DAFIRI Rachida Radiologie 59. Pr. FAIK Mohamed Urologie 60. Pr. FIKRI BEN BRAHIM Noureddine Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène 61. Pr. HERMAS Mohamed Traumatologie Orthopédie 62. Pr. TOULOUNE Farida* Médecine Interne Décembre 1989 Janvier et Novembre Pr. ABIR ép. KHALIL Saadia Cardiologie 64. Pr. ACHOUR Ahmed* Chirurgicale 65. Pr. ADNAOUI Mohamed Médecine Interne 66. Pr. AOUNI Mohamed Médecine Interne 67. Pr. AZENDOUR BENACEUR* Oto-Rhino-Laryngologie 68. Pr. BENAMEUR Mohamed* Radiologie 69. Pr. BOUKILI MAKHOUKHI Abdelali Cardiologie 70. Pr. CHAD Bouziane Pathologie Chirurgicale 71. Pr. CHKOFF Rachid Pathologie Chirurgicale 72. Pr. FARCHADO Fouzia ép.benabdellah Pédiatrique 73. Pr. HACHIM Mohammed* Médecine-Interne 74. Pr. HACHIMI Mohamed Urologie 75. Pr. KHARBACH Aîcha Gynécologie -Obstétrique 76. Pr. MANSOURI Fatima Anatomie-Pathologique 77. Pr. OUAZZANI Taïbi Mohamed Réda Neurologie 78. Pr. SEDRATI Omar* Dermatologie 79. Pr. TAZI Saoud Anas Anesthésie Réanimation 80. Pr. TERHZAZ Abdellah* Ophtalmologie Février Avril Juillet et Décembre Pr. AL HAMANY Zaîtounia Anatomie-Pathologique 82. Pr. ATMANI Mohamed* Anesthésie Réanimation 83. Pr. AZZOUZI Abderrahim Anesthésie Réanimation 84. Pr. BAYAHIA ép. HASSAM Rabéa Néphrologie 85. Pr. BELKOUCHI Abdelkader Chirurgie Générale 86. Pr. BENABDELLAH Chahrazad Hématologie 87. Pr. BENCHEKROUN BELABBES Abdelatif Chirurgie Générale 88. Pr. BENSOUDA Yahia Pharmacie galénique 89. Pr. BERRAHO Amina Ophtalmologie 90. Pr. BEZZAD Rachid Gynécologie Obstétrique 91. Pr. CHABRAOUI Layachi Biochimie et Chimie 92. Pr. CHANA El Houssaine* Ophtalmologie 93. Pr. CHERRAH Yahia Pharmacologie 94. Pr. CHOKAIRI Omar Histologie Embryologie 95. Pr. FAJRI Ahmed* Psychiatrie 96. Pr. JANATI Idrissi Mohamed* Chirurgie Générale 97. Pr. KHATTAB Mohamed Pédiatrie 98. Pr. NEJMI Maati Anesthésie-Réanimation

6 99. Pr. OUAALINE Mohammed* Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène 100. Pr. SOULAYMANI ép.bencheikh Rachida Pharmacologie 101. Pr. TAOUFIK Jamal Chimie thérapeutique Décembre Pr. AHALLAT Mohamed Chirurgie Générale 103. Pr. BENOUDA Amina Microbiologie 104. Pr. BENSOUDA Adil Anesthésie Réanimation 105. Pr. BOUJIDA Mohamed Najib Radiologie 106. Pr. CHAHED OUAZZANI Laaziza Gastro-Entérologie 107. Pr. CHAKIR Noureddine Radiologie 108. Pr. CHRAIBI Chafiq Gynécologie Obstetrique 109. Pr. DAOUDI Rajae Ophtalmologie 110. Pr. DEHAYNI Mohamed* Gynécologie Obstétrique 111. Pr. EL HADDOURY Mohamed Anesthésie Réanimation 112. Pr. EL OUAHABI Abdessamad Neurochirurgie 113. Pr. FELLAT Rokaya Cardiologie 114. Pr. GHAFIR Driss* Médecine Interne 115. Pr. JIDDANE Mohamed Anatomie 116. Pr. OUAZZANI TAIBI Med Charaf Eddine Gynécologie Obstétrique 117. Pr. TAGHY Ahmed Chirurgie Générale 118. Pr. ZOUHDI Mimoun Microbiologie Mars Pr. AGNAOU Lahcen Ophtalmologie 120. Pr. AL BAROUDI Saad Chirurgie Générale 121. Pr. ARJI Moha* Anesthésie Réanimation 122. Pr. BENCHERIFA Fatiha Ophtalmologie 123. Pr. BENJAAFAR Noureddine Radiothérapie 124. Pr. BENJELLOUN Samir Chirurgie Générale 125. Pr. BENRAIS Nozha Biophysique 126. Pr. BOUNASSE Mohammed* Pédiatrie 127. Pr. CAOUI Malika Biophysique 128. Pr. CHRAIBI Abdelmjid Endocrinologie et Maladies Métabolique 129. Pr. EL AMRANI ép. AHALLAT Sabah Gynécologie Obstétrique 130. Pr. EL AOUAD Rajae Immunologie 131. Pr. EL BARDOUNI Ahmed Traumato Orthopédie 132. Pr. EL HASSANI My Rachid Radiologie 133. Pr. EL IDRISSI LAMGHARI Abdennaceur Médecine Interne 134. Pr. EL KIRAT Abdelmajid* Chirurgie Cardio- Vasculaire 135. Pr. ERROUGANI Abdelkader Chirurgie Générale 136. Pr. ESSAKALI Malika Immunologie 137. Pr. ETTAYEBI Fouad Chirurgie Pédiatrique 138. Pr. HADRI Larbi* Médecine Interne 139. Pr. HDA Ali* Médecine Interne 140. Pr. HASSAM Badredine Dermatologie 141. Pr. IFRINE Lahssan Chirurgie Générale 142. Pr. JELTHI Ahmed Anatomie Pathologique 143. Pr. MAHFOUD Mustapha Traumatologie Orthopédie 144. Pr. MOUDENE Ahmed* Traumatologie Orthopédie 145. Pr. MOSSEDDAQ Rachid* Neurologie

7 146. Pr. OULBACHA Said Chirurgie Générale 147. Pr. RHRAB Brahim Gynécologie Obstétrique 148. Pr. SENOUCI ép. BELKHADIR Karima Dermatologie 149. Pr. SLAOUI Anas Chirurgie Cardio-vasculaire Mars Pr. ABBAR Mohamed* Urologie 151. Pr. ABDELHAK M barek Chirurgie - Pédiatrique 152. Pr. BELAIDI Halima Neurologie 153. Pr. BARHMI Rida Slimane Gynécologie Obstétrique 154. Pr. BENTAHILA Abdelali Pédiatrie 155. Pr. BENYAHIA Mohammed Ali Gynécologie -Obstétrique 156. Pr. BERRADA Mohamed Saleh Traumatologie -Orthopédie 157. Pr. CHAMI Ilham Radiologie 158. Pr. CHERKAOUI Lalla Ouafae Ophtalmologie 159. Pr. EL ABBADI Najia Neurochirurgie 160. Pr. HANINE Ahmed* Radiologie 161. Pr. JALIL Abdelouahed Chirurgie Générale 162. Pr. LAKHDAR Amina Gynécologie Obstétrique 163. Pr. MOUANE Nezha Pédiatrie Mars Pr. ABOUQUAL Redouane Réanimation Médicale 165. Pr. AMRAOUI Mohamed Chirurgie Générale 166. Pr. BAIDADA Abdelaziz Gynécologie Obstétrique 167. Pr. BARGACH Samir Gynécologie Obstétrique 168. Pr. BELLAHNECH Zakaria Urologie 169. Pr. BEDDOUCHE Amoqrane* Urologie 170. Pr. BENAZZOUZ Mustapha Gastro-Entérologie 171. Pr. CHAARI Jilali* Médecine Interne 172. Pr. DIMOU M'barek* Anesthésie Réanimation 173. Pr. DRISSI KAMILI Mohammed Nordine* Anesthésie Réanimation 174. Pr. EL MESNAOUI Abbes Chirurgie Générale 175. Pr. ESSAKALI HOUSSYNI Leila Oto-Rhino-Laryngologie 176. Pr. FERHATI Driss Gynécologie Obstétrique 177. Pr. HASSOUNI Fadil Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène 178. Pr. HDA Abdelhamid* Cardiologie 179. Pr. IBEN ATTYA ANDALOUSSI Ahmed Urologie 180. Pr. IBRAHIMY Wafaa Ophtalmologie 182. Pr. BENOMAR ALI Neurologie 183. Pr. BOUGTAB Abdesslam Chirurgie Générale 184. Pr. ER RIHANI Hassan Oncologie Médicale 185. Pr. EZZAITOUNI Fatima Néphrologie 186. Pr. KABBAJ Najat Radiologie 187. Pr. LAZRAK Khalid (M) Traumatologie Orthopédie 188. Pr. OUTIFA Mohamed* Gynécologie Obstétrique Décembre Pr. AMIL Touriya* Radiologie 190. Pr. BELKACEM Rachid Chirurgie Pédiatrie 191. Pr. BELMAHI Amin Chirurgie réparatrice et plastique

8 192. Pr. BOULANOUAR Abdelkrim Ophtalmologie 193. Pr. EL ALAMI EL FARICHA EL Hassan Chirurgie Générale 194. Pr. EL MELLOUKI Ouafae* Parasitologie 195. Pr. GAMRA Lamiae Anatomie Pathologique 196. Pr. GAOUZI Ahmed Pédiatrie 197. Pr. MAHFOUDI M barek* Radiologie 198. Pr. MOHAMMADINE EL Hamid Chirurgie Générale 199. Pr. MOHAMMADI Mohamed Médecine Interne 200. Pr. MOULINE Soumaya Pneumo-phtisiologie 201. Pr. OUADGHIRI Mohamed Traumatologie Orthopédie 202. Pr. OUZEDDOUN Naima Néphrologie 203. Pr. ZBIR EL Mehdi* Cardiologie Novembre Pr. ALAMI Mohamed Hassan Gynécologie Obstétrique 205. Pr. BEN AMAR Abdesselem Chirurgie Générale 206. Pr. BEN SLIMANE Lounis Urologie 207. Pr. BIROUK Nazha Neurologie 208. Pr. BOULAICH Mohamed O.RL Pr. CHAOUIR Souad* Radiologie 210. Pr. DERRAZ Said Neurochirurgie 211. Pr. ERREIMI Naima Pédiatrie 212. Pr. FELLAT Nadia Cardiologie 213. Pr. GUEDDARI Fatima Zohra Radiologie 214. Pr. HAIMEUR Charki* Anesthésie Réanimation 215. Pr. KADDOURI Noureddine Chirurgie Pédiatrique 216. Pr. KANOUNI NAWAL Physiologie 217. Pr. KOUTANI Abdellatif Urologie 218. Pr. LAHLOU Mohamed Khalid Chirurgie Générale 219. Pr. MAHRAOUI CHAFIQ Pédiatrie 220. Pr. NAZZI M barek* Cardiologie 221. Pr. OUAHABI Hamid* Neurologie 222. Pr. SAFI Lahcen* Anesthésie Réanimation 223. Pr. TAOUFIQ Jallal Psychiatrie 224. Pr. YOUSFI MALKI Mounia Gynécologie Obstétrique Novembre Pr. BENKIRANE Majid* Hématologie 226. Pr. KHATOURI Ali* Cardiologie 227. Pr. LABRAIMI Ahmed* Anatomie Pathologique Novembre Pr. AFIFI RAJAA Gastro - Entérologie 229. Pr. AIT BENASSER MOULAY Ali* Pneumo-phtisiologie 230. Pr. ALOUANE Mohammed* Oto- Rhino- Laryngologie 231. Pr. LACHKAR Azouz Urologie 232. Pr. LAHLOU Abdou Traumatologie Orthopédie 233. Pr. MAFTAH Mohamed* Neurochirurgie 234. Pr. MAHASSINI Najat Anatomie Pathologique 235. Pr. MDAGHRI ALAOUI Asmae Pédiatrie 236. Pr. MANSOURI Abdelaziz* Neurochirurgie 237. Pr. NASSIH Mohamed* Stomatologie Et Chirurgie Maxillo Faciale

9 238. Pr. RIMANI Mouna Anatomie Pathologique 239. Pr. ROUIMI Abdelhadi Neurologie Janvier Pr. ABID Ahmed* Pneumo-phtisiologie 241. Pr. AIT OUMAR Hassan Pédiatrie 242. Pr. BENCHERIF My Zahid Ophtalmologie 243. Pr. BENJELLOUN DAKHAMA Badr.Sououd Pédiatrie 244. Pr. BOURKADI Jamal-Eddine Pneumo-phtisiologie 245. Pr. CHAOUI Zineb Ophtalmologie 246. Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Al Montacer Chirurgie Générale 247. Pr. ECHARRAB El Mahjoub Chirurgie Générale 248. Pr. EL FTOUH Mustapha Pneumo-phtisiologie 249. Pr. EL MOSTARCHID Brahim* Neurochirurgie 250. Pr. EL OTMANYAzzedine Chirurgie Générale 251. Pr. GHANNAM Rachid Cardiologie 252. Pr. HAMMANI Lahcen Radiologie 253. Pr. ISMAILI Mohamed Hatim Anesthésie-Réanimation 254. Pr. ISMAILI Hassane* Traumatologie Orthopédie 255. Pr. KRAMI Hayat Ennoufouss Gastro-Entérologie 256. Pr. MAHMOUDI Abdelkrim* Anesthésie-Réanimation 257. Pr. TACHINANTE Rajae Anesthésie-Réanimation 258. Pr. TAZI MEZALEK Zoubida Médecine Interne Novembre Pr. AIDI Saadia Neurologie 260. Pr. AIT OURHROUIL Mohamed Dermatologie 261. Pr. AJANA Fatima Zohra Gastro-Entérologie 262. Pr. BENAMR Said Chirurgie Générale 263. Pr. BENCHEKROUN Nabiha Ophtalmologie 264. Pr. BOUSSELMANE Nabile* Traumatologie Orthopédie 265. Pr. BOUTALEB Najib* Neurologie 266. Pr. CHERTI Mohammed Cardiologie 267. Pr. ECH-CHERIF EL KETTANI Selma Anesthésie-Réanimation 268. Pr. EL HASSANI Amine Pédiatrie 269. Pr. EL IDGHIRI Hassan Oto-Rhino-Laryngologie 270. Pr. EL KHADER Khalid Urologie 271. Pr. EL MAGHRAOUI Abdellah* Rhumatologie 272. Pr. GHARBI Mohamed El Hassan Endocrinologie et Maladies Métaboliques 273. Pr. HSSAIDA Rachid* Anesthésie-Réanimation 274. Pr. MANSOURI Aziz Radiothérapie 275. Pr. OUZZANI CHAHDI Bahia Ophtalmologie 276. Pr. RZIN Abdelkader* Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale 277. Pr. SEFIANI Abdelaziz Génétique 278. Pr. ZEGGWAGH Amine Ali Réanimation Médicale PROFESSEURS AGREGES : Décembre Pr. ABABOU Adil Anesthésie-Réanimation 280. Pr. AOUAD Aicha Cardiologie 281. Pr. BALKHI Hicham* Anesthésie-Réanimation 282. Pr. BELMEKKI Mohammed Ophtalmologie

10 283. Pr. BENABDELJLIL Maria Neurologie 284. Pr. BENAMAR Loubna Néphrologie 285. Pr. BENAMOR Jouda Pneumo-phtisiologie 286. Pr. BENELBARHDADI Imane Gastro-Entérologie 287. Pr. BENNANI Rajae Cardiologie 288. Pr. BENOUACHANE Thami Pédiatrie 289. Pr. BENYOUSSEF Khalil Dermatologie 290. Pr. BERRADA Rachid Gynécologie Obstétrique 291. Pr. BEZZA Ahmed* Rhumatologie 292. Pr. BOUCHIKHI IDRISSI Med Larbi Anatomie 293. Pr. BOUHOUCH Rachida Cardiologie 294. Pr. BOUMDIN El Hassane* Radiologie 295. Pr. CHAT Latifa Radiologie 296. Pr. CHELLAOUI Mounia Radiologie 297. Pr. DAALI Mustapha* Chirurgie Générale 298. Pr. DRISSI Sidi Mourad* Radiologie 299. Pr. EL HAJOUI Ghziel Samira Gynécologie Obstétrique 300. Pr. EL HIJRI Ahmed Anesthésie-Réanimation 301. Pr. EL MAAQILI Moulay Rachid Neuro-Chirurgie 302. Pr. EL MADHI Tarik Chirurgie-Pédiatrique 303. Pr. EL MOUSSAIF Hamid Ophtalmologie 304. Pr. EL OUNANI Mohamed Chirurgie Générale 305. Pr. EL QUESSAR Abdeljlil Radiologie 306. Pr. ETTAIR Said Pédiatrie 307. Pr. GAZZAZ Miloudi* Neuro-Chirurgie 308. Pr. GOURINDA Hassan Chirurgie-Pédiatnique 309. Pr. HRORA Abdelmalek Chirurgie Générale 310. Pr. KABBAJ Saad Anesthésie-Réanimation 311. Pr. KABIRI EL Hassane* Chirurgie Thoracique 312. Pr. LAMRANI Moulay Omar Traumatologie Orthopédie 313. Pr. LEKEHAL Brahim Chirurgie Vasculaire Périphérique 314. Pr. MAHASSIN Fattouma* Médecine Interne 315. Pr. MEDARHRI Jalil Chirurgie Générale 316. Pr. MIKDAME Mohammed* Hématologie Clinique 317. Pr. MOHSINE Raouf Chirurgie Générale 318. Pr. NABIL Samira Gynécologie Obstétrique 319. Pr. NOUINI Yassine Urologie 320. Pr. OUALIM Zouhir* Néphrologie 321. Pr. SABBAH Farid Chirurgie Générale 322. Pr. SEFIANI Yasser Chirurgie Vasculaire Périphérique 323. Pr. TAOUFIQ BENCHEKROUN Soumia Pédiatrie 324. Pr. TAZI MOUKHA Karim Urologie Décembre Pr. AL BOUZIDI Abderrahmane* Anatomie Pathologique 326. Pr. AMEUR Ahmed* Urologie 327. Pr. AMRI Rachida Cardiologie 328. Pr. AOURARH Aziz* Gastro-Entérologie 329. Pr. BAMOU Youssef * Biochimie-Chimie 330. Pr. BELGHITI Laila Gynécologie Obstétrique 331. Pr. BELMEJDOUB Ghizlene* Endocrinologie et Maladies Métaboliques 332. Pr. BENBOUAZZA Karima Rhumatologie 333. Pr. BENZEKRI Laila Dermatologie

11 334. Pr. BENZZOUBEIR Nadia* Gastro Enterologie 335. Pr. BERADY Samy* Médecine Interne 336. Pr. BERNOUSSI Zakiya Anatomie Pathologique 337. Pr. BICHRA Mohamed Zakarya Psychiatrie 338. Pr. CHOHO Abdelkrim * Chirurgie Générale 339. Pr. CHKIRATE Bouchra Pédiatrie 340. Pr. EL ALAMI EL FELLOUS Sidi Zouhair Chirurgie Pédiatrique 341. Pr. EL ALJ Haj Ahmcd Urologie 342. Pr. EL BARNOUSSI Leila Gynécologie Obstétrique 343. Pr. EL HAOURI Mohamed * Dermatologie 344. Pr. EL MANSARI Omar* Chirurgie Générale 345. Pr. ES-SADEL Abdelhamid Chirurgie Générale 346. Pr. FILALI ADIB Abdelhai Gynécologie Obstétrique 347. Pr. HADDOUR Leila Cardiologie 348. Pr. HAJJI Zakia Ophtalmologie 349. Pr. IKEN Ali Urologie 350. Pr. ISMAEL Farid Traumatologie Orthopédie 351. Pr. JAAFAR Abdeloihab* Traumatologie Orthopédie 352. Pr. KRIOULE Yamina Pédiatrie 353. Pr. LAGHMARI Mina Ophtalmologie 354. Pr. MABROUK Hfid* Traumatologie Orthopédie 355. Pr. MOUSSAOUI RAHALI Driss* Gynécologie Obstétrique 356. Pr. MOUSTAGHFIR Abdelhamid* Cardiologie 357. Pr. MOUSTAINE My Rachid Traumatologie Orthopédie 358. Pr. NAITLHO Abdelhamid* Médecine Interne 359. Pr. OUJILAL Abdelilah Oto-Rhino-Laryngologie 360. Pr. RACHID Khalid * Traumatologie Orthopédie 361. Pr. RAISS Mohamed Chirurgie Générale 362. Pr. RGUIBI IDRISSI Sidi Mustapha* Pneumo-phtisiologie 363. Pr. RHOU Hakima Néphrologie 364. Pr. RKIOUAK Fouad* Endocrinologie et Maladies Métaboliques 365. Pr. SIAH Samir * Anesthésie Réanimation 366. Pr. THIMOU Amal Pédiatrie 367. Pr. ZENTAR Aziz* Chirurgie Générale 368. Pr. ZRARA Ibtisam* Anatomie Pathologique Janvier Pr. ABDELLAH El Hassan Ophtalmologie 370. Pr. AMRANI Mariam Anatomie Pathologique 371. Pr. BENBOUZID Mohammed Anas Oto-Rhino-Laryngologie 372. Pr. BENKIRANE Ahmed* Gastro-Entérologie 373. Pr. BENRAMDANE Larbi* Chimie Analytique 374. Pr. BOUGHALEM Mohamed* Anesthésie Réanimation 375. Pr. BOULAADAS Malik Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale 376. Pr. BOURAZZA Ahmed* Neurologie 377. Pr. CHERRADI Nadia Anatomie Pathologique 378. Pr. EL FENNI Jamal* Radiologie 379. Pr. EL HANCHI Zaki Gynécologie Obstétrique 380. Pr. EL KHORASSANI Mohamed Pédiatrie 381. Pr. EL YOUNASSI Badreddine* Cardiologie 382. Pr. HACHI Hafid Chirurgie Générale 383. Pr. JABOUIRIK Fatima Pédiatrie 384. Pr. KARMANE Abdelouahed Ophtalmologie

12 385. Pr. KHABOUZE Samira Gynécologie Obstétrique 386. Pr. KHARMAZ Mohamed Traumatologie Orthopédie 387. Pr. LEZREK Mohammed* Urologie 388. Pr. MOUGHIL Said Chirurgie Cardio-Vasculaire 389. Pr. NAOUMI Asmae* Ophtalmologie 390. Pr. SAADI Nozha Gynécologie Obstétrique 391. Pr. SASSENOU Ismail* Gastro-Entérologie 392. Pr. TARIB Abdelilah* Pharmacie Clinique 393. Pr. TIJAMI Fouad Chirurgie Générale 394. Pr. ZARZUR Jamila Cardiologie Janvier Pr. ABBASSI Abdelah Chirurgie Réparatrice et Plastique 396. Pr. AL KANDRY Sif Eddine* Chirurgie Générale 397. Pr. ALAOUI Ahmed Essaid Microbiologie 398. Pr. ALLALI fadoua Rhumatologie 399. Pr. AMAR Yamama Néphrologie 400. Pr. AMAZOUZI Abdellah Ophtalmologie 401. Pr. AZIZ Noureddine* Radiologie 402. Pr. BAHIRI Rachid Rhumatologie 403. Pr. BARAKAT Amina Pédiatrie 404. Pr. BENHALIMA Hanane Stomatologie et Chirurgie Maxillo Faciale 405. Pr. BENHARBIT Mohamed Ophtalmologie 406. Pr. BENYASS Aatif Cardiologie 407. Pr. BERNOUSSI Abdelghani Ophtalmologie 408. Pr. BOUKALATA Salwa Radiologie 409. Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Mohamed Ophtalmologie 410. Pr. DOUDOUH Abderrahim* Biophysique 411. Pr. EL HAMZAOUI Sakina Microbiologie 412. Pr. HAJJI Leila Cardiologie 413. Pr. HESSISSEN Leila Pédiatrie 414. Pr. JIDAL Mohamed* Radiologie 415. Pr. KARIM Abdelouahed Ophtalmologie 416. Pr. KENDOUSSI Mohamed* Cardiologie 417. Pr. LAAROUSSI Mohamed Chirurgie Cardio Vasculaire 418. Pr. LYACOUBI Mohammed Parasitologie 419. Pr. NIAMANE Radouane* Rgumatologie 420. Pr. RAGALA Abdelhak Gynécologie Obstétrique 421. Pr. REGRAGUI Asmaa Anatomie Pathologique 422. Pr. SBIHI Souad Histo Embryologie Cytogénétique 423. Pr. TNACHERI OUAZZANI Btissam Ophtalmologie 424. Pr. ZERAIDI Najia Gynécologie Obstétrique Avril Pr. ACHEMLAL Lahsen* Rhumatologie 426. Pr. AFIFI Yasser Dermatologie 427. Pr. AKJOUJ Said* Radiologie 428. Pr. BELGNAOUI Fatima Zahra Dermatologie 429. Pr. BELMEKKI Abdelkader* Hematologie 430. Pr. BENCHEIKH Razika O.R.L 431. Pr. BIYI Abdelhamid* Biophysique 432. Pr. BOUHAFS Mohamed El Amine Chirurgie Pédiatrique

13 433. Pr. BOULAHYA Abdellatif* Chirurgie Cardio-Vasculaire 434. Pr. CHEIKHAOUI Younes Chirurgie Cardio-Vasculaire 435. Pr. CHENGUETI ANSARI Anas Gynécologie Obstétrique 436. Pr. DOGHMI Nawal Cardiologie 437. Pr. ESSAMRI Wafaa Gastro-Entérologie 438. Pr. FELLAT Ibtissam Cardiologie 439. Pr. FAROUDY Mamoun Anesthésie Réanimation 440. Pr. GHADOUANE Mohammed* Urologie 441. Pr. HARMOUCHE Hicham Médecine Interne 442. Pr. HNAFI Sidi Mohamed* Anesthésie Réanimation 443. Pr. IDRISS LAHLOU Amine Microbiologie 444. Pr. JROUNDI Laila Radiologie 445. Pr. KARMOUNI Tariq Urologie 446. Pr. KILI Amina Pédiatrie 447. Pr. KISRA Hassan Psychiatrie 448. Pr. KISRA Mounir Chirurgie Pédiatrique 449. Pr. KHARCHAFI Aziz* Médecine Interne 450. Pr. LMIMOUNI Badreddine* Parasitologie 451. Pr. MANSOURI Hamid* Radiothérapie 452. Pr. NAZIH Naoual O.R.L 453. Pr; OUANASS Abderrazzak Psychiatrie 454. Pr. SAFI Soumaya* Endocrinologie 455. Pr. SEKKAT Fatima Zahra Psychiatrie 456. Pr. SEFIANI Sana Anatomie Pathologique 457. Pr. SOUALHI Mouna Pneumo-Phtisiologie 458. Pr. ZAHRAOUI Rachida Pneumo-Phtisiologie ENSEIGNANTS SCIENTIFIQUES PROFESSEURS 1. Pr. ALAMI OUHABI Naima Biochimie 2. Pr. ALAOUI KATIM Pharmacologie 3. Pr. ALAOUI SLIMANI Lalla Naïma Histologie Embryologie 4. Pr. ANSAR M'hammed Chimie Organique et Pharmacie Chimique 5. Pr. BOUKLOUZE Abdelaziz Applications Pharmaceutiques 6. Pr. BOURJOUANE Mohamed Microbiologie 7. Pr. DRAOUI Mustapha Chimie Analytique 8. Pr. EL GUESSABI Lahcen Pharmacognosie 9. Pr. ETTAIB Abdelkader Zootechnie 10. Pr. FAOUZI Moulay El Abbes Pharmacologie 11. Pr. HMAMOUCHI Mohamed Chimie Organique 12. Pr. REDHA Ahlam Biochimie 13. Pr. TELLAL Saida* Biochimie 14. Pr. TOUATI Driss Pharmacognosie 15. Pr. ZELLOU Amina Chimie Organique * Enseignants Militaires

14 Dédicaces

15 A ma chère mère, Qui n a cessé de me supporter tout le long du chemin et dont l affection et la patience ne m ont jamais fait défaut. Qui m a indiqué la bonne voie en me rappelant que la volonté et la patience mèneront au chemin de réussite. Aucune dédicace ne saurait exprimer le respect, l amour et la reconnaissance que je vous porte, et rien ne saurait jamais compenser les sacrifices que vous avez consentis pour mon éducation. Vous trouveriez dans ce modeste travail le fruit de vos efforts et vos précieux conseils. Puisse dieu vous combler de santé, de bonheur et de prospérité, et vous accorde longue vie.

16 A ma plus fierté : Mon grand frère Malek, Qui m'a beaucoup soutenue et encouragée tout au long de mes études. Aucun mot ne saurit exprimer tout mon amour et toute ma gratitude. A mon père et mon frère Sofiane, Qui sont dans mon cœur et dans mes pensées tous les jours. A mes amis, Pour les meilleurs instants que nous avons passés ensemble, pour l affection que nous avons sentie, que nous serons amis pour la vie

17 Remerciements

18 En préambule à cette présente thèse, je souhaite présenter mes remerciements aux personnes qui m ont apporté leur aide durant l élaboration de mon sujet de fin d étude. Tout d abord, je témoigne mon respect le plus profond à Monsieur Saïd AMZAZI, Vice Doyen des Affaires Académiques et Pédagogiques à la faculté des sciences de Rabat, qui grâce à ses précieux conseils et ses directives, ce travail a pu finalement aboutir. Je remercie vivement le Professeur Abdelaziz SEFIANI, chef de Département de Génétique Médicale à l Institut National d Hygiène, pour la confiance qu il m a accordée en me léguant ce sujet et pour l encadrement et la bienveillance qu il a manifesté à mon égard durant ce travail. Je remercie également Messieurs les Professeurs Abdelkader BELMEKKI et L Lhousaine BALOUCH qui ont eu la gentillesse d'accepter de juger mon travail, ainsi qu à Monsieur Omar ChOKAIRI de présider ce jury.

19 Mes remerciements les plus vifs à : D r Fatiha ELKERCH qui a été toujours présent quand j en avais besoin et dont les remarques et les suggestions furent pour moi d une grande utilité pour l accomplissement de ce travail. Dr. Hicham El OSSMANI du Laboratoire Génétique de la Gendarmerie Royale de Rabat, pour m avoir aidé dans le calcul de la probabilité de paternité (W). Mr Mehdi BOUABDELLAH et Melle Kaoutar BENTAYEBI pour leur précieuse aide technique et qui m ont toujours fait bénéficier de leurs expériences.

20 LISTE DES ABREVIATIONS A ADN ADN mt ARN Art BET C CESEDA EDTA G HLA HVR INH Kb L.R Mb pb PCR RFLP SDS SLB SNP STR T TAE TE VNTR : Adénine : Acide Désoxyribonucléique : ADN mitochondrial : Acide Ribonucléique : Article : Bromure d Ethidium : Cytosine : Code de l Entrée et du Séjour des Etrangers et du Droit d Asile : Acide Etylène Diamine Tétracétique : Guanine : Human Leucocyte Antigen : Hyper Variable Regions : Institut National d Hygiène : Kilobase : Likelihood : Méga base : Paire de bases : Polymerase chain Reaction : Restriction Fragment Length Polymorphisms : Soduim Dédocyl Phosphate : Solution de Lyse des Blancs : Single Nucleotide Polymorphism : Short Tandem Repeat : Thymine : Tris Acétate EDTA : Tris EDTA Variable Number Tandem Repeat

21 LISTE DES TABLEAUX Tableau I Résultats obtenus lors d analyse de l ADN mt de la lignée des Habsburg Page : 33 Tableau II Les halogroupes T de l ADN mt trouvés chez la famille Romanov Page : 35 Tableau III Tableau IV Tableau V Tableau VI Tableau VII Tableau VIII Tableau X Tableau IX Les marqueurs microsatellites du chromosome Y de la lignée paternelle de Thomas Jefferson Loci du kit AmpFl STR SGM Plus Composants du kit d amplification AmpFl STR SGM Plus L échelle allelique et informations sur l'adn de Contrôle du kit AmpFl STR SGM Plus Loci du kit AmpFlSTR Profiler plus Composants du kit d amplification AmpFl STR Profiler plus L échelle allelique et informations sur l'adn de Contrôle du kit AmpFlSTR Profiler plus Fréquence allélique des 15 marqueurs STRs dans la population marocaine inclus dans le kit AmpFlSTR Identifiler PCR Page : 37 Page : 79 Page : 80 Page :81 Page :84 Page :85 Page :86 Page :118

22 LISTE DES FIGURES Figure 1 Génome Humain 23 Paires de chromosome+mtdna Page : 9 Figure 2 La double hélice d ADN Page : 10 Figure 3 Changement de base au niveau des sites de Restriction Page : 13 Figure 4 RFLP Sonde multilocus Page : 16 Figure 5 RFLP Sonde monolocus sonde D2S44 : HaeIII Page : 16 Figure 6 Nomenclature des STR Page : 19 Figure 7 Autosomes : Hérédité complète à partir des ancêtres Page : 20 Figure 8 Y-Chromosome : Hérédité de père en fils Page : 21 Figure 9 Y-STR permettent de déterminer des filiations dans le cas où le père est décédé Page : 22 Figure 10 Structure du chromosome Y humain. Page : 23 Figure 11 Structure du génome mitochondrial humain Page : 25 Figure 12 L ADN mitochondrial : Hérédité de mère à fille Page : 26 Figure 13 Exemples de séquences obtenues lors d analyse de l ADN mt Page : 28 Figure 14 Hétéroplasmie au niveau de la position Page : 28 Figure 15 Arbre généalogique de la lignée des Habsburg Page : 31 Figure 16 Arbre généalogique de la famille Romanov Page : 36 Figure 17 Méduse d ADN (agrégat blanchâtre) Page : 69 Figure 18 Analyse et principe de l amplification génétique (PCR) Page : 77 Figure 19 ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER Page :89 Figure 20 Description de l ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER Page :89 Figure 21. Figure 22 AmpFlSTR Blue, AmpFlSTR Green II, et AmpFlSTR Yellow Allelic Ladders utilisé dans la PCR Profiler plus (Applied Biosystems) et indiquant la désignation pour chaque allèle Echelle allélique (Allelic Ladder) contenant tous les allèles possibles pour chaque marqueur utilisé dans la PCR SGM Plus (Applied Biosystems) Page :90 Page :91

23 TABLE DES MATIERES Introduction... 1 Revue bibliographique... 5 I. L ADN : Structure et caractéristiques... 6 II. Méthodes d analyses des empreintes génétiques : Analyse du polymorphisme de l ADN II.1. Polymorphisme des fragments de restriction par la technique RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) II.2. Polymorphisme des marqueurs STR : autosomiques et sexuels (Y et X) II.3. Polymorphisme de l'adn mitochondrial III. L ADN au service de la filiation parentale III.1. Quelques cas historiques III.1.1. Affaire de Louis XVII III.1.2. Affaire de la famille Romanov III.1.3. Affaire de Thomas Jefferson III.2. Recherche d une filiation parentale III Paternité simple III.2.2. Recherche de la maternité III.2.3. Test d ADN de fratrie IV. Eléments de génétique de population IV.1. Analyses statistiques IV.2. Détermination des paramètres médicaux légaux IV.3. Indice de vraisemblance ou Likelihood Ratio (L.R)... 44

24 V. Aspects juridique et éthiques des tests de paternité V.1. Aspects juridiques V.2.1.Cas du Maroc V.2.2.Cas de la Tunisie V.2.3.Cas de la France V.2.Aspects éthiques VI. Assurance Qualité au sein des laboratoires d analyses d empreintes génétiques Matériels et méthodes I. Recueil des dossiers II. Prélèvements et échantillons biologiques II.1. Frottis buccal sur coton-tige II.2. Prélèvement sanguin III. Extraction et purification d ADN III.1. Extraction de l ADN III.1.1. Extraction à partir des globules blancs III.1.2. Extraction au sel III.1.3. Extraction au kit QIAGEN III.1.4. Extraction au kit DNA IQ Système-Database III. 2. Dosage et contrôle de la qualité de l ADN IV. Amplification d ADN par PCR IV.1. Différentes étapes d une PCR IV.2. Avantages, inconvénients et limites de la technique IV.3. Kits d amplifications utilisés à l INH IV AmpFlSTR SGM Plus PCR Amplification IV AmpFlSTR Profiler plus PCR Amplification... 84

25 IV- L électrophorèse capillaire en gel V- L obtention des profils STR Résultats et discussion : I.Présentation des dossiers II. Résultats : II.1. Tableaux récapitulatifs des résultats obtenus à l INH : 16 cas II.2. Exemples de Profils génotypiques Obtenus par le logiciel GenScan (Cas d inclusion et Cas d exclusion) II.3. Détermination de la probabilité de paternité (W) sans recours aux logiciels de calcul III. Discussion Conclusion et Perspectives Résumés Annexes Références bibliographiques

26 Introduction 1

27 Connaître sa filiation constitue l une des préoccupations majeures de chaque individu : elle assigne à chacun une place singulière dans un ordre généalogique, l inscrivant dans une histoire familiale, et elle conditionne l exercice de droits aussi élémentaires que celui de se voir attribuer un nom. Et ne s attachent pas seulement à la filiation des enjeux personnels et privés, la société et l état sont, eux aussi, hautement intéressés par l établissement de la filiation des personnes qui concourt à leur bon ordre. Dans ce contexte, les découvertes scientifiques ont permis de faire face aux divers problèmes rencontrés dans la société et ont rendu un service considérable à la justice notamment en contribuant à résoudre les problèmes de recherche de filiation. En effet, jusqu au début des années 80, la justice avait essentiellement recours à des analyses biologiques et sérologiques reposant sur des éléments phénotypiques : analyse des systèmes polymorphes tels que les systèmes Rhésus, ABO et HLA qui très vite se sont vus abandonnés car le degré de polymorphisme de ces différents systèmes est trop restreint pour permettre l identification formelle des individus. Ce n est qu en 1985, le biologiste anglais Alec JEFFREYS et ses collaborateurs ont proposé une nouvelle méthode d identification biologique hautement spécifique fondée sur l étude de l ADN appelée communément «Empreintes Génétiques». Le concept d empreintes génétiques repose sur un principe essentiel de la génétique : L UNICITE BIOLOGIQUE DES INDIVIDUS. Le degré élevé de variabilité observée au niveau du génome humain est le reflet de cette unicité. Cette variabilité peut être recherchée dans des régions codantes des gènes multialléliques mais la communauté scientifique a décidé d'utiliser des régions 2

28 n'apportant aucune information médicale sur l'individu. Ces régions non codantes, qui composent la grande majorité des génomes, contiennent certaines séquences répétitives dont le nombre de répétitions est propre à chaque individu (à l exception des vrais jumeaux) et transmis à la descendance tout en obéissant aux lois mendéliennes. La technique utilisée actuellement pour l étude de ces polymorphismes, est basée sur le principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction) qui permet de cibler la séquence étudiée sur l'adn et de l'amplifier. La révélation se fait sur un gel d'électrophorèse et peut être automatisée, ce qui rend direct et simple la lecture et l'interprétation des résultats. La puissance d'information apportée par les empreintes génétiques et la sensibilité des analyses ont entraîné la mise en place de comités d'éthique et l'élaboration d'une législation afin de délivrer un agrément à des personnes civiles ou morales qui seront seules habilitées à pratiquer ces analyses sur décision de justice. Au Maroc et depuis la mise en place du nouveau code de la famille, le Département de Génétique Médicale de l Institut National d Hygiène (INH) de Rabat a réalisé des analyses de recherche de paternité à la demande de plusieurs tribunaux du royaume. Mais cette activité a été suspendue en raison du vide juridique qui l encadre. C est pour cela qu on s intéresse uniquement dans cette présente thèse à une quinzaine de dossiers, relatifs à la recherche de filiation, traités de 2004 à Nous commençons alors par une revue bibliographique relative aux bases de génétique moléculaire utiles à la compréhension du reste des chapitres : En premier lieu, on s intéressera à la structure et les caractéristiques de la molécule d ADN qui lui permettant d être aujourd'hui l'un des outils les plus perfectionnés 3

29 de l'investigation judiciaire dans l établissement d une filiation. En second lieu, on détaillera les différentes méthodes employées dans l analyse de son polymorphisme, ainsi que les différents cas de paternité simples et de fratrie qu on peut rencontrer au cours d une recherche de filiation. Après on donnera un énoncé des éléments de génétique de population et les aspects éthiques et juridiques des tests de paternité qui ne peuvent être effectué que dans un cadre d Assurance Qualité au sein des laboratoires d analyses d empreintes génétiques. Ensuite, dans la partie (B) de Matériels et Méthodes, nous illustrons les différentes étapes d analyse d ADN nécessaires pour la réalisation des profils génétiques du trio : père présumé, l enfant et la mère. Dans la section (C) des Résultats et Discussion, nous présentons les différents dossiers traités ainsi que leurs résultats obtenus au Département de Génétique Médicale à l INH. L'ensemble des observations est ensuite discuté au regard des connaissances actuelles afin de dégager les différents problèmes rencontrés au cours d une telle recherche. Enfin dans la section (D), les conclusions mettront en évidence les perspectives. 4

30 Revue bibliographique 5

31 I. L ADN : Structure et caractéristiques L ADN est l'acronyme courant de la molécule d Acide DésoxyriboNucléique. Souvent décrite comme «l unité fondamentale de la vie» ou le «support matériel du génome» [1]. Elle est responsable pour le bon fonctionnement des cellules de notre corps. Ce support ne concerne qu'une petite partie de l'adn. En vue de l'identification génétique et de la recherche de parenté, nous examinons, pour établir un profil génétique, des fragments d'adn qui ne portent pas d'information directe. Ces fragments sont appelés segments d'adn non-codants [2]. La molécule d ADN est présente dans le noyau de la quasi totalité des cellules, à l'exception des globules rouges, ainsi que dans les mitochondries, organites cytoplasmiques qui jouent un rôle important dans les phénomènes de respiration et les réactions énergétiques de la cellule [figure 1]. L'expertise génétique se concentre prioritairement sur l'adn nucléaire mais l'adn mitochondrial peut également, on le verra plus loin, fournir des informations utiles bien que moins discriminantes [3]. On hérite de son ADN au moment de la conception. L'ovule fécondé renferme l'adn provenant du spermatozoïde du père et de l'ovule de la mère. La cellule originelle se subdivise ensuite continuellement de façon que chaque cellule du corps reproduise l'adn de cette union originelle [4]. L'ADN est donc identique dans chaque cellule, quelle que soit la partie du corps où il se trouve et il reste essentiellement le même de la conception jusqu'à la mort [5]. De structure bicaténaire, l ADN s'organise, dans les cellules somatiques, en vingt-trois paires de chromosomes dont vingt-deux paires de chromosomes 6

32 homologues et deux hétérochromosomes sexuels (génotype XX chez la femme, XY chez l'homme) (figure 1). Elucidée par Watson, Crick et Wilkins, la molécule d'adn est constituée d'un enchaînement de sucres-phosphates reliés à quatre bases: Adénine, Guanine, Cytosine, Thymine (A, G, C, T), ou nucléotides. Pour former chaque échelon de la double chaîne d'adn, ces quatre éléments de construction constituent des couples basiques ou «A» se trouve toujours lié à «T» et «G» à «C». L'ordre des bases sur la chaîne linéaire de nucléotides formant l'adn constitue sa séquence nucléotidique [4] (Figure 2). Certaines séquences sont polymorphes et peuvent prendre des formes différentes d un individu à l autre. La séquence complète de l'adn d'une cellule humaine formant le génome déroulé mesure 1,80 mètre et comporte environ 3 milliards de nucléotides [6]. La théorie généralement acceptée veut qu'il n'y ait pas, à l'exception des jumeaux homozygotes, deux personnes porteuses du même ADN. Mais il serait beaucoup trop long et coûteux de procéder, pour l'établissement d'une comparaison, à l'examen de la totalité de la chaîne contenue dans une cellule. Il convient donc de s'appuyer sur les ressources offertes par le polymorphisme de l'adn dont l expertise a recours pour la résolution d affaires civiles. En fait, il s agit de génotyper l enfant et le père supposé sur plusieurs loci polymorphes. Il y aura au moins un allèle qui correspond à chaque locus pour une possibilité de paternité. Dans ce cas-là, la probabilité de paternité est calculée en fonction de la fréquence allélique [7]. 7

33 Le polymorphisme de l ADN est traduit soit par une modification de la longueur d un fragment soit par celle de la séquence qui le constitue. On parle alors de polymorphisme de taille ou de polymorphisme de site. Les méthodes d analyse utilisées s intéressent principalement aux séquences répétitives polymorphes courtes appelées STRs ou «short tandem repeat»de l ADN nucléaire. Il suffit d analyser une dizaine de ces séquences pour discriminer un sujet parmi plusieurs milliards. Outre sa grande variabilité, la molécule d ADN est relativement stable et assez résistante aux effets de l environnement, permettant d analyser aussi bien un prélèvement frais qu un prélèvement décongelé (3). 8

34 Figure 1. Génome Humain 23 Paires de Chromosomes + mtdna [3] 9

35 (1) (2) Figure 2. La double hélice d ADN [4] (1): Les deux brins d ADN en forme de double hélice maintenus ensemble par une série de liaisons hydrogènes. Les bases doivent toujours s apparier de la façon qui suit : G-C ou A-T.L ordre défini de ces bases constitue la carte génétique propre à chaque individu. Outre cette complémentarité, les deux chaines sont orientées en sens opposé ce qui confère à la double hélice une structure antiparallèle. (2) : Le squelette de l ADN formé par les liaisons sucre-phosphate, est maintenu par des liaisons covalentes phosphodiesters entre les carbones 5 et 3 de deux désoxyriboses consécutifs. Tout au long de cette chaine les bases azotées sont greffées latéralement à raison d une base par sucre 10

36 II. Méthodes d analyses des empreintes génétiques : Analyse du polymorphisme d ADN : En épreuve de paternité, l'identification d'un individu par les différentes méthodes d analyse des empreintes génétiques repose actuellement sur l'étude de la transmission mendélienne des marqueurs génétiques caractérisés par ses différents allèles, qui sont des polymorphismes de la séquence d'adn. Quatre types de marqueurs ont été développés jusqu'à maintenant: la première génération de marqueurs ADN, représentée par les polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP pour «Restriction Fragment Length Polymorphsim») était constituée de marqueurs bi-allèliques et ainsi peu informatifs. Elle a été remplacée par des marqueurs multiallèliques plus polymorphiques: Au début les séquences répétées minisatellites ont été utilisées, puis les séquences microsatellites ou STRs et plus récemment les SNP (single nucleotide polymorphism) qui correspondant à des variations d'une seule base dans la séquence d'adn (Polymorphisme mononucléotidique) ou parfois à une petite insertion ou délétion. II.1.Polymorphisme des fragments de restriction par la technique RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) : Ce type de pratique consiste à étudier la taille des fragments de restriction d'adn. En effet, même si deux segments d'adn sont homologues, leurs tracés diffèrent. Ces variations ont été nommées polymorphismes de taille des fragments de restriction (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphisms) et furent l un des premiers systèmes de marqueurs à être 11

37 développé par Botstein et al. en Le concept utilisé pour la mise en évidence de ces polymorphismes, fait appel à des enzymes de restriction qui opèrent un clivage de l ADN en des sites hautement spécifiques et reconnaissent des séquences de 4, 6, 8 ou parfois plus de paires de bases [8] (Figure 3). Nous observerons donc un polymorphisme de longueur de fragment qui peut être dû soit à une création ou une suppression d'un site de restriction en relation avec une mutation soit à une variation de distance entre deux sites suite à une insertion ou une délétion d'adn (Bernot, 1996). 12

38 Figure 3. Changement de base au niveau des sites de Restriction [8] 13

39 La technique RFLP se déroule comme suit : 1. Extraction de l'adn génomique, 2. Hydrolyse de l'adn en fragments de tailles différentes, appelés fragment de restriction, par une enzyme spécifique (généralement par HinfI en Europe et par HaeIII aux Etats Unis), 3. Séparation des fragments de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose, 4. Dénaturation de l'adn par la soude pour obtenir de l'adn monocaténaire, 5. Transfert sur membrane, renforcement de la fixation (Southern blot), 6. Hybridation avec des sondes spécifiques, qui ont été le plus souvent radiomarquées par du phosphore 32, permettant une visualisation de ces fragments d intérêt après autoradiographie. Les premières sondes développées permettent de reconnaitre toute une famille de séquences répétitives dont la séquence de nucléotides était très proche [9] et les marqueurs révélés sont alors multilocus et dominants. On obtient donc un profil constitué de nombreuses bandes réalisant un véritable «codebarre», dont le nombre et la localisation sont spécifiques d un individu. Plus on étudie de bandes plus on augmente la probabilité de trouver une différence entre deux individus [10] (Figure 4). Cependant, cette méthode a été abandonnée car elle nécessite au moins 500 ng d ADN pour obtenir un profil génétique aisément interprétable [Ludes et Mangin, 1992]. De plus, elle est très sensible aux contaminations par des microorganismes puisque les motifs de base des sondes multiloculaires 14

40 permettent de détecter des séquences de génomes bactériens, notamment celui d Escherichia coli [11]. En 1989, elle fut améliorée par l'usage de sondes qui mettent en œuvre une technique identique mais sont spécifiques d une seule localisation située juste à coté du groupe de séquences répétées (et non pas au niveau des répétions qui, elles ne sont pas spécifiques d un locus) [10] et les marqueurs sont souvent qualifiés de monolocus et souvent codominants. Ainsi le résultat obtenu est plus simple avec la présence d une ou deux bandes selon que la personne est homozygote ou hétérozygote [12] (Figure 5). En répétant l opération plusieurs fois, on obtenait les profils d une série de bandes. La combinaison de plusieurs profils de bandes ainsi obtenue offrait un pouvoir discriminant aussi important que celui des sondes multilocus et permettait une interprétation plus aisée [13]. Cette technique, robuste et peu sensible aux contaminations, a eu un gros succès auprès des généticiens dans les années , mais présentait de nombreux inconvénients : c est une méthode de cout élevé, longue et laborieuse (1 semaine) qui nécessite une grande quantité d'adn de bonne qualité pour être utilisée et elle n est plus la méthode de choix dans la plupart des laboratoires effectuant des tests d ADN à des fins de filiation et la technique qui allait remédier à ces inconvénients majeurs et ouvrir une voie universelle est basée sur l amplification génétique ou PCR (Polymérase Chain Reaction) [14]. 15

41 Figure 4. RFLP Sonde multilocus [9] Figure 5. RFLP Sonde monolocus [12] Sonde D2S44: Hae III 16

42 II.2. Polymorphisme des marqueurs STRs : autosomiques et sexuel (Y et X) Environ 30% de la partie non codante du génome humain est constituée de séquences répétées. Des séquences dites séquences noyau ou motif de base, courtes et répétées de manière juxtaposée créent ce qu on appelle le polymorphisme de répétition. Elles montrent une très grande variabilité dans le nombre de répétitions dites en tandem de la séquence noyau. Cette variabilité de répétition est transmise de génération à génération de façon stable suivant les lois mendéliennes [LIT7 et LUTY, 1989 ; WEBER et MAY, 1989]. Selon la structure et le nombre de répétitions du motif de base formant le polymorphisme, on distingue: Les Minisatellites (VNTR) et les Microsatellites (STRs). Les Minisatellites sont des répétitions de motif ayant 10 à 60 paires de bases (pb) et se localisent préférentiellement dans les régions télomériques. De par leur inégale répartition dans le génome ce sont des marqueurs moins utiles [15] car ils sont multilocus (sa séquence se retrouve en différents endroits du génome) ainsi le profil obtenu est composé d un grand nombre de bandes, biallélique donc moins informatif et dominant [16]. En plus, leur révélation après PCR nécessite la mise au point d'amorces spécifiques. Cette étape est souvent longue et laborieuse mais permet d'obtenir des marqueurs monolocus et codominants [17]. Quant aux microsatellites, qui nous intéressent dans cette thèse, présentent un polymorphisme élevé (taux de mutation assez fort) [18] permettant alors de distinguer les individus différents dans la population de départ ou encore distinguer les individus homozygotes des hétérozygotes. Ils sont aussi multialléliques donc plus informatifs, monolocus et codominants [16]. 17

43 D autres avantages souhaitables pour être retenus comme marqueurs, peuvent être cités : ils sont neutres puisqu ils n ont pas d effet visible sur le phénotype des individus et leur taux d hétérozygotie est relativement important. En outre, leur localisation chromosomique est réalisable, et leur analyse par la technique de PCR permet de travailler sur de très petites quantités d ADN [19, 20]. On distingue des STRs autosomaux et des STRs sexuels. Autosomiques : Le profil génétique autosomal d une personne est le plus discriminant. Une panoplie de polymorphismes de type Short Tandem Repeat (STR) ou simple répétition en tandem ou encore appelé microsatellite est étudiée. Ces STRs sont uniformément dispersés le long du génome [Bernot, 1996] [21] et présentent un polymorphisme de longueur dû à un nombre variable de répétitions en tandem (10 à 15 répétitions) de di ou tri ou tétra nucléotides et dont la taille totale est inférieure à 100 pb. Par exemple : (CA)n, (CTT)n, (GTCT)n etc... Où n représente le nombre de répétitions de ce motif qui est variable d un individu à l autre dans la population. Des régions flanquantes, situées de part et d'autre d'un microsatellite, permettent de le repérer au cours de la PCR. Chez l Homme, les motifs dinucléotidiques (CA)n sont les plus abondants. 18

44 Exemple: le marqueur D5S818 (allèle 7) [23] 4 b.p. AGAT répétés 7 fois AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT AGAT 5 3 Chromosome 5 X X N.B: l Allèle désigne le nombre de répétitions Figure 6. Nomenclature des STR 19

45 Les marqueurs autosomaux subissent un brassage génétique à chaque génération puisqu'ils sont transmis de manière biparentale. Ainsi, la moitié de l'information génétique d'un individu lui vient de son père et l'autre moitié de sa mère (Figure 7) [11]. Figure 7. Autosomes : Hérédité complète à partir des ancêtres Cependant, d autres marqueurs appelés marqueurs uniparentaux, sont transmis d'une génération à l'autre sans changement (sauf dans le cas de mutations) à partir de l un des parents donc moins informatifs pour l'identification individuelle. Et l'information génétique de chaque marqueur uniparental est appelée haplotype au lieu de génotype puisqu'un seul allèle est détecté par individu [11]. Parmi ces marqueurs on cite ceux qui sont situés sur le chromosome Y. Sexuels Y et X : Le chromosome Y est l un des deux hétérochromosomes (chromosomes sexuels) du caryotype humain. Il est mâle-spécifique, présent à l état haploïde dans la cellule et comporte le plus grand segment non recombinant du génome (environ 60 Mb). Il possède au niveau des télomères deux régions homologues 20

46 au chromosome X (régions pseudo-autosomales) et une grande partie centrale non recombinante lors de la méiose [22] (Figure 10). Par conséquent, elle est transmise sans modification à la génération suivante et les seules mutations qui apparaissent proviennent de nouvelles mutations touchant les cellules germinales. Le chromosome Y porte plusieurs STRs. Leur étude présente deux avantages principaux : la spécificité de l'adn masculin lors de l'analyse de mélanges d'adn et la possibilité de suivre les lignées paternelles. En effet, l absence de recombinaison génétique fait que sa région spécifique est transmise de père en fils sans modification, avec ses différentes mutations accumulées au cours de l évolution. Ainsi qu un individu masculin possède les mêmes allèles que son père, que son grand-père, que ses frères, etc [12] (Figure 8). Figure 8. Y-Chromosome : Hérédité de père en fils L analyse de ce chromosome se fait dans le cas de recherche de paternité complexes où l enfant est de sexe masculin et le père n'est plus vivant ou absent (Figure 9). 21

47 Figure 9. Y-STR permettent de déterminer des filiations dans le cas où le père est décédé Le premier microsatellite polymorphique du chromosome Y, aujourd'hui nommé DYS19, a été décrit en 1992 [Roewer et Epplen, 1992]. Depuis, des centaines de marqueurs polymorphiques ont été décrits comme résultat direct de la disponibilité des informations de séquence du Projet du Génome Humain (Human Genome Project) et des avancements des outils bioinformatiques pour l'exploitation des banques de données de séquences [Ayub et al., 2000] [11]. En 1997, une communauté scientifique européenne a établi un ensemble de 9 microsatellites du chromosome Y définissant l'haplotype "minimal" et des marqueurs supplémentaires créant l'haplotype "étendu" [de Knijff et al., 1997 ; Kayser et al., 1997 ; Roewer et al., 2001]. En 2003, la communauté scientifique américaine (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods, SWGDAM) a défini l'haplotype minimal incluant les 9 loci "européens" et 2 autres marqueurs, qui font partie des kits pour application en criminalistique commercialement disponibles aujourd'hui [11] (Figure 10). 22

48 Figure 10. Structure du chromosome Y humain Source : 23

49 Quant aux marqueurs STRX, leur application est très récente, elle est utilisée principalement dans les problèmes complexes de filiation père-fille [12]. Autres marqueurs d une importance comparable à ceux des STRs sexuels, sont situés sur l ADNmt et permettent de retracer les lignées maternelles [Oota et al., 1995]. II.3. Polymorphisme de l'adn mitochondrial : Durant de nombreuses années, seul l ADN nucléaire a été étudié, jusqu à ce qu un chercheur, Anderson, publie en 1981 la séquence complète de l ADN mitochondrial. Cet ADN issu de la mitochondrie qui est un organite responsable de la respiration cellulaire, peut également être utilisé pour l'expertise génétique : il s'agit d'une petite molécule circulaire et monocaténaire de paires de bases, extrêmement résistante notamment au temps et aux conditions climatiques (humidité, chaleur) qui dégradent l'adn nucléaire et présente à plusieurs dizaines (voire centaines) de copies dans la cellule ce qui rend sa détection plus aisée sur des prélèvements pauvres en nombre de cellules. En plus, cette molécule possède deux régions hypervariables appelées HVR1 et HVR2 dont le polymorphisme n'est pas lié à des variations de longueur comme pour l ADN génomique, mais à des variations dans la composition en nucléotides dit «polymorphisme de structure» (Figure 11). 24

50 342 bases 268 bases HVI HVII région de contrôle 0 HVI HVII ADN mt (16569 pb) Figure 11. Structure du génome mitochondrial humain Source 25

51 Une autre particularité de l ADN mitochondrial est qu'il se transmet uniquement par la mère (Figure 12). En effet, il semble que les mitochondries des spermatozoïdes qui n en contiennent qu un petit nombre soient rapidement éliminées après la fusion avec l ovule qui en est bien fourni ( et ) [Houshmand, 1997] [23]. Et seules celles apportées par l'ovocyte sont conservées et serviront de "réserve" initiale des mitochondries du nouvel individu. [24]. Figure 12. L ADN mitochondrial : Hérédité de mère à fille La mère transmet donc son ADN mt à tous ses enfants mais seules les filles le transmettront à leur tour à leur progéniture et ainsi de suite jusqu'à ce que intervienne un événement générateur de différence c'est-à-dire d une mutation. Par conséquence, l ADN mt est très utile dans le diagnostic des fratries (lorsqu il s agit des enfants d une même mère) et permet également de remonter dans la lignée maternelle et d établir des apparentés du type grand-père petit fils(ou fille) ou d autres parentés encore plus complexes. Il n existe pas de limites, que le descendant soit homme ou femme [25]. L analyse de l ADN mt s effectue après amplification par PCR d une région de contrôle appelé parfois D-loop, qui sert à initier la réplication du brin 26

52 lourd de l ADN mt et présente une plus grande variabilité que le reste de la séquence de celui-ci ce qui en fait une région plus appropriée pour l identification des personnes [26]. Ensuite, un séquenceur automatique permet la détermination d environ 600 à 700 nucléotides. Ainsi, la séquence déterminée de chaque région est comparée à une séquence de référence d Anderson qui est l ADN mt d'une des personnes de la lignée maternelle et permet de caractériser les points de variations (mutations) de l ADN analysé (Figure 13). On considère généralement que l ADN mt testé n est pas similaire à celui de référence lorsqu une différence de plus de deux nucléotides est constatée. Les inconvénients potentiels de cette technique sont sa grande complexité en raison notamment d une possible hétéroplasmie caractérisé par la présence de plusieurs types de génome chez un individu (Figure 14), et le fait qu elle est très sensible aux contaminations de toutes origines. En outre, sa mise en œuvre est longue et coûteuse et le pouvoir discriminant des résultats obtenus est moindre que celui offert par l analyse de l ADN nucléaire. 27

53 Figure 13. Exemples de séquences obtenues lors d analyse de l ADN mt (C/T) Figure 14. Hétéroplasmie au niveau de la position Un profil ADN mt hétéroplasmique pourrait correspondre par exemple à la description suivante : C/T, avec une partie de l échantillon possédant un C à la position et l autre partie possédant un T. En effet, chaque cellule eucaryotes contient plusieurs centaines de mitochondries avec des centaines des copies d ADN mt, c est très fréquent que des mutations n'affectent que certaines des copies, tandis que les autres sont inchangées. 28

54 III. L ADN au service de la filiation parentale : Le test de paternité utilise l information apportée par les microsatellites qui, comme nous l avons vu, présentent de nombreux allèles dans la population et sont donc variables d un individu à l autre. De plus, les microsatellites sont très nombreux et distribués de façon régulière dans le génome, si bien que la probabilité de trouver deux individus portant sur l ensemble de ces loci les mêmes génotypes est quasi-nulle, ce qui revient à dire que l ensemble des génotypes d un individu est unique et constitue sa signature individuelle ou sa carte d identité. Et comme l hérédité des régions d ADN obéit aux lois mendéliennes, et connaissant la fréquence des allèles au sein d une population déterminée et regroupés dans une base de données, il est possible d établir la preuve d une filiation avec une très haute probabilité. Ainsi, une paternité ou une maternité peuvent être établies. Dans ce cadre il est important de rappeler que l'identification de restes humains par l'analyse d'adn constitue aujourd hui un instrument performant et efficace dans les enquêtes historiques permettant ainsi de dévoiler la vérité et de retracer à nouveau l histoire humaine. III.1.Quelques cas historiques : III.1.1. Affaire de Louis XVII : Pour l'identification de Louis XVII, la méthode qui a été utilisée est celle de l'adn mitochondrial (ADN mt). Cet ADN provient uniquement de la mère et, comme il y a des milliers de mitochondries dans une seule cellule, il est quasiment certain qu'il en subsiste dans les restes anciens que nous étudions : le 29

55 cœur de Louis XVII. Plus particulièrement, les études ont porté sur deux régions de la D-loop (HVR1 et HVR2), la D-loop étant une région de l'adn mt. Le but est donc de comparer l'adn mt du cœur à l'adn mt de plusieurs membres de la famille de Louis XVII du côté maternel : l'adn mt de deux de ses tantes, Johanna Gabriela et Maria-Josepha, celui de sa mère Marie- Antoinette et celui de deux descendants actuels, la Reine Anna de Roumanie et son frère André (Figure 15). Pour cela, le morceau de cœur prélevé a été divisé en deux parties et l'analyse s'est déroulée dans deux laboratoires : le Centre de la Génétique humaine de l'université de Louvain en Belgique et l'institut pour la Médecine Légale de l'université de Münster en Allemagne. 30

56 Figure 15. Arbre généalogique de la lignée des Habsburg Source : louis17.ifrance.com/comparaison.htm - 31

57 La séquence d'adnmt du cœur est entièrement identique à celle d Anna et d André. Pour l'adnmt des tantes et de la mère de Louis XVII, la séquence est identique pour la HVR1 et le site de restriction Hae III (position 16519) mais pas pour la HVR2. En effet, il y a une différence aux positions 152 et 194. On refait alors les expériences sur Marie-Antoinette (cheveux de Cannes et de Nimègue aux Pays-Bas) et Johanna-Gabriela. Les résultats obtenus pour Johanna-Gabriela sont identiques à ceux du cœur et des descendants actuels de Louis XVII. Pour les cheveux de Marie-Antoinette retrouvés à Nimègue, le problème est résolu en position 152 mais pas en position 194 (Tableau I). Quant aux cheveux trouvés à Cannes, les résultats, toujours aussi mauvais, indiquent une contamination. 32

58 Tableau I. Résultats obtenus lors d analyse de l ADN mt de la lignée des Habsburg Source : louis17.ifrance.com/comparaison.htm - ADN de : Cœur (Louis XVII?) Johanna- Gabriela (cheveux) Marie- Antoinette (cheveux récupés à Nimègue, aux Pays-Bas) Anna de Roumanie (sang) André (cheveux) séquence internationale de référence d'anderson HVR1 identique à la séquence de référence identique à la séquence de référence identique à la séquence de référence identique à la séquence de référence identique à la séquence de référence Hae III position HVR2 nature du nucléotide de la position 152 HVR2 nature du nucléotide de la position 194 HVR2 nature du nucléotide de la position 263 HVR2 nature du nucléotide de la position (entre 315 et 316) C C T G C C C T G C C C C G C C C T G C Pas de résultats C T G C T T C A rien C = cytosine, G = guanine, T = thymine, A = adénine. 33

59 Les résultats obtenus nous permettent d'affirmer que ce cœur appartient bien à Louis XVII. En effet l'adn mt du cœur est identique à l'adn mt de quatre membres de la famille maternelle de Louis XVII. Louis XVII et donc bien mort le 8 juin 1795 dans la prison du Temple. Dans ce contexte une autre affaire a paru, celle du l horloger prussien Karl- Wilhelm Naundorff qui prétendait être Louis XVII, fils de Louis XVI. Ces prélèvements post mortem ont permis après comparaison avec l ADN mitochondrial de Marie-Antoine de l exclure. En effet, en 1950 on a ouvert sa tombe et on a prélevé une mèche de cheveux et son humérus droit. Ces prélèvements ont lieu pour savoir s'il a été empoisonné. Depuis, les restes sont gardés dans un laboratoire hollandais. En 1993, des scientifiques de Nantes et de Louvain ont reçu l'autorisation d'utiliser ces prélèvements pour déterminer l'identité de Naundorff. On a déterminé la séquence D-loop de l'adn mt de Naundorff et de membres de la famille maternelle de Louis XVII. Les résultats sont sans appel : l'adn mt de Naundorff était très différent de l'adn mt des membres de la famille de Louis XVII. Il est donc certain que Naundorff n'est pas Louis XVII [27, 28, 29]. III.1.2. Affaire de la famille Romanov : Le cas le plus célèbre d une telle filiation s est produit en septembre 1992, quand des scientifiques travaillant au Forensic Science Service du Royaume-Uni se sont vus confier la tâche d analyser l ADN mitochondrial des cinq corps exhumés d une tombe à Ékatérinbourg, dans l Oural, en Russie et de la comparer à celui d un échantillon de sang donné par le Prince Philip (dont la grand-mère maternelle était la sœur de la tsarine Alexandra), et aussi à celui du sang de deux personnes survivantes ayant une filiation maternelle avec le tsar. 34

60 Les scientifiques ont réussi à démontrer, avec un taux de certitude d environ 99 p. 100, que les corps trouvés à Ékatérinbourg étaient bel et bien ceux du tsar Nicholas II et sa famille qui ont été assassinés par les bolcheviks peu après la révolution en 1918 [30]. Tableau II. Les halogroupes T de l ADN mt trouvés chez la famille Romanov [32] Haplogroupes T HVR C, 16169Y*, 16294T, 16296T HVR2 73G, 263G, 315.1C En utilisant la même technologie, les scientifiques ont également été en mesure de démontrer que Anna Anderson, qui dans les années 1920 prétendait être la grande-duchesse Anatasia Romanova de Russie, était un imposteur. En effet, Dans les années 1980, ses cendres de crémation ont été testées et montrent qu elle n avait aucun lien de parenté avec les membres restants de la lignée des Romanov [31] (Figure 16). 35

61 Figure 16. Arbre généalogique de la famille Romanov Source : fr.wikipedia.org/wiki/nicolas_ii_de_russie - 36

62 III.1.3. Affaire du Thomas Jefferson: Les qualités susmentionnées des marqueurs du chromosome Y ont été exploitées dans le cadre de l examen de l hypothèse selon laquelle Thomas Jefferson ( , 3 ème président des états unis) aurait eu une descendance avec Sally Hemings ( ) l une de ses esclaves noires [23]. L ADN de cinq descendants de l oncle paternel de Thomas Jefferson, Field Jefferson, fut analysé pour enquêter sur le profil du chromosome Y de cette famille. En comparaison, on utilisa des descendants directs paternels du fils de Sally Hemmings, John Weeks Jefferson, le seul descendant encore en vie de Eston Hemmings, a confirmé avec son chromosome Y appartenir aux deux familles avec une même lignée paternelle. [32] Tableau III. Les marqueurs microsatellites du chromosome Y de la lignée paternelle de Thomas Jefferson [32] Haplogroupe DYS# K2 (Y-DNA) a 385b Ainsi les STRY ont apporté des indices assez forts pour soutenir l hypothèse d une liaison [Foster, 1998]. La force des STR est également leur faiblesse dans la mesure où cette démonstration n exclut pas la possibilité qu un autre individu de la lignée de Thomas Jefferson soit à l origine des caractéristiques détectées noires [23]. 37

63 III.2.Recherche d une filiation parentale : La famille étant considérée comme l entité de base de la société, et le recours de plus en plus aux tests d ADN a permis de protéger son unité. Vérifier ou exclure le rapport biologique entre un enfant et un père présumé est aujourd hui faisable grâce aux techniques de biologie moléculaire. En outre, les expertises de filiation sont devenues possibles grâce à une grande participation de marqueurs génétiques même dans le cas où l un des géniteurs est inconnu. Lorsque le père présumé est décédé, par exemple, on fait intervenir d autres membres de la famille: la mère, grands-parents, frères et sœurs du défunt ou encore enfants nés d une autre union. III Paternité simple Le contexte général peut être celui d une affirmation ou d une contestation de paternité, que ce soit en vue de la reconnaissance d un enfant pour recouvrer ses droits ou assumer ses devoirs parentaux (la pension alimentaire ou la garde), ou dans le cadre d une succession, ou simplement quand un doute s est installé. Le test de paternité est basé sur l analyse du matériel génétique (ADN) du supposé père, de la mère et de l enfant. Les techniques de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et de l électrophorèse capillaire nous permettent d analyser 16 marqueurs STR (fragments courts d ADN répétés); leurs combinaisons forment le profil génétique, unique pour chaque personne. Le profil génétique de l enfant est comparé avec celui du supposé père biologique. Toute personne possède deux copies ou allèles de chaque marqueur, l un hérité de la mère et l autre du père biologique. Pour que le supposé père soit 38

64 le père biologique, il est indispensable que, pour chaque marqueur, un allèle de l enfant coïncide avec un des deux allèles du père [33]. III.2.3. Recherche de la maternité : Ce test peut être utilisé pour connaître la mère biologique d une personne. Il est utilisé dans les cas des enfants orphelins en recherche de leurs parents biologiques, de substitutions d identité lors de l accouchement voire d échange de bébés à la maternité, de regroupement familial, de relation familiale complexe, etc. La technique adaptée pour rechercher une telle maternité est celle utilisée pour un test de paternité simple [33]. III.2.4.Test d ADN de fratrie : Fratrie entre frères ou entre sœurs ou entre frère et sœur avec doute de la mère: Pour résoudre ce doute, en l'absence de la supposée mère la technique utilisée se base sur l analyse de l'adn mitochondrial qui se transmet intégralement de la mère aux enfants (filles et fils). Ainsi tous les enfants d une même mère ont les mêmes mitochondries et donc le même ADN mitochondriale. Fratrie entre frère et sœur (enfants de sexe différent) avec doute sur le père: Dans ce cas, la technique utilisée se base sur l analyse des STRs autosomiques utilisés lors de test de paternité avec participation du père et de l enfant. 39

65 Nous établissons le profil génétique des participants et nous calculons la probabilité de relation de fratrie. Dans ce test, il est très important que le plus grand nombre de familiers directs participent (fils, filles et la mère). Les résultats s expriment sous la forme d une probabilité que les supposés frères et sœurs soient réellement des frères et sœurs biologiques. Cet indice de probabilité est directement lié au nombre de participants au test. Généralement des indices de probabilité de 80 à 99% sont atteints [33]. La recherche d une filiation parentale ne peut être applicable que lorsqu une étude de la structure génétique de la population aura réalisée. Divers outils et méthodes statistiques très spécifiques sont employés pour cette étude. 40

66 IV. Eléments de génétique de population : Les études de populations présentent un des aspects les plus importants de l'identification génétique car elles permettent la collecte de données sur la fréquence de chaque allèle dans les différentes populations du monde. Ceci est un pré-requis pour établir la rareté d'un profil génétique et donner un sens aux résultats. En effet, il faut connaître la fréquence de chaque allèle dans la population d'intérêt afin de savoir quelle est la probabilité de trouver un autre individu avec les mêmes allèles. IV.1.Analyses statistiques : L analyse statistique qui sous-tend les résultats, est fondée sur les fréquences des allèles trouvées dans la population. La méthode statistique choisie doit être conservatrice pour éviter de sous-estimer la fréquence d un profil génétique. En effet, une empreinte génétique fréquente dans la population à un pouvoir d incrimination faible vis-à-vis du père présumé, alors qu un profil rare dans la population a un fort pouvoir d incrimination. Dans la recherche de paternité lorsque le profil du supposé père correspond à celui de l enfant, l étape suivante de l interprétation consiste à calculer la probabilité de survenue de ce génotype dans la population. Cette étape est délicate en raison du grand nombre d allèles défini pour les marqueurs utilisés et des imprécisions de mesure de la taille des fragments. L approche statistique doit compenser les limites de la technologie, les possibles biais des études de population effectuées jusque-là à partir d un nombre restreint d individus et l interférence de contaminants. 41

67 Plusieurs méthodes statistiques ont essayé de répondre à ces impératifs parmi les quelles celle qui est proposée par Evett et al. En 1991 et qui est basée sur un modèle probabiliste, le théorème de Bayes. IV.2. Détermination des paramètres médicaux légaux : Dans les tests de paternité, un marqueur génétique peut être utilisable à condition de répondre à un certain nombre de critères parmi lesquels on peut citer le taux d'hétérozygotie, le pouvoir de discrimination, l équilibre de Hardy- Weinberg et la probabilité de paternité. Le taux d'hétérozygotie : Dans le contexte spécifique des analyses d ADN, la puissance des marqueurs génétiques peuvent être exprimée par une autre expression l hétérozygotie. Le taux d hétérozygotie au niveau d un locus donné dans une population correspond à la fréquence totale des hétérozygotes pour ce locus [34]. Pour qu un individu soit hétérozygote, il faut qu il ait hérité de son père d un allèle différent de sa mère. Cet héritage distinct à d autant plus de chances de se produire que le marqueur génétique est polymorphe et que le nombre d allèles possibles est élevé. En toute logique, plus un marqueur génétique est polymorphe, plus faibles sont les chances qu un individu naisse homozygote [23]..Pouvoir de discrimination : Dans le contexte des analyses d ADN, le pouvoir de discrimination est la probabilité d avoir deux génotypes différents en analysant deux individus pris au hasard dans la population considérée. 42

68 Plus un marqueur génétique est polymorphe plus élevé est le pouvoir de discrimination [23]. L équilibre de Hardy-Weinberg La loi de Hardy-Weinberg permet, sous certaines conditions, le calcul des fréquences génotypiques à partir des fréquences allèliques [35] qui restent stables de génération en génération et ne dépendent que des fréquences de la génération initiale [36]. Le déséquilibre apparent d un marqueur dans une population par rapport à la loi de Hardy-Weinberg indique un événement relativement récent, telle une mutation, une migration voire un effet de pression de sélection, qui empêche l'application des lois biostatistiques sur sa transmission. De même, un déséquilibre apparent par rapport à la loi de Hardy-Weinberg peut être induit par la taille faible ou une organisation en sous-populations de l'échantillon. Ainsi, les loci caractérisés par un déséquilibre dans l'hérédité ne peuvent être utilisés en tant que marqueurs pour l'identification génétique [11]. La probabilité de la paternité : Lors d une expertise en paternité, nous recherchons en premier lieu si la paternité peut être exclue; en ce cas, on peut donner une réponse absolue. Par contre, si le père présumé présente une caractéristique en commun avec l enfant, il y a une chance qu il y ait paternité biologique et, dans ce cas, un calcul de probabilité est effectué. Cette probabilité de paternité est la probabilité que la totalité des allèles obligatoires paternels (c est-a`-dire, non hérités de la mère) présents chez l enfant soient bien hérite s du père putatif par rapport à une autre hypothèse qui 43

69 serait d être hérités d un homme pris au hasard dans la population des hommes non exclus. Ce calcul, tenant compte de l ensemble des marqueurs étudiés, est basé sur la fréquence des allèles dans la population. Plus le caractère hérité de son père par l enfant est rare, plus il contribuera à élever la probabilité de paternité. L approche mathématique repose sur le théorème de Bayes. Le calcul de ces différentes probabilités se fait grâce à des logiciels de calcul. IV.3. Indice de vraisemblance ou Likelihood Ratio (LR) : Depuis plusieurs années, les scientifiques ont abordé la problématique d évaluation de la preuve par ADN et actuellement un consensus sur la façon de présenter une telle preuve a été trouvé [37]. La solution réside dans l application du théorème de Bayes, et plus spécifiquement dans l exploitation d un rapport de vraisemblance, facteur intervenant dans le calcul bayesien. Le model bayesien permet de reconsidérer une mesure d incertitude à propos de l existence ou de la non-existence d un fait sur la base d une nouvelle information acquise. Cette approche est commune à tous les domaines scientifiques où les données sont combinées avec des informations a priori afin de fournir des probabilités a posteriori sur l existence ou la non-existence d un fait particulier. Cette chance a posteriori s obtient en multipliant la chance a priori par le rapport de vraisemblance qui est fonction de la différence de taille entre les allèles à comparer et de distribution de la taille des allèles dans la population. L approche Bayesienne clarifie les positions respectives du scientifique et du juge et définit leurs relations : l expert se concentrera sur l évaluation du rapport de vraisemblance et le juge se chargera de l évaluation des chances a priori et a posteriori [4, 38]. 44

70 V. Aspects juridiques et éthiques des tests de paternité : Les empreintes génétiques jouent un rôle clé dans des litiges en droit de la famille (pour établir la paternité des enfants dans des causes portant sur la pension alimentaire ou la garde), en matière d'immigration (pour déterminer si un individu est vraiment parent d'un immigrant) et en matière de succession (pour établir qui a des liens avec le testateur) De ce fait, les juristes tentent de faire coïncider la réalité juridique et la réalité biologique et accepte en conséquence les preuves de la paternité biologique qui ne peut être réalisé qu'avec le consentement de l'individu sinon il s agit d une violation du corps humain sauf pour certains cas. Et les méthodes utilisées pour réaliser une telle preuve sont sous tendues par 3 critères : La validité du principe fondamental L efficacité de la méthode d analyse Et son Application convenable Et les possibilités de fausses exclusions doivent être soigneusement contrôlées. V.1. Aspects juridiques : V.1.1.Cas du Maroc : Moudawwana Après la réforme de la Moudawana, l usage des tests ADN dans le cadre de la justice marocaine tend à se généraliser. Nombre d affaires civiles ont été élucidées grâce à ce genre d expertises. 45

71 La filiation paternelle est le lien légitime qui unit le père à son enfant et qui se transmet de père en fils. Elle découle : - Des rapports conjugaux (al firach) - De l aveu du père (iqrar) ou (istilhak) - Des rapports sexuels par erreur (choubha) Le premier test ADN pour prouver une paternité contestée a été effectué au Maroc en À l époque, le Maroc en est toujours aux balbutiements dans ce domaine. L usage des tests ADN reste aujourd hui tributaire d une nécessaire adaptation de la législation marocaine aux progrès de la science. Dans ses articles 16, 153 et 156, le nouveau code du statut personnel prévoit certes la possibilité de recourir à la science, dont les tests ADN, pour prouver ou contester la filiation dans le cadre du mariage et aussi dans le cas d une grossesse qui survient en cours de fiançailles. En revanche, ce code ne dit rien sur les grossesses résultant d un viol, les mères célibataires ou les recherches posthumes de paternité. Encore faut- il rappeler que dans la loi marocaine l expertise biologique, qui est fondée sur la méthode des empreintes génétiques et permettant ainsi l identification d un individu donné par son code génétique, n est citée en aucun article. Seule l expertise judiciaire est mentionnée. Par conséquent, l existence d un vide juridique se fait ressentir et plusieurs questions se posent : - Que prévoit la réglementation aux procédures d agrément des experts et des laboratoires habilités à procéder à ce type d analyses? 46

72 - Dans quelles situations un juge peut-il ordonner une expertise ADN en recherche de paternité (requérant potentiel, limite chronologique de la recevabilité de l analyse,...)? - Le juge peut-il ordonner une recherche de filiation par analyse ADN dans le cadre d une demande d immigration? - Qui devra supporter les frais des analyses génétiques dans les différentes situations? - Exemple (affaire marocaine) : Malgré les résultats négatifs d un test ADN, la cour suprême de Rabat valide un jugement du tribunal d El jadida que un franco-marocain Mr X était belle est bien le père de la fille Y. La justice marocaine donne la priorité à la filiation juridique au détriment de la filiation biologique [39]. V.1.2.Cas de la Tunisie : Madjallat et droit tunisien Le législateur tunisien a, très tôt, été sensible au problème de filiation et par la loi du 4 mars 1958«relative à la tutelle publique, à la tutelle officieuse et à l adoption», qui constitue certainement une œuvre capitale et un acquis majeur distinguant la Tunisie de l ensemble des pays arabo-musulmans, a introduit l'adoption comme moyen de filiation; l'article 15 de cette loi énonce que l'adopté a les mêmes droits et les mêmes obligations que l'enfant légitime [40]. Et par la loi n du 28 octobre 1998 la personne concernée, le père, la mère ou le ministère public peut saisir le tribunal de première instance compétent pour demander l'attribution du nom patronymique du père à l'enfant 47

73 de filiation inconnue, dont la paternité est prouvée par l'aveu, le témoignage ou l'analyse génétique. La personne concernée, le père, la mère ou le ministère public peut, également, saisir le tribunal de première instance compétent pour demander que la mère soit soumise à l'analyse génétique en vue de prouver qu'elle est la mère de celui dont la filiation est inconnue. En cas de refus de se soumettre à l'ordonnance prescrivant l'analyse génétique, le tribunal statue sur l'affaire sur la base des présomptions nombreuses, concordantes, graves et précises dont il dispose( ) [41,42]. Dans le souci de lever les obstacles et les discriminations pesant sur les enfants abandonnés ou de filiation inconnue, le législateur a adopté la loi n du 7 juillet 2003 complétant la loi n o du 28 octobre 1998 «relative à l octroi d un nom patronymique aux enfants abandonnés ou de filiation inconnue». Cette loi vise à faciliter encore davantage à cette catégorie d enfants l établissement de la filiation par recours au test d empreintes génétiques (ADN) en obligeant le père présumé et la mère à se soumettre à l analyse génétique. 48

74 Il faut rappeler à cet égard que plusieurs mesures ont été prises en faveur des enfants nés hors mariage et destinées à assurer «l application de la législation dans la pratique» dont on cite le renforcement et la mise en place de laboratoires d analyse génétique pour prouver la paternité de l enfant par l intermédiaire d un test d empreinte génétique et, ce dans les hôpitaux et les Instituts suivants: Hôpital Habib Thameur (Tunis), Institut pasteur (Tunis), Hôpital Hédi Chaker (Sfax), Hôpital Farhat Hached (Sousse), Hôpital Ibn Eljazzar (Kairouan); Exemple : Dans le jugement rendu dans l affaire n o 53/16189, en date du 2 décembre 2003, le Tribunal de première instance de La Manouba a expressément motivé son jugement établissant la filiation par recours au test d empreintes génétiques (ADN) en considérant que «la filiation est un droit de l enfant qui ne saurait être limité par la forme de relations choisie par ses parents, d où il résulte que la filiation telle que définie à l article 68 du Code du statut personnel doit être entendue de façon large conformément à l article 2, paragraphe 2 de la Convention des droits de l enfant ratifiée par la loi du 29 novembre 1991 et qui protège l enfant contre toutes formes de discrimination ou de sanction motivées par la situation juridique de ses parents, et que la privation de l enfant de son droit à la filiation sous prétexte que ses parents ne sont pas liés par le mariage constitue une sanction infligée à cet enfant et une atteinte à l un de ses droits fondamentaux, sans égard à la discrimination qui en résulterait entre les enfants par l introduction artificielle d une différence entre la filiation légitime et la filiation naturelle». 49

75 V.1.3.Cas de la France : Les tests ADN sont utilisés dans les recherches de filiation. Le contexte général peut être celui d une affirmation ou d une contestation de paternité, que ce soit en vue de la reconnaissance d un enfant, pour recouvrer ses droits ou assumer ses devoirs parentaux, dans le cadre d une succession, ou «simplement» pour savoir. En France, le législateur à élaborer la loi de bioéthique, datant du 29 juillet 1994 et actualisée en 2004, encadrant la mise en œuvre de ces techniques et prévoyant des sanctions à son égard. Voici les principales caractéristiques légales : Tout d abord, le recours à un test de paternité ne peut être envisagé que sur décision de justice. Il appartient au juge d'apprécier l'opportunité du recours au test de paternité (articles et du code civil) : *Art16-10 : «l identification d une personne par ses empreintes génétiques ne peut être recherchée que dans le cadre des mesures d enquête ou d instruction diligentées lors d une procédure judiciaire ou à des fins médicales ou de recherche scientifique». *Art16-11 : «en matière civile, cette identification ne peut être recherchée qu en exécution d une mesure d instruction ordonnée par le juge saisi d une action tendant soit à l établissement ou la contestation d un lieu de filiation, soit à l obtention ou la suppression de subsides.» Le consentement de l intéressé doit être préalablement et expressément recueilli (art13-11 du code civil), cependant, en cas de refus de se soumettre à l analyse, le juge donne le plus souvent tort à la partie défaillante [12]. 50

76 La réalisation des tests ne peut se faire que dans un laboratoire agréé par des biologistes agréés. (art16-12) : «sont seules habilitées à procéder à des identifications par empreintes génétiques les personnes ayant fait l objet d un agrément dans des conditions fixées par décret en Conseil d Etat. Dans le cadre d une procédure judiciaire, ces personnes doivent, en outre, être inscrites sur une liste d experts judiciaires». Les agréments sont accordés pour une période de 5 ans, et sont renouvelables. Afin d éviter les conséquences psychologiques qui sont infligées à l enfant suite à une contestation de filiation de paternité. La commission française de réforme propose : de ne pas permettre la contestation d une filiation au delà de 5 ans de possession d état conforme au titre. Test ADN et loi française sur l'immigration : En 2007, en France, où une loi de bioéthique encadre les tests ADN, une polémique est soulevée lorsque le gouvernement et l'assemblée nationale proposent, sur la base du volontariat, de faire des tests ADN sur des étrangers souhaitant immigrer légalement dans le cadre du regroupement familial et de prouver par un test biologique plutôt que par une preuve administrative parfois inexistante, la filiation entre le demandeur à faire venir sa famille et ceux présentés comme ses enfants. Des parlementaires et intellectuels se sont opposés à cet amendement proposé par le député Thierry Mariani [43]. Une pétition lancée par l'hebdomadaire satirique Charlie-Hebdo et l'association SOS Racisme a rassemblé des dizaines de milliers de signatures [44]. Au sein du gouvernement, le ministre des Affaires étrangères Bernard 51

77 Kouchner et Fadela Amara, la Secrétaire d'état chargée de la politique de la Ville, se sont opposés à cette loi. La proposition de loi fut remaniée pour n'autoriser les tests de filiation qu'à partir de l'adn de la mère et ainsi éviter les révélations inadéquates d'adultères, et uniquement dans certains pays où l'état civil est défaillant. Les dispositions qui prévoient les tests ADN mentionnés à l'article L du CESEDA (parfois surnommé code des étrangers) lorsque le décret d'application des conditions, mentionné au même article, sera paru, sont autorisées par l'article du code pénal. Dans ce cadre, il est important de signaler que le ministre français de l'immigration Eric Besson a annoncé le 13 septembre 2009 qu'il ne signerait pas le décret d'application sur les tests ADN pour le regroupement familial. L information fait la une de tous médias français depuis la déclaration du ministre, le dimanche 13 septembre sur la radio Europe 1. Cette nouvelle a été saluée par beaucoup mais elle a créé un véritable tollé au sein de la droite française [45]. V.2. Aspects éthiques : Malgré la procédure d analyse qui semble simple, il est nécessaire de s entourner de toutes les précautions pour ce qui est des prélèvements, de leurs conditions de stockage et de la technique. En effet, Toute erreur d étiquetage des tubes de prélèvement peut être à l origine de résultats erronés. Il faudrait également s assurer de l identité de personnes prélevées et de la conformité de cette identité, on n est pas à l abri des falsifications. Si un fragment de tissu est à analyser, il faudrait vérifier la réalité de son origine. 52

78 En plus la réalisation d empreintes génétiques, est susceptible, si l on ne prend pas de précautions particulières, d apporter des informations sur son éventuelle prédisposition à certaines maladies génétiques. Il faut donc prendre garde à ne pas faire d analyses dans les régions codantes de l ADN. Enfin, il est difficile de faire la distinction entre jumeaux monozygotes et avec les nouvelles qui parviennent sur le clonage, cette méthode d analyse pourra tomber en désuétudes dans les prochaines années à venir. En dehors des problèmes techniques, l utilisation des tests génétiques par analyse d ADN peut poser également des problèmes moraux, éthiques et sociaux, il s agit de confirmer ou d exclure une paternité ainsi que les résultats de l analyse peuvent être à l origine d un tournant dans la vie d un individu et avoir des conséquences sociales très importantes. Pour cette raison les analyses d ADN réalisés dans ce contexte ne doivent pas être faites en dehors d une expertise demandée pour ceux qui connaissent la loi et des règlements très stricts définissant les limites de l utilisation des empreintes génétiques seront établis. 53

79 VI. Assurance Qualité au sein des laboratoires d analyses génétiques: Dans le cadre de la réalisation d une recherche de paternité par analyse d empreintes génétiques, un système d Assurance Qualité est indispensable à mettre en place au sein des laboratoires pratiquant ces analyses et ceci pour prévenir, d une part, les risques d erreurs susceptibles d engendrer des conséquences fâcheuses qui peuvent se produire au cours de ces examens biologiques et surtout d y remédier immédiatement quand ils seront décelées. Et, d autre part, pour garantir aux juges et aux public que les tests effectués et que l efficacité du laboratoire sont dignes de confiance dans chaque cas spécifique. De ce fait, chaque laboratoire agréé pour la recherche de paternité doit répondre à certains critères de qualité de travail pour avoir des résultats exacts, fiables et reproductibles. Une recherche de garanties dans la qualification du personnel : Il est évident que le personnel doit être bien rodé aux techniques d identification ; il doit pouvoir s appuyer sur des protocoles précis constamment mis à jour, utiliser des produits de qualité et avoir un matériel approprié et régulièrement contrôlé [14]. 54

80 Une recherche de garanties dans le contrôle des locaux : Les locaux affectés à une telle activité doivent disposer d infrastructures et d équipements adaptés aux techniques de biologie moléculaire qui y sont mises en ouvre [46] et doivent être organisé de façon à assurer : - La sécurité des lieux contre le vol et la dégradation ; - Une confidentialité absolue; - La sauvegarde des scellés, des prélèvements et des résultats d analyse concernée [47]. Une recherche de garanties dans la maitrise des techniques : Les analyses ADN nécessitent une grande rigueur dans le prélèvement et l analyse afin de donner des résultats reproductibles. Ainsi que le laboratoire doit se conformer aux règles de bonne exécution de ces analyses. Il doit notamment mettre en place un système interne d assurance qualité basé sur des procédures opératoires, validées, écrites, couvrant toutes les étapes depuis le prélèvement de l échantillon jusqu à la remise des résultats permanentes et soumises périodiquement à des évaluations inters et externes Et les méthodes d analyses doivent utiliser les systèmes génomiques de polymorphisme (VNTR et STR) et permettre de prononcer à l exclusion ou une inclusion de paternité : Il y a exclusion de paternité si 2 systèmes analyses mettent en évidence l impossibilité pour le père présumé d avoir transmis les allèles paternels de l enfant. 55

81 Il y a inclusion de paternité si tous les allèles paternels de l enfant sont présents dans le génotype du père présumé. Les résultats doivent être exprimés en probabilité de paternité. Cette dernière doit être supérieure à (valeur admise à l échelle internationale). Les méthodes d analyses utilisées doivent être au préable validées par une étude de la fréquence allélique sur un échantillon représentatif de la population [48]. Encore faut-il rappeler qu en cas d utilisation des tests d amplification illitique de l ADN (PCR), le laboratoire doit prendre des précautions d usage draconiennes pour prévenir les contaminations croisées : Circulation différente et unidirectionnelle des prélèvements; Utilisation de procédures de décontamination très strictes ; Absence de visites. Mais la contamination d un scellé à un autre (transfert secondaire) devra aussi être prévenue par des manipulations très rigoureuses comme par exemple: Manipulation des scellés individuellement Un changement de gants, de coiffe, de masque, de blouse après toute manipulation d un prélèvement pour éviter les contaminations par le manipulateur. Finalement, il faut signaler qu il est important que ces laboratoires fonctionnent selon un référentiel de qualité, reconnu sur le plan mondial comme la norme ISO (Organisation internationale de normalisation) [49]. 56

82 Les laboratoires peuvent : être certifiés ISO 9000 : qui décrit le système des normes et donne les lignes directrices pour leur sélection et leur utilisation. [50]. et/ou être accrédités ISO : qui est développée pour qualifier la qualité des prestations des laboratoires d étalonnage [51]. 57

83 Matériels et méthodes 58

84 I. Recueil des dossiers : Après qu un expert qui est M. Sefiani (chef de département de génétique à l INH) ait été commis par décision d une juridiction (soit le tribunal de première instance soit le cours d appel), des convocations par lettre recommandée avec avis de réception (voir Annexe I) sont envoyées aux parties concernées. Le père présumé et la mère se présentent à l IHN le même jour pour le prélèvement mais à deux rendez- vous différents afin d éviter tout conflit possible entre eux. Le jour du rendez vous, il faut tout d abord s assurer de l identité des personnes convoquées. Puis une personne de l unité de génétique est chargée de leur expliquer le but d analyse. Et comme il s'agit d'une question particulièrement sensible, il est nécessaire que les personnes concernées donnent leur consentement par écrit, consentement qui, pour être valable, doit avoir été donné librement. Il doit donc être précisé sur le formulaire de consentement que la personne concernée a donné son accord de plein gré. Ensuite, des photos du trio : le père, l enfant et la mère sont prises pour être joint au dossier relatif à chaque cas traité à l INH. Enfin, le dossier d expertise doit contenir le consentement des personnes concernées, la lettre de demande d analyse délivrée par le tribunal, la lettre de convocation et le compte rendu de l expertise (voir les Annexes) Ainsi 31 demandes d analyse par test d ADN ont été confié à l unité de Génétique Médicale de l INH mais seulement 16 dossiers, on verra plus loin, ont été analysé. 59

85 II. Prélèvements et échantillons biologiques : Les tests ADN peuvent se faire à partir de nombreux types d échantillons biologiques qui contiennent des cellules. Les principaux prélèvements et échantillons biologiques utilisés pour la recherche de la paternité sont : le frottis buccal sur coton-tige et le sang. II.1. Frottis buccal sur coton-tige : Les cotons-tiges ou écouvillons stériles (deux par personne) s utilisent pour frotter l intérieur des deux joues dans la bouche (ils sont spécialement conçus pour leur introduction dans la bouche). Ils se sèchent une heure à l air libre et se gardent dans une enveloppe en papier prévue pour cet usage. Cette méthode est indolore et simple. L utilisation de coton-tige présente les avantages suivants: L ADN prélevé se conserve plusieurs mois à 4ºC dans un endroit sec et à l abri de la lumière. Se transporte facilement. Il est très discret. Le prélèvement d ADN est facilement réalisable. Cependant, à l INH le prélèvement d ADN se fait seulement par extraction sanguine. 60

86 II.2. Prélèvement sanguin : Tout prélèvement sanguin ne peut être effectué qu en présence d un personnel de l unité de génétique à l INH après contrôle des identités. On n est pas à l abri des falsifications. Le prélèvement de 4 à 8 ml de sang veineux se fait dans un tube contenant l EDTA comme conservateur, chélateur des ions divalents et cofacteurs des nucléases. L héparine de sodium ou de lithium ne servent pas car il inhibe la détection de marqueurs ADN et rendent l analyse impossible. L étiquetage des tubes est réalisé devant les intéressés et sont conservés ensuite à 20 C pour une extraction ultérieure. Un registre portant tous les renseignements nécessaires est rempli (numéro d ordre, dossier d expertise, demandeur d expertise, les références, les dates de convocation et de prélèvement ). 61

87 III. Extraction et purification de l ADN : L extraction de l ADN est une technique permettant de l isoler à partir d échantillons biologiques variés: cellules, tissus divers, cultures cellulaires, etc. Les stratégies appliquées dépendent du matériel d origine et de sa quantité disponible. Il existe différents protocoles pour extraire l'adn, qui suivent approximativement le même schéma de principe : - Lyse des cellules, - Elimination des protéines et des autres acides nucléiques (ARN...), - Concentration de l'adn par précipitation à l'alcool. Les techniques d extraction peuvent se classer en trois principales classes en fonction du principe auquel elles font appel : les méthodes utilisant des solvants organiques (cas d extraction au phénol-chloroforme), les méthodes utilisant des solvants non organiques (cas d extraction aux sels) et les méthodes basées sur l utilisation des kits commercialisés. III.1. Extraction de l ADN : III Extraction à partir des globules blancs : Le sang fraichement recueilli ou décongelé, doit être initialement mélangé à une solution hypnotique pour faire éclater les globules rouges, ensuite, le lysat est centrifugé et le surnageant est éliminé; ainsi, le culot cellulaire contenant les leucocytes est traité par une solution de lyse des globules blancs. Enfin, l ADN nucléaire libéré dans le milieu est le plus souvent traité par une protéinase très active : la protéinase K. 62

88 III Extraction au sel : Le sang est décongelé à + 4 C ou à température ambiante et la lyse cellulaire est effectuée immédiatement après la décongélation. Le sang total est soumis à une lyse complète de globules rouges par addition de deux volumes de tapon de lyse des hématies : l acide Etylène Diamine Tétracétique (EDTA) 20/5 (Tris-HCL 20mM ph 7.6 et 5mM d EDTA à ph8) et une incubation pendant 2 à 3 minutes dans la glace. Après une centrifugation à 2500 tours/minute pendant 5minutes, le surnagent est éliminé. Ces étapes sont répétées jusqu à l élimination de la totalité des globules rouges. Ainsi, le culot obtenu, constitué essentiellement de leucocytes est traité par une solution de lyse des globules blancs. Lyse des globules blancs : Les leucocytes sont soumis à une lyse après une addition de 3ml d une solution de lyse des blancs (SLB) (Tris HCL 10 mm à ph 7.6, EDTA 10 mm, NaCl 50mM, SDS 0.2%). Les préparations ainsi obtenues peuvent être isolées immédiatement ou conservées à -20 C pour une extraction ultérieure. Protéolyse : La protéinase K est ajoutée à raison de 0.2mg/ml de sang. Elle a pour but de digérer les protéines et libérer l ADN nucléaire dans le milieu. Les tubes sont ensuite incubés à 65 C pendant 4heures, ou à 42 C durant toute une nuit, sous agitation douce. 63

89 Extraction au sel : Cette technique présente l avantage par rapport aux techniques classiques d extraction au phénol-chloroforme, d être simple et rapide, aussi, les produits utilisés sont moins dangereux et moins onéreux. Le principe consiste à traiter le lysat cellulaire par une solution saline. On utilise en générale le Chlorure de sodium (NaCl) pour des échantillons d ADN contenant le Soduim Dédocyl Phosphate (SDS) puisque le Na Cl maintient le SDS soluble dans l éthanol. Aprés la protéolyse, les tubes sont additionnés de 4 ml d eau distillée stérile et d une solution de NaCl à 0.02 M final, puis mélangés et centrifugés à 3000 tours/minutes. Seul le surnageant est récupéré. Précipitation de l ADN : Cette étape a pour but de récupérer les acides nucléiques sous forme solide, ce qui permet d une part de les protéger, et d autre part, après séchage, de les resolubiliser à la concentration souhaitée. En même temps, les sels peuvent être éliminés. La précipitation de l ADN se fait dans l alcool éthylique, elle s effectue à forte force ionique (Na Cl 5M), l éthanol doit donc être à haute concentration (éthanol absolu). En effet, l ADN est soluble dans l eau (en raison de la polarité des deux composés), la précipitation par le sel casse cette interaction entre l ADN et l eau, permettant à l ADN de sortir de la solution et d être isolé facilement. Le rôle du sel est de neutraliser les charges de phosphate de sucre de l ADN ce qui rend l ADN moins hydrophile et donc beaucoup moins soluble en milieu 64

90 aqueux. Enfin, l ADN est lavé par l éthanol froid pour enlever le sel et précipite l ADN: formation de la méduse d ADN. Récupération de l ADN : L ADN est recueilli dans un tube à eppenforf puis séché au centrifugeur évaporateur pendant 20 minutes. Il est par la suite dissout et conservé dans le tampon Tris EDTA (TE) 10/1 (Tris-HCl 10 mm à ph 7.6 et d EDTA 1mM à ph8). Le volume ajouté est en fonction de la taille de la méduse de l ADN. III Extraction au kit QIAGEN : L extraction de l ADN génomique est réalisée sur mini colonnes (QIAGEN ). Cette technique simple et rapide. Elle s effectue en deux étapes à partir de 400 µl de sang : une étape de lyse qui consiste en l ajout du tampon AL et de la protéinase K et une étape de purification réalisée par l utilisation de l éthanol, des solutions Buffer AW1, Buffer AW2 ainsi que Buffer AE. Enfin les extraits d ADN peuvent être conservé à +4 C si les échantillons sont utilisés dans les jours qui suivent, ou à -20 C pour une utilisation ultérieure. Protocole d extraction d ADN au kit QIAGEN : Etape de lyse : 1. Prendre 400 µl de sang complet ; 2. Ajouter 400 µl de tampon AL et 40 µl de protéinase K ; 3. Vortexer 15 secondes et incuber à 56 C jusqu à la lyse complète (10 min); 65

91 Etape de purification : 1. Ajouter 400 µl d éthanol à 100% et vortexer 15 secondes ; 2. Centrifuger brièvement pour faire tomber les gouttes du bouchon ; 3. Préparer une colonne QIA Amp posée sur un tube collecteur par échantillon ; 4. Mettre sur le bouchon de la colonne le numéro de l échantillon ; 5. Déposer délicatement sans toucher la membrane 620 µl de la solution obtenue ; 6. Centrifuger à 8000tours/minutes pendant 1 minute ; 7. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur. Jeter l ancien tube collecteur et l éluât ; 8. Répéter les étapes 5 et 6 avec les 620 µl de la solution; 9. Ouvrir délicatement le bouchon de la colonne QIA Amp et y déposer 500 µl de Buffer AW1 ; 10. Centrifuger à 8000 tours/minutes pendant 1 minute : à cette étape l ADN est lavé ; 11. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur. Jeter l ancien et l éluât ; 12. Ouvrir délicatement le bouchon de la colonne QIA Amp et y déposer 500 µl de Buffer AW2 ; 13. Centrifuger à 1300 tours/minutes pendant 3 minutes : à cette étape l ADN est lavé ; 66

92 14. Placer la colonne QIA Amp sur un tube eppendorf de 1.5ml préablement identifié par le numéro attribué à l intéressé. Jeter le tube contenant l éluât ; 15. Déposer 50 µl de Buffer AE dans la colonne QIA Amp ; 16. Incuber à température ambiante 1 minute ; 17. Centrifuger à 8000tours/minutes pendant une minute. A cette étape, l ADN est élué ; 18. Jeter la colonne QIA Amp. Refermer chaque tube eppendorf contenant l ADN extrait et les conserver à +4 C si les échantillons sont utilisés dans les jours qui suivent l extraction ou à -20 C pour une utilisation ultérieure. III Extraction de l ADN au kit DNA IQ TM System-Database : Ce kit utilise une nouvelle approche pour l extraction de l ADN. Une résine paramagnétique est utilisée pour capturer l ADN. Elle est connue pour sa grande capacité de liaison à une certaine quantité d ADN même en présence d un échantillon en excès. Les rendements d ADN sont compatibles au sein d un même type d échantillon. La technique IQ DNA system évite l utilisation de produits organiques nuisibles à la santé tel que le phénol et permet aussi l élimination de plusieurs étapes de centrifugation utilisées dans les autres protocoles de purification de l ADN. 67

93 Protocole d extraction d ADN au kit DNA IQ TM System-Database : Afin d extraire l ADN de nos échantillons, 80µl de la solution Incubation Buffer/Protéinase K préalablement préparée est ajoutée à un volume sanguin de 10µl pour chaque échantillon. Le tout est incubé dans un bain mari à 56 C pendant une heure. Par la suite, 202 µl de la solution Résine/Lysis Buffer préalablement préparée (7µl de la Résine + 195µl du Lysis Buffer) est ajoutée au mélange. Après mélanger au vortex (3 secondes au bout de chaque minute pendant 5min), les tubes sont placés dans un portoir magnétique. Une nette pelotte bien distincte est formée sur les parois du tube en juxtaposition avec le barreau. Tout le liquide contenu dans le tube est ensuite éliminé sans atteindre la pelotte de résine. Par la suite, 100µl du Lysis Buffer est ajouté aux échantillons, qui sont mélangés au vortex pendant 2s à haute vitesse et remit à nouveau au portoir magnétique. Les tubes sont vidés du Lysis Buffer toujours sans atteindre la pelotte de résine et 100µl du Wash Buffer est ajouté par la suite. Les tubes sont mélangés au vortex 2s à haute vitesse, placés dans le portoir magnétique et éliminés de leurs contenus. Cette étape est répétée deux fois pour un total de trois lavages. Les tubes sont ensuite incubés dans le portoir magnétique, bouchons ouverts à température ambiante. L étape qui suit le lavage est l élution, pour cela, 100µl du tampon d élution est ajouté aux tubes, mélanger au vortex pendant 2s à haute vitesse et incuber par la suite à 65 C pendant 5min. Après incubation, les tubes sont mélangés au vortex pendant 2s et placés immédiatement dans le portoir magnétique. Enfin, l ADN est transféré soigneusement dans les tubes appropriés. 68

94 Figure 17. Méduse d ADN (agrégat blanchâtre) 69

95 III.2. Dosage et contrôle de la qualité de l ADN : L estimation de la concentration d ADN et sa pureté est effectuée par mesure de l'extinction dans l'uv au moyen d'un spectrophotomètre. L'ADN possède un maximum d'extinction à 254 nm. L absorption à cette longueur d onde est proportionnelle à la concentration d ADN. Considérons qu une unité d'absorbance à 254 nm correspond à environ 50 μg/ml d'adn double-brin, la concentration en ADN est donc déterminée par la formule suivante : [ADN] µg/ml = DO(254nm)x 50x 1/d (d: Facteur de dilution) Aussi, la qualité de la préparation est primordiale pour cela, il convient de contrôler la qualité d ADN en recherchant une éventuelle contamination par des protéines qui absorbent aussi bien à 260 nm qu à 280 nm. La pureté satisfaite de l ADN est appréciée par le rapport DO 260 /DO 280 qui doit être compris entre 1.8 et 2 ; une valeur inférieure à 1.8 témoigne d une contamination par des protéines, alors qu une valeur supérieure à 2, correspond à une contamination par des sels ; ces contaminations peuvent entrainer une erreur de la concentration réelle de l ADN, elles risquent également d inactiver ou de générer l enzyme polymérase qui sera utilisée dans l étape d amplification par PCR. Puis, il faut vérifier que l ADN extrait est de haut poids moléculaire, c'està-dire qu il n a pas été dégradé au cours de différentes manipulations d extraction et de purification. La qualité d ADN est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose horizontal à 1% dans un tampon Tris Acétate EDTA (TAE 1X) en présence de Bromure d Ethidium (BET), c est un agent mutagène qui s intercalent entre les bases puriques et les pyrimidiques des 70

96 deux brins d ADN permettant ainsi sa visualisation sous la lumière ultraviolette. Apres migration, un ADN de haut poids moléculaire montre une bande intense qui migre très lentement. En revanche, la présence d une trainée (smear) signifie que l ADN est dégradé suite à sa digestion par une nucléase donnant plusieurs fragments de différentes tailles. L ADN peut être utilisé immédiatement ou stocké à +4 C. 71

97 IV. Amplification d ADN par PCR : Dans la plupart des cas, après avoir extrait l'adn des cellules, on se rend compte qu'il y en a trop peu. C'est pourquoi de nombreuses techniques génétiques, sont fondées sur un procédé qui permet de reproduire de courts segments d'un brin d'adn et d'obtenir ainsi une quantité suffisante de matériel génétique pour procéder à des analyses. Ce procédé d'amplification s'appelle Polymerase Chain Reaction (PCR). Il a été mis au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en La technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique. Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d une matrice d ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l amplification est donc exponentielle [53]. IV. 1. Différents étapes d une PCR : La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange réactionnel qui comprend l extrait d ADN (ADN matriciel), la Taq polymérase, les amorces et les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dntp) en excès dans une solution tampon. Les tubes contenant le mélange réactionnel sont soumis à des cycles de température réitérés plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d un thermocycleur (appareil qui comporte une enceinte où l on dépose les tubes échantillons et dans laquelle la température peut varier, très 72

98 rapidement et précisément, de 0 à 100 C par effet Peltier). L appareil permet la programmation de la durée et de la succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes : La dénaturation en simple brin de l ADN : 94 C Le temps de la dénaturation varie de 30 secondes à 1 minute 30 secondes selon la taille de fragment. Cette première étape s effectue à une température de 94 C, dite température de dénaturation ; à cette température, l ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est dénaturé: les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80 C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires). L hybridation des oligonucléotides amorces : C La durée de l hybridation est comprise entre 40 secondes et 1 minute 30 secondes. Durant cette étape, la température est descendue à la température (T m ) dite d hybridation. Cette température est généralement comprise entre 50 C et 70 C et elle est fonction de la composition en désoxyribonucléotides des amorces, ces derniers reconnaissent et se fixent à leurs séquences complémentaires en reformant des liaisons hydrogènes. On dit que les amorces s hybrident au brin d ADN. 73

99 Le choix des amorces est particulièrement crucial pour obtenir des résultats satisfaisants. En effet, la séquence des amorces doit respecter un certain nombre de critères : - une longueur de 15 à 25 nucléotides en général, cette longueur est un facteur déterminant de la spécifité de l amplification d une séquence donnée. - pas de complémentarité entre les deux amorces, au risque de générer au cours de la réaction des dimères d amorces susceptibles de diminuer le rendement de la réaction. - une température de fusion T m voisine pour les deux amorces (soit une composition en A+T et G+T équilibrée) afin de faciliter le choix de la température d hybridation pendant la réaction. T m =4(nombre de G+C) +2(nombre d A+T) Plus l hybridation est sélective, plus elle est spécifique. Il est à noter qu au-delà du T m, l amorce se sépare de sa séquence complémentaire. En deçà, elle pourra s hybrider de façon non spécifique avec des séquences d ADN génomique présentant quelques homologies de structure. Actuellement, l introduction de logiciels spécialisés et des bases de données nucléotidiques o permis de réaliser des choix plus rationnels. La polymérisation : 72 C La troisième période s effectue à une température de 72 C, dite température d élongation. À 72 C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les 74

100 régions de l ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées. Au cycle suivant, les fragments synthétisés au cycle précédent servent à leur tour de matrice et au bout de quelques cycles, l espèce prédominante correspond à la séquence d ADN comprise entre les régions où les amorces s hybrident. Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une quantité analysable d ADN (environ 0,1 microgramme). Chaque cycle voit théoriquement doubler la quantité d ADN présente au cours du cycle précédent. Il est recommandé de rajouter un cycle final d élongation à 72 C, notamment lorsque la séquence d intérêt est de grande taille (supérieure à 1 kilobase), à raison de 2 minutes par kilobase. La PCR permet d amplifier des séquences dont la taille est inférieure à 6 kilobases. IV.2. Avantages, inconvénients et limites de la technique : Avantages : La technique de la PCR présente de nombreux avantages qui expliquent qu'elle se soit imposée dans tous les laboratoires spécialisés pour l'établissement des profils génétiques : Analyse de molécules fragmentées Mise en œuvre aisée : des réactifs pouvant être fournis sous forme de kits prêts à l'emploi. Analyse de petite quantité d ADN cible 75

101 Technique automatisable : le recours à l'informatique permet d'obtenir le résultat de l'analyse dans un délai très court, avantage décisif dans le cadre d'une enquête judiciaire [54]. Inconvénients : Le principal inconvénient de la PCR lié à sa très grande sensibilité est la contamination aisée du milieu réactionnel par d'autres ADN. On remédie à ce problème en utilisant des pointes de pipettes automatiques à filtre pour empêcher la formation d'aérosols et en travaillant dans un lieu où peu de préparations d'adn sont réalisées en parallèle [55]. Les limites de la technique : La taille du fragment à amplifier ne peut pas dépasser quelques kilobases. Au-delà, il se produit des phénomènes qui empêchent la réaction de se faire normalement : interruptions prématurées dues à la formation de structures secondaires, réappariement des fragments néosynthétisés entre eux etc Le taux d amplification est théoriquement de 2 n mais en pratique le rendement de la réaction n est jamais de 100%. Au-delà d un certain nombre de cycles, le taux d amplification baisse progressivement pour tendre vers 1. Ceci est dû à une diminution de la concentration des désoxynucléotides et des oligonucléotides et à l augmentation de la concentration du produit de PCR [56]. 76

102 Figure 18 : Analyse et principe de l amplification génétique (PCR) Source : 77

103 IV. 3.Kits d amplifications utilisés à l INH : Pour les tests de paternité, on utilise à l INH deux kits d amplification: L AmpFlSTR SGM Plus PCR Amplification et l AmpFlSTR Profiler plus PCR Amplification. IV AmpFlSTR SGM Plus : Le kit «AmpFlSTR SGM Plus PCR Amplification»est composé de 10 marqueurs STR autosomaux se répartissant sur tout le génome : D3S1358, vwa, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539, D19S433 THO1, FGA et le locus Amélogenine qui est utilisé pour l identification du sexe. Les marqueurs diffèrent entre eux par la taille et par le marquage : le 5- FAM, JOE, ou la teinture de NED, qui sont détectés respectivement comme bleu, vert et jaune, sur les instruments de séquençage PRISME ABI. 78

104 Tableau IV. Loci du kit AmpFl STR SGM Plus Locus Localisation chromosomique Motif de base commun Allèles Taille en (pb) Marquag e D19S433 19q (AAGG)(AAAG)(AAGG) (TAGG)(AAGG)n 9, 10, 11, 12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2 vwa 12p12-pter TCTA(TCTG)3-4(TCTA)n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 D18S51 18q21.3 (AGAA)n 7, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 Amélogenine X : p Y : p X Y FGA 4q28 (TTTC)3TTTT TTCT (CTTT)n CTCC (TTCC)2 D8S (TCTR)n R peut représenter Un A ou G D21S11 21q11.2-q21 (TCTA)n(TCTG)n[(TCTA) 3TA (TCTA)3 TCA (TCTA)2TCCA TA] (TCTA)n 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36, 37, 38 D3S1358 3p TCTA (TCTG)1-3 (TCTA)n 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 THO1 11p15.5 (AATG)n 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3, 10, 11, NED FAM bleu JOE vert 107 JOE NED FAM JOE FAM NED D16S539 16q24-qter (AGAT)n 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, FAM 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, FAM D2S1338 2q (TGCC)n(TTCC)n 23, 24, 25, 26, 27, 28 79

105 Les Composants de kit : Le kit «AmpFlSTR SGM Plus PCR Amplification» contient les réactifs nécessaires pour amplifier les différents régions de répétions. On présente dans le tableau suivant les composants de kit. La température de stockage recommandée pour chaque composant est inscrite dans l'encart de produit contenu dans chaque AmpFl STR SGM Plus. Tableau V. Composants du kit d amplification AmpFl STR SGM Plus Composants du Kit Volume Description AmpFl STR PCR Reaction Mix ( mélange de réaction) 1.1 ml/tube Deux tubes contenant Buffer, sel et : -MgCl2 Deoxynucleoside triphosphates (datp, dctp, dgtp, dttp) -Albumine de sérum bovin (BSA) AmpFl STR SGM Plus Primer (amorces) -Sodium azide (NaN3), 0.05% 1.1 ml chacune des amorces étant marquée par un fluorochrome différent permettant d attribuer un allèle à un système de STR donné. Chaque marquage englobe 4, 5 ou 6 marqueurs dont les tailles sont assez différentes pour permettre un génotypage exact et précis. AmpliTaq Gold DNA 50 μl/tube Deux tubes d'enzyme avec une activité Polymérase de 5 U / µ L (la Taq polémerase) l ADN de contrôle ml Un tube contenant 0.10 ng / µ L ADN génomique masculin humain à 0.05% NaN3 et Buffer Huile minérale 5 ml Une bouteille de compte-gouttes AmpFl STR SGM Plus Allelic Leadder (Echelle allèlique) 50 μl Un tube d'ampfl STR SGM Plus Allelic Leadder contenant tous les allèles possibles pour chaque marqueur 80

106 Informations sur l échelle allélique et l ADN de contrôle : TableauVI. L échelle allelique et informations sur l'adn de Contrôle du kit AmpFl STR Allèles du Allelic Locus Leadder D19S433 9, 10, 11, 12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2 vwa 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 D18S51 7, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 SGM Plus Autres allèles signalés Génotype de l ADN de contrôle , 18.2, 19 14, 15 10, 15.2, 18.2, 18.3, 19.2, 25 8, 9.2, 12.2, 15.1, 15.2, 15.3, 16.2, 16.3, 17.1, 17.2, 17.3, 18.1, 18.2, 19.2, 20.1, 20.2, 21.2, , 16 12, 15 Amélogenine X, Y - X, Y 17, 18, 19, 20, 21, 22, 12.2, 13, 15, 16, 16.1, 24, 26 FGA 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, , 17.1, 17.2, 18.1, 18.2, 19.1, 19.2, 19.3, 20.1, 20.2, 20.3, 21.2, 22.1, 22.2, 22.3, 23.2, 23.3, 24.1, 24.2, 24.3, 25.1, 25.2, 25.3, 26.1, 27.1, 27.3, 28.1, 29.2, 31, 32, 35.2, 49.2 D8S1179 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 6, 7, 20.2, , 13 D21S11 15, 16, 17, 18, 19 24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36, 37, , 26.1, 27.2, 27.3, 28.3, 29.1, 29.3, 30.1, 31.1, 31.3, 32.1, 32.3, 33.3, 34.3, 35.3, 36.2, 36.3, 37.2, , 31 D3S , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3, 10, THO1 11, 13.3 D16S539 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 D2S , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 9, 10, 11, 15.2, 16.2, 15, , 20 3, 5.3, 6.1, 6.3, 7.1, 7, , 8.3, 10.3, 14-9, 10-20, 23 81

107 Protocole d amplification au kit AmpFlSTR SGM Plus : 1. Dilution de l ADN - 1 ère dilution: Préparer 100µl d ADN à 100 ng/µl à partir de la solution mère. - 2 ème dilution: Préparer 100µl d ADN à 10 ng/µl à partir de la solution d ADN à 100 ng/µl - 3 ème dilution: Préparer 100µl d ADN à 2 ng/µl à partir de la solution d ADN à 10 ng/µl 2. Amplification génique Mettre dans chaque tube de 0.2 ml : a. 1 µl de la solution d ADN à 2 ng/µl b. 19 µl d eau milli-q c. 30 µl du mélange (voir préparation ci-dessous) Désignation Volume (N = nombre d échantillon) AmpFlSTR PCR Reaction Mix (N + 1)x 21 µl AmpliTaq Gold DNA polymerase (N + 1)x 1 µl AmpFlSTR SGM Plus Primer (N + 1)x 11 µl d. Vortexer et centrifuger (30s) 82

108 e. Placer les tubes dans le thermocycleur en choisissant le protocole suivant : 28 cycles 95 C 11 min 94 C 1 min 59 C 1 min 72 C 1 min 60 C 45min 3. Préparation des produits pour l injection 1. Dans chaque tube on met : Volume Désignation 24 µl Formamide désionisé 1 µl Marqueur de taille (GenScan-500 [ROX]) 1.5 µl Produit de PCR Il faut toujours ajouter un tube pour l Allelic Ladder qui sera traité comme les autres tubes. 2. Vortexer et centrifuger (30 s). 3. Dénaturer à 95 C pendant 3 min. 4. Placer les tubes immédiatement dans la glace pendant 3 min. 5. Placer les tubes dans le séquenceur 83

109 IV AmpFlSTR Profiler plus : Le kit «AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplification» combinant les avantages de la PCR et celle de la détection par fluorescence et qui permet d amplifier 9 Short Tandem Repeat (STRs) se répartissant sur tout le génome : D3S1358, vwa, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 et le locus Amélogenine dans un seul tube. On se contente de détailler que D13S317, D3S1358 et D5S818 puisque les autres marqueurs font aussi partie du kit SGM plus qu on a déjà présenté. TableauVII. Loci du kit AmpFlSTR Profiler plus Locus Localisation chromosomique Motif de base commun Allèles Taille en (pb) Marquage 8, 9, 10, 11, D13S317 13q22 31 (GATA)n 12, 13, 14, , 7, 8, 9, D7S820 7q (GATA)n 10, 11, 12, NED 13, 14, 15 7, 8, 9, 10, D5S1818 5q21 31 (AGAT)n 11, 12, 13, , 15, 16 84

110 Les composants de kit : Le kit AmpFlSTR Profiler plus contient les mêmes réactifs nécessaires à l amplification que l autre kit. Cependant les échelles alléliques se diffèrent et dont on détaillera dans le tableau suivant : Tableau VIII. Composants du kit d amplification AmpFl STR Profiler plus Composants du Kit Volume Description l ADN de contrôle 9947A 0.3 ml Un tube contenant 0.10 ng / µ L ADN de ligne cellulaire humain à 0.05% NaN3 et Buffer. Le génotype de cet ADN est : D3S , 15; vwa 17, 18; FGA 23, 24; D8S , 13; D21S11 30, 30; D18S51 15, 19; D5S818 11, 11; D13S317 11, 11; D7S820 10, 11 AmpFlSTR Blue Allelic Ladder AmpFlSTR Green II Allelic Ladder AmpFlSTR Yellow Allelic Ladder 25 μl Un tube d'échelle allelique bleue contenant 5-FAM allèles amplifiés suivants : D3S , vwa et FGA (incluant 26.2) 25 μl Un tube d échelle allelique Verte contenant JOE allèles amplifiés suivants : Amélogenine X et Y, D8S , D21S (incluant 28.2, 29.2, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 34.2, 35.2), D18S (incluant 10.2, 13.2, μl Un tube d'échelle allelique Jaune contenant NED allèles amplifiés suivants : D5S , D13S et D7S

111 Informations sur l échelle allélique et l ADN de contrôle : On cite seulement les informations concernant les marqueurs différents de kit AmpFlSTR SGM Plus. Tableau X. L échelle allelique et informations sur l'adn de Contrôle du kit AmpFlSTR Profiler plus Allèles du Allelic Locus Leadder D13S317 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 D7S820 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 D5S1818 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Autres allèles Génotype de l ADN signalés de contrôle 9947A 5 11, , 11-11, 11 Protocole d amplification au kit AmpFlSTR Profiler plus Voir celui de kit AmpFlSTR SGM Plus 86

112 IV. L électrophorèse capillaire en gel : L électrophorèse capillaire en gel permet de détecter et quantifier les différents produits de PCR mais aussi de les séparer en fonction de leur taille et de leur fluorescence. Cette méthode est directement comparable aux méthodes d électrophorèse conventionnelle. Dans une électrophorèse capillaire en gel, la séparation résulte de la migration des fragments d ADN dans un champ électrique au sein d un capillaire de quelques microns de diamètre et rempli de gel de polyacrylamide. Les molécules d ADN sont séparées en fonction de leur taille : les plus petites traversent plus facilement le maillage du polymère et migrent donc plus rapidement au travers de ce réseau. La détection et la quantification de la fluorescence des fragments (sous forme de pics colorés) sont effectuées par un détecteur LASER placé en fin de parcours migratoire. Ainsi, les fragments les plus petits sont chronologiquement détectés en premier et si deux (ou plusieurs) fragments ont la même taille, ils sont distingués par la couleur de leur fluorescence. Ce procédé d utilisation de colorations de différentes longueurs d onde inclus dans la PCR multiplex permet ainsi de distinguer des fragments chevauchants (même taille). Dans notre cas, les électrophorèses capillaires sont effectuées dans un Analyseur Génétique (ou séquenceur ADN semi-automatique) à détection LASER de la fluorescence (modèle ABI Prism 310, Applied Biosystems). Les séparations sont réalisées dans un capillaire de 47 cm de longueur (36 cm de la zone d injection jusqu au détecteur laser), de 50 μm de diamètre interne et rempli de gel de polyacrylamide à 4% ou POP4 (Performance Optimized 87

113 Polymer 4, Applied Biosystems 1 ). Les échantillons sont électrocinétiquement injectés dans le capillaire en 5 secondes. La migration électrophorétique de chaque échantillon dure 30 minutes, à 15 kv et à une température de 60 C. Avant la séparation électrophorétique des fragments d ADN, les échantillons sont préparés par l ajout de 24.5 μl du Hi-Di formamide et de 0,5µl d un standard de taille de fluorescence orange (GeneScan 500 LIZ, Applied Biosystems) à 1,5µl du produit PCR pour chaque échantillon. Comme dans une électrophorèse classique, ce marqueur de taille «interne», préalablement calibré et dont la taille de chacun des fragments-standards est connue, doit migrer en même temps que l échantillon afin de corréler l ensemble des paramètres pouvant influencer la migration (vitesse, temps de détection par le LASER, pureté du gel, température ). Dans chaque plaque d échantillons soumis à l électrophorèse capillaire, 1,5µl d un autre marqueur de taille («externe») est ajouté à 25µl du Hi-Di formamide : le adder STR ou le ladder allélique. Il s agit d une «échelle allélique» constituée de brins d ADN synthétique dont la composition et la taille (le nombre de répétitions) sont connus. Le ladder contient, en fait, tous les allèles STR pouvant être mis en évidence avec une PCR multiplex donnée et il y a une échelle allélique pour chaque fluorochrome utilisé [Figure 21]. Comme pour un échantillon, le standard de taille interne est ajouté au ladder, les fragments d ADN (allèles STR) sont séparés lors de l électrophorèse et la fluorescence est détectée par le LASER. La figure 20 présente le ladder des 4 couleurs utilisées dans une PCR multiplex. 1 Composition du polymère POP4 : 4% de poly-diméthylacrylamide, 8 M d urée, 5% de 2-pyrrolidinone et 100mM d acide N-tris(hydroxymethyl)-methyl-3-aminopropanesulfonique à ph 8. 88

114 Figure 19.ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER Figure 20.Description de l ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER 89

115 Figure 21. AmpFlSTR Blue, AmpFlSTR Green II, et AmpFlSTR Yellow Allelic Ladders utilisé dans la PCR Profiler plus (Applied Biosystems) et indiquant la désignation pour chaque allèle 90

116 Figure 22. Echelle allélique (Allelic Ladder) contenant tous les allèles possibles pour chaque marqueur utilisé dans la PCR SGM Plus (Applied Biosystems) 91

117 V. L obtention des profils STR : La dernière étape pour obtenir le profil STR d un individu consiste à traiter informatiquement les informations collectées par le LASER lors de l électrophorèse. La détection des produits de PCR d un échantillon par le LASER est transmise à un ordinateur (couplé au séquenceur automatique) et les STRs sont représentés sous forme de pics colorés (allèles STR). Le traitement des données se fait en deux temps : 1) Assignation d une taille (en paires de bases, pb) à chaque pic, 2) Détermination du nom de l allèle STR. Dans la première partie, le logiciel GeneScan Analysis (version 3.7, Applied Biosystems) trie les différents fragments selon leur fluorescence et leur longueur. Cette longueur est proportionnelle au temps de migration devant le LASER et se mesure en SCAN (Southern 1979). GeneScan détermine alors le «profil de séparation» du standard de taille interne (de couleur orange) en corrélant les longueurs (en SCAN) et les tailles (en pb) de chaque pic. Des profils de séparation sont ensuite tracés pour chaque échantillon (ainsi que pour le ladder) et, par comparaison avec le standard de taille, le logiciel estime la taille (en pb) de chaque fragment STR. Le séquenceur automatique a un haut pouvoir de résolution puisqu il permet de distinguer des fragments d ADN variant de seulement 2 pb. Dans la deuxième partie, le logiciel Genotyper (version 3.7, Applied Biosystems) commence par calibrer le standard de taille externe (ladder). A partir de la taille (en pb) de chaque allèle, le logiciel en déduit le nombre de motifs répétés et attribue cette valeur chiffrée (équivalente au nom de l allèle) à 92

118 chacun des pics du ladder. Les profils de séparation de chaque échantillon sont ensuite comparés aux échelles alléliques de référence et les noms des allèles STR sont déterminés pour tous les loci. On obtient ainsi le «profil électrophorétique» de chaque individu, c'est-à-dire son «profil STR». 93

119 Résultats et discussion 94

120 I. Présentation des dossiers : Dans le cadre civil, des études de recherche de paternité ont été confié au département de Génétique Médicale de l Institut National d Hygiène, à la demande de plusieurs tribunaux ; soit le tribunal de première instance soit le cours d appel des différentes villes du royaume tels : Tanger, Marrakech, Rabat, Fès, Agadir, Warzazat, Taza, Beni Mellal, Bouarfa, El Jadida, Figuig, Inezgane, Errachidia, Midelt, Taroudannt, Salé Asfi, khouribga, Safi (Asfi) L expertise de recherche de paternité faite de trois tests ADN (un couple et un enfant) coûterait autour de 7000 DH qui doit être déposé à la caisse du tribunal par les personnes concernées 95

121 L enfant Numéro d ordre Dossier expertise Références Date de Convocation Remarques Circonstance de naissance Sexe Age 04/01 04F01 04/02 04F02 Justice de la famille Justice de la famille / Ni la mère ni l enfant n ont assisté La mère n a pas assisté Doute de changement à la maternité Doute (le père est stérile) F - M - Concubinage M - 05/03 05F F 5 mois 05/04 05F03 Justice de la famille M 6 ans 05/05 05F En dehors du mariage 05/06 05F Le père présumé 8 ans et - F n a pas assisté 7 mois 05/07 05F F - Le père présumé: 05/08 - Code pénal Le père présumé La mère : n a pas assisté viol /09 05F07 Justice de la famille 05/ /11 05F09 05/12 05F08 05/13 05F10 05/14 - Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille 05/15 - Code pénal Le père présumé: La mère : Le père présumé: La mère : Le père présumé : Re-convocation : La mère : La mère n a pas assisté Le père présumé et l enfant : La mère : Le père présumé La mère : L enfant : Le père présumé La mère : La femme s est mariée et elle est enceinte depuis 2 mois M F 6 mois 5 ans Divorce Kola M 5 ans Mariage sans contrat Doute au cours du mariage F F 2 ans 4 ans et 7 mois - Divorce M 21 ans La mère n a pas assisté La mère n a pas assisté En dehors du mariage (la femme est mariée avec un autre) F 2 ans viol M - 96

122 L enfant Numéro d ordre Dossier expertise Références Date de Convocation Remarques Circonstance de naissance Sexe Age 06/01 - Justice de la famille le père présumé La mère : /02 - Code pénal /04 06F13 06/05-06/06 06F11 O6/08-06/09 06F15 06/10 06F16 06/11 06F12 06/12 06F18 06/13-06/07 06F14 O6 /14-06/15 - Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Justice de la famille Le père présumé n a pas assisté Le père présumé n a pas assisté Doute au cours du mariage Fiançailles Le père présumé n a pas assisté F 19 ans viol - - M (jumeau) 9 mois Fiançailles mariage M Le père présumé est décédé 9 ans et 4 mois - F 7 ans F 17 ans La femme est mariée et exclut de la maison conjugale M 1 an et 4mois En dehors mariage F 14 ans Divorce M Le père présumé n a pas assisté - Le père présumé n est pas assisté Ni le père présumé ni la mère n ont assisté 2 ans et demi Fiançailles - - Avant le mariage et avec un autre M 3 ans Fiançailles - - Divorce /16 - Justice de la famille Le père présumé n a pas assisté Divorce

123 II. Résultats : Les résultats obtenus, après analyse du polymorphisme des STRs, pour un individu sont constitués de deux chiffres correspondant aux deux «longueurs» (ou nombre de répétitions) des deux allèles hérités des deux parents, et cela pour chaque système. II.1.Tableaux récapitulatifs des résultats obtenus à l INH : 16 cas Résultats obtenus après amplification par le kit AmpFlSTR SGM Plus : Dossier d expertise D3S1358 vwa Amélogenine D8S1179 D21S11 D18S51 FGA D5S818 D13S317 D7S820 RESULTATS 04F F F , 16 17, 17 16, 17 17, 19 14, 17 17, 19 XY XX XX 12, 14 10, 15 14, 15 29, , 29 29, ,17 12, 15 15, 17 19, 21 22, 23 21, 22 11, 12 11, 12 11, 12 12, 13 8, 11 11, 12 10, 12 10, 11 10, 12 inclusion 05F F F , 19 15, 17 17,19 14, 18 17, 17 17, 18 XY XX XX 14, 15 10, 15 10, 14 29, 30 30, , , 16 15, 22 13, 15 23, 23 20, 23 23, 23 8, 12 11, 12 8, 12 8,13 11, 11 11, 13 9,11 11, 12 9, 11 inclusion 05F F F , 17 14, 16 16, 17 17, 18 16, 17 17, 17 XY XX XY 11, 12 12, 14 12, 14 27, , , , 14 12, 14 12, 14 20, 23 19, 24 23, 24 12,12 11, 12 11, 12 11, 12 11, 12 11, 12 11, 11 10, 10 10,11 inclusion ADN contrôle Lot : 9947A 14, 15 17, 18 XX 13, 13 30, 30 15, 19 23, 24 11, 11 11, 11 10,11-98

124 Résultats obtenus après amplification par le kit AmpFlSTR Profiler plus : Dossier d expertise 05F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 Amélogenine 15, 16 14, 16 14, 16 15, 17 17,18 17, 17 17, 17 16, 16 16,18 15, 18 15, 18 15, 15 15, 17 15, 16 15,17 15, 16 16, 16 16, 17 14, 17 16,16 16, 17 17, 18 15, 15 17, 15 16, 17 16, 16 16,16 14, 17 15, 16 15, 16 17, 17 15, 17 15, 17 16, 17 18, 18 17, 18 17,17 17, 18 15, 17 15,19 14,16 16, 17 16,19 14, 14 14, 16 14, 19 14, 17 16, 17 14,16 15, 17 16, 17 14, 17 17, 19 17, 19 14, 17 14,16 14, 16 14, 16 15, 16 16, 16 11, 13 9, 12 12, 13 11, 12 8, 11 8, 11 10, 11 10, 13 9, 13 9, 10 10, 11 11, 12 11, 11 10, 13 11, 13 12, 13 10, 13 11, 13 13, 13 8, 10 8, 13 11, 13 11, 13 11, 13 8,12 11, 12 11, 12 11, 11 8, 9 8, 13 NA, NA 19, 20 18, 19 17, 23 17, 22 17, 22 17, 17 17, 17 17, 20 19, 20 19, 20 17, 19 17, 20 16, 17 17, 20 17, 19 21, 22 20, 22 19, 20 18, 18 18, 19 17, 23 16, 20 16, 23 16, 20 19, 19 19, 20 17, 23 19, 20 19, 23 XY XX XY XY XX XX XY XX XX XY XX XX XY XX XX XY XX XY XY XX XY XY XX XX XY XX XY XY XX XY D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Résultats 14, 15 11, 13 11, 15 13, 13 13, 15 13, 15 13, 13 15, 15 12, 15 12, 14 10, 13 11, 13 10, 11 10, 13 11, 13 12, 14 10, 12 10, 15 14, 14 13, 14 13, 14 11, 15 10, 14 11, 14 12, 15 12, 15 12, 12 12, 15 12, 14 11, 12 29, ,30 29, 30 28, , 30 29, , , , , , , , , , , 30 29, , , , 30 30, , , 30 30, , 30 28, , 30 26, 31 27, , 29 NA, NA 19, 19 14, 19 12, 15 15, 15 12, 15 18, 18 13, 17 15, 17 15, 21 14, 16 16, 16 16, 22 13,15 15, 22 13, 18 14, 18 12, 18 17, 21 14, 17 14, 17 12, 17 14, 18 17, 18 16, 16 15, 17 16, 17 20, 20 13, 19 13, 19 12, , , , 16 13, 16 13, 16 14, , , , 13 13, 16 13, 16 13, , 12 12, , , 15 14, 14 13, 14 13, 14 14, 14 14, , 13 13, 14 13, 14 12,13 12, , 15 13, 13 13, 13 8, 8 6, 6 6,8 9, 9.3 8, 9 8, 9.3 9, 9 9, 9 9, 9 6, 10 10, 9.3 9,9.3 6,7 6, 9 7, 9 7, 8 7, 7 7, 8 8, 8 6,9.3 6, 8 7, 7 8, 9 7, 9 6,9 6, 9 6, 9 7, 9 8, 9 9, , 22 19, 23 22, 23 21, 24 21, 23 23, 24 20,23 21, 24 21, 24 24, 25 22, 23 22, 23 20, 26 19, 20 19, 26 22, 24 22, 32 22, 25 22, 24 22, 23 22, 23 19, 25 21, 22 22, 25 22, 24 21, 21 21, 24 22, 23 21, 24 21, 27 inclusion inclusion exclusion exclusion inclusion exclusion inclusion inclusion inclusion exclusion 06F F F F F F F F F ADN contrôle Lot : , 16 15, 17 15, 17 15, 18 15, 16 15, 18 17, 17 15, 17 15, 17 17,19 17, 19 17, 17 15, 17 15, 18 17, 18 16, 17 15,17 17, 20 10, 11 10, 13 9,13 9, 13 11, 12 11, 13 8, 11 12, 13 11,12 22, 23 17, 19 19, 23 20, 21 18, 23 21, 23 18, 21 17, 19 19, 27 XY XX XX XY XX XY XY XX XY 11, 14 10, 13 13, 14 13, 14 13, 15 13, 13 11,12 10, 15 10, 12 29, , , , 30 30, 31 30,30 29, 29 29, 29 29, , 15 15, 19 12, , , , , 16 14, 14 14,20 13, 15 14, 15 14, , , 13 12, , , 15 14, 15 8, 9 6, 9 6, 7 8, 9.3 9,9.3 8,9.3 6, 9 7, 9.3 7, 9 25,25 22, 25 22, 23 20, 23 19, 22 22, 23 20, 23 20, 22 20, 20 15,16 14, 16 9, 10 20, 23 XY 12, 13 28, 31 12, 15 14, 15 7, , 26 - Avec 0XF01 : le père présumé, 0XF02 : la mère et 0XF03 : l enfant exclusion inclusion exclusion 99

125 II.2. Exemples de Profils génotypiques Obtenus par le logiciel GenScan : Le profil d ADN est une valeur alphanumérique obtenue par ordinateur à partir du résultat de l analyse d un échantillon d ADN, représenté par un graphique. On trouvera ci-dessous deux exemples de profil établi à partir de dix loci. En matière de paternité, la comparaison porte sur le profil génétique de la mère, de l enfant et du père putatif. Au sein du profil de l enfant, l allèle maternel est identifié et l existence de l allèle du père présumé sera recherché dans le profil de l enfant. S il y a un allèle commun entre le père et l enfant, le père présumé peut être identifié comme le père biologique en indiquant la fréquence de cet allèle dans la population générale ; au contraire, si aucun allèle du père n est retrouvé dans le profil de l enfant, il y a exclusion et il ne s agira pas du père biologique de l enfant. L étude de l ADN dans les systèmes D3S1358, vwa, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539, D19S433 THO1, FGA et Amélogenine pour le profil 1 montre une inclusion de paternité alors que celui de profil 2 montre une exclusion. 100

126 Profil 1 : cas d inclusion (Dossier d expertise 05F09) 101

127 102

128 103

129 Profil 2 : Cas d exclusion (Dossier d expertise 05F10) 104

130 105

131 N.B : Le profil de l ADN contrôle positif n est pas affiché. Les pics figurant dans les profils ci-dessus correspondent aux allèles hérités des deux parents, et cela pour chaque système. Chaque pic correspond à un des locus : il y a deux pics pour le même locus chez un hétérozygote, un seul pic pour un homozygote. Les chiffres encadrés indiquent le nombre de répétitions du motif de bases de l allèle détecté à un locus. 106

132 II.3. Détermination de la probabilité de paternité (W) sans recours aux logiciels de calcul: Lors d une expertise en paternité, un calcul de probabilité est effectué. Ce calcul, tenant compte de l ensemble des marqueurs étudiés, est basé sur la fréquence des allèles dans la population de référence. Plus le caractère hérité de son père par l enfant est rare, plus il contribuera à élever la probabilité de paternité. 107

133 Résultats obtenus après amplification par le kit AmpFlSTR SGM Plus : Dossier d expertise n 04F01 La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D8S1179 D21S11 D18S51 FGA D5S818 D13S317 D7S820 Père 16, 16 17, 19 12, 14 29, ,17 19, 21 11, 12 12, 13 10, 12 Enfant 16, 17 17, 19 14, 15 29, , 17 21, 22 11, 12 11, 12 10, 12 Mère 17, 17 14, 17 10, 15 29, 29 12, 15 22, 23 11, 12 8, 11 10, 11 Schéma de transmission Numérateur 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 Allèle (a) F a chez la population marocaine Allèle (b) F b chez la population marocaine Formule 1/f a 0.5/ (f a+ f b ) 0.5/f a 1/ (f a+ f b ) 0.5/f a 0.5/f a 1/ (f a+ f b ) 0.5/f a 0.5/f a PI 3, ,1277 2,8653 3,7313 3,1056 1,5015 1,3774 1,0331 PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 1174, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,9149% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,9149%, ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de 0,0851 de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (04F01-01). 108

134 Dossier d expertise n 05F02 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D8S1179 D21S11 D18S51 FGA D5S818 D13S317 D7S820 Pére 16, 19 14, 18 14, 15 29, 30 13,16 23, 23 8, 12 8, 13 9, 11 Enfant 17, 19 17, 18 10, 14 30, , 15 23, 23 8, 12 11, 13 9, 11 Mére 15, 17 17, 17 10, 15 30, , 22 20, 23 11, 12 11, 11 11, 12 Schéma de transmission Numérateur 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 Allèle (a) F a chez la 0, population marocaine Allèle (b) F b chez la population marocaine Formule 0.5/f a 1/f a 0.5/f a 0.5/ (f a+ f b ) 0.5/f a 0.5/f a 0.5/ (f a+ f b ) 0.5/f a 0.5/ (f a+ f b ) Patern Index PI PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 388, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = % La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de % ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de 0,00026 de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (05F02-01). 109

135 Dossier d expertise n 05F03 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D8S1179 D21S11 D18S51 FGA D5S818 D13S317 D7S820 Pére 15, 17 17, 18 11, 12 27, 29 10,14 20, 23 12, 12 11, 12 11, 11 Enfant 16, 17 17, 17 12, 14 27, , 14 23, 24 11, 12 11, 12 10, 11 Mére 14, 16 16, 17 12, , , 14 19, 24 11, 12 11, 12 10, 10 Schéma de transmission Numérateur 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 Premier allèle (a) transmit F a chez la population marocaine Deuxième 12 allèle (b) transmit F b chez la population marocaine Formule de 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 1/ (f a+ f b ) 1/f a calcul Patern Index PI PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 36, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99728% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99728% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de 0,00272 de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (05F03-01). 110

136 Résultats obtenus après amplification par le kit AmpFlSTR Profiler plus : Dossier d expertise n 05F04 La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S13 58 vwa D16S5 39 D2S1338 D8S117 9 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Pére 15, 16 17, 17 11, 13 NA,NA 14,15 29, 31.2 NA, NA 12, , 8 22,22 Enfant 14, 16 15, 17 12, 13 18, 19 11, 15 29, 30 14, 19 12, , 8 22,23 Mére 14, 17 15, 17 9,12 19, 20 11, 13 28, 30 19, 19 13, , 6 19,23 Schéma de transmission Numérateur 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 Premier allèle (a) transmit F a chez la population marocaine Deuxième allèle (b) transmit F b chez la population marocaine Formule de 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 1/f a 0.5/f a calcul Patern Index PI 1,9456 2,1739 2,4752 2, ,6410 5,2083 2,5 PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : ,7107 Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,9998% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,9998%, ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de 0,0002 de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (05F04-01). 111

137 Dossier d expertise n 05F06 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Pére 15, 17 16, 17 11, 12 17,23 13,13 29, , 15 16, 16 9, ,24 Enfant 17, 17 17, 18 8, 11 17, 22 13, 15 29, , 15 13, 16 8, ,24 Mére 17, 18 18, 18 8,11 17, 22 13, 15 29, 30 15, 15 13, 16 8, 9 21,23 Schéma de transmission Numérateur 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 Premier allèle (a) transmit F a chez la population marocaine Deuxième allèle (b) transmit F b chez la population marocaine Formule de 0.5/f a 1/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a 0.5/ (f a+ f b ) 1/ (f a+ f b ) 0.5/f a 0.5/f a 0.5/f a calcul Patern Index (PI) PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 42, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99764% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99764% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (05F06-1). 112

138 Dossier d expertise n 05F09 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Pére 15, 17 16, 19 11, 11 17,20 10, , , 22 13, , 7 20,26 Enfant 15, 17 14, 16 11, 13 17, 20 11, , , 22 12, 13 7, 9 19,25 Mére 15, 16 14, 14 11,13 16, 17 10, , , 15 12, 12 6, 9 19,20 Schéma de transmission MUTATION PATERNELL E DELETION Numérateur 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 Premier allèle (a) transmit F a chez la population marocaine Deuxième allèle (b) transmit F b chez la population marocaine Formule de calcul Patern Index (PI) ,001 0, / 1/f a 0.5/f a 0.5/ 0.5/f a 0.5/ 0.5/f a 1/f a 0.5/f a (f a+ f b ) (f a+ f b ) (f a+ f b ) PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 499, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99979% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99979% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (05F09-1). 113

139 Dossier d expertise n 06F11 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Père 14, 17 14, 16 13, 13 19,20 14,14 28, , 21 13, 14 8, 8 22,24 Enfant 16, 17 16, 17 8, 13 18, 19 13, 14 30, , 17 14, 14 6, 8 22,23 Mère 16, 16 15, 17 8,10 18, 18 13, 14 27, 30 14, 17 13, 14 6, ,23 Schéma de transmission Numérateur 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Premier allèle (a) transmit Fa chez la population marocaine Deuxième allèle (b) transmit Fb chez la population marocaine Formule de 1/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa calcul Patern Index (PI) PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 27, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99636% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99636% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (06F11-1). 114

140 Dossier d expertise n 06F12 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Pére 17, 18 14, 17 11, 13 17,23 11,15 31, , 17 14, , 7 19,25 Enfant 15, 17 17, 19 11, 13 16, 23 11, 14 30, , 18 13, 14 7, 9 22,25 Mére 15, 15 17, 19 11,13 16, 20 10, 14 28, 30 14, 18 13, 13 8, 9 21,22 Schéma de transmission Numérateur 1 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 Premier allèle (a) transmit Fa chez la , population marocaine Deuxième allèle 13 (b) transmit Fb chez la population marocaine Formule de 1/fa 0.5/fa 1/ (fa+fb) 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 1/fa 0.5/fa 0.5/fa calcul Patern Index (PI) PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : , Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99999% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99999% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (06F12-1). 115

141 Dossier d expertise n 06F13 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Pére 16, 17 14, 17 8, 12 16,20 12,15 30, 30 16, 16 13, 14 6, 9 22,24 Enfant 16, 16 14, 16 11, 12 19, 20 12, 12 28, 30 16, 17 12, 14 6, 9 21,24 Mére 16, 16 14, 16 11,12 19, 19 12, 15 28, , 17 12, 13 6, 9 21,21 Schéma de transmission Numérateur 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 1 0,5 1 1 Premier allèle (a) transmit F a chez la population marocaine Deuxième allèle 9 (b) transmit Fb chez la 0.25 population marocaine Formule de 1/fa 0.5/fa 0.5/fa 1/fa 0.5/fa 0.5/fa 1/fa 0.5/fa 1/ 1/fa calcul (fa+fb) Patern Index (PI) PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : 204, Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99951% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99951% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (06F13-1). 116

142 Dossier d expertise n 06F16 : La Probabilité de la transmission génétique et calcul de PIC (Patern Index Combined) : STRs D3S1358 vwa D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 THO1 FGA Pére 15, 18 15, 17 9, 13 20,21 13,14 30, , , 12 8, ,23 Enfant 15, 18 17, 18 11, 13 21, 23 13, 13 30, , , 13 8, ,23 Mére 15, 16 15, 18 11,12 18, 23 13, 15 30, 31 13, , 13 9, ,22 Schéma de transmission Numérateur 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Premier allèle (a) transmit Fa chez la , population marocaine Deuxième allèle (b) transmit Fb chez la population marocaine Formule de 0.5/ (fa+fb) 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/fa 0.5/ (fa+fb) 0.5/fa calcul Patern Index (PI) PIC (Patern Index Combined) ou encore appelé Indice de Paternité Combiné: il se calcule en multipliant les indices de paternités (PI) obtenus pour chaque système, soit : , Probabilité de paternité W = (1+1 /PIC) -1 = 99,99999% La transmission génétique des parents aux enfants se fait par définition 50% de la mère biologique et de 50% du père biologique, dans ce cas la transmission génétique ai réalisable de père putatif à son enfant avec un PIC de l ordre de 99,99999% ce qui veut dire que au sein de la population génale marocaine on à une probabilité de de trouver un autre individu qui ressemble à notre père putatif (06F13-1). 117

143 Tableau IX. Fréquence allélique des 15 marqueurs STRs dans la population marocaine inclus dans le kit AmpFlSTR Identifiler PCR D3S1358 vwa FGA THO1 TPOX CSF1PO D5S818 D13S317 D7S820 D8S1179 D21S11 D18S51 D16S539 D2S1334 D19S , , ,001 0,185 0, ,001 0,233 0,032 0,015 0,001 0, ,019 0,192 0,409 0,029 0,048 0,076 0,15 0,001 0,001 0, ,003 0,25 0,194 0,024 0,037 0,049 0,093 0,001 0, ,003 0,136 0, ,001 0,003 0,274 0,307 0,063 0,049 0,338 0,097 0,001 0,008 0,064 0, ,009 0,34 0,275 0,326 0,268 0,141 0,019 0,295 0,004 0, ,001 0,001 0,284 0,391 0,363 0,146 0,122 0,003 0,152 0,301 0, ,001 0,009 0,185 0,135 0,206 0,001 0,122 0,202 0,004 0, ,003 0, ,071 0,128 0,235 0,137 0, , ,284 0,193 0,196 0,15 0,003 0, ,257 0,23 0,001 0,171 0,048 0, ,246 0,23 0,001 0,134 0,282 0, ,139 0,15 0,003 0,075 0,099 0, , ,02 0,046 0,001 0, ,14 0,003 0,031 0,17 0, ,161 0,001 0, ,2 23 0,211 0, , ,14 0, ,097 0, , , , , , , , , ,011 La détermination de la fréquence allélique des 15 marqueurs STRs est réalisée sur 425 individus appartenant aux différents ethnies constituant la population marocaine : sahraou,i berbères et arabes. 118

144 III- Discussion Dans notre société moderne, les circonstances à l'occasion desquelles se pose le problème de l'identification individuelle ainsi que l établissement de sa filiation sont nombreuses. Pour faire face à ce problème, des progrès considérables ont été réalisés grâce à la technique des empreintes génétique. L utilisation des polymorphismes de l ADN à des fins d identification de personnes demeure un élément de preuve très performant offert par la science médico-légale. De plus, l utilisation de l ADN est une méthode très fiable et reproductible. Aujourd hui, la méthode de référence employée dans le domaine de la filiation génétique repose sur l exploitation du polymorphisme des microsatellites. Ces séquences permettent de distinguer les individus qu ils soient apparentés ou non [Cotton et al., 2000]. L'analyse de microsatellites autosomaux permet d'obtenir des résultats sûrs et possédant un pouvoir de discrimination très élevé à partir de nombreux types d'échantillons [Buckleton et al., 2005]. Méthode bien ancrée dans les laboratoires, elle est désormais uniformisée et à la base du système d identification que ce soit dans le cadre des connaissances des fréquences alléliques et des taux de mutation ou dans celui de la construction de bases de données nationales de profils génétiques. L objectif de notre travail est d étudier des dossiers de recherche de paternité traités de 2004 à 2006 au Département de Génétique Médicale à l INH de Rabat ainsi que de déterminer leur probabilité de paternité (W). Cette dernière dépond du nombre des marqueurs génétiques STRs utilisés, en effet plus celui-ci est important plus les résultats de calcul approchent du 100%, la 119

145 raison pour laquelle aujourd hui les tests de filiation utilisent plus de 15 STRs. Nous avons calculé cette probabilité de paternité sans recours aux logiciels de calcul compliqués et en tenant compte de la fréquence allélique de chaque marqueur génétique dans la population marocaine [Bouabdellah et al., 2007]. Pour ce faire, le traitement d un échantillon sanguin a permis d'isoler de l'adn génomique. Grâce à une amplification ciblée des marqueurs microsatellites moyennant une la technique de PCR, une empreinte génétique (ou profil ADN) est générée, qui est spécifique à chaque individu. L analyse du polymorphisme des individus concernés peut s opérer à partir de plusieurs types de marqueurs génétiques. Un premier consensus international appartenant au groupe Interpol a mis en place un jeu de sept marqueurs appelé le groupe standard de loci d Interpol (Interpol Standard Set of Loci, ISSOL) : D18S51, D8S1179, D3S1358, THO1, vwa, FGA et D21S11 Dans une deuxième phase de nouvelles combinaisons de marqueurs ont vu le jour selon un effort de standardisation international et se référant au système nord américain CODIS de l'anglais Combined DNA Index System. Ce système utilise 14 marqueurs génétiques, incluant un déterminant du sexe (Amélogénine) : D3S1358, vwa, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D13S317, D7S820, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, et D5S818. Il permet une transmission électronique fiable et valide dans un format sécuritaire. Le FBI et le ministère américain de la Justice offrent le logiciel sans frais à tout organisme d'application de la loi effectuant des analyses génétiques suivant un code similaire de justice et d'assurance de la qualité. Une fois que le profil génétique est bien formaté, il est téléchargé vers CODIS depuis le Fichier des condamnés. 120

146 A partir de là, différentes firmes particulièrement Applied Biosystems et Promega ont élaboré des kits de 10, 11, 16 et 17 marqueurs génétiques (AmpFlSTR Identifiler, Direct et NGM PCR Amplification Kit, Powerplex, ). Ces kits ont fournit un nouveau niveau de performance, permettant l établissement rapide de plus d échantillons d'adn. Il faut rappeler que la dernière génération de Kit NGM PCR, inclut cinq nouveaux marqueurs génétiques plus rares recommandés par le Réseau Européen d'instituts de Science Médico-légaux (ENFSI) et le Groupe d'analyse génétique européen (EDNAP) fournissant ainsi le niveau le plus haut de qualité de données et une discrimination plus puissante. Dans le présent travail, le Département de Génétique Médicale de l INH a réalisé les tests, grâce à deux kits d amplification l AmpFlSTR SGM plus et l AmpFlSTR Profiler plus commercialisés par la société Applied Biosystems. Ces kits qui contiennent respectivement 9 et 10 marqueurs STR autosomaux à part l amélogénine qui représente un marqueur pour la détermination du sexe, ont permis l analyse d une dizaine des cas de recherche de paternité. En effet, sur 31 demandes des tests d ADN, seulement 16 dossiers ont pu être analysés suite à la présence des concernés et nous avons eu alors 10 inclusions de paternité et 6 exclusions de celle- ci. Le nombre d absences important des personnes concernées par ce test : 05 absences chez les mères et 09 chez les pères présumés dont un est décédé donc 15 au total, c'est-à-dire que seulement 50% des demandes d analyse ont été réalisées, ce qui met en cause l efficacité des lettres de convocation envoyées aux intéressés et fait appel à la mise en place d autres moyens plus rigoureux qui les obligent à assister surtout que ces analyses sont demandées sur décision de justice. De plus, le nombre 121

147 important de demande de recherche de filiation ces dernières années au Maroc montre le besoin de la mise en place d un cadre légal à ce type d expertise surtout que la révélation ou non d une paternité est très sensible et pourrait avoir des répercussions très néfaste sur la stabilité de la famille. Les circonstances de naissance des enfants concernés par la recherche sont variées : fiançailles, divorce, viol, doute...etc. Aussi, l analyse des résultats montre des différences dans les âges de ces enfants, ils varient de 5 mois à 21 ans, ce qui montre que ces demandes de recherche de paternité concernent des situations familiales différentes dont le seul point commun est la non reconnaissance du père. Certains dossiers ont obtenu des résultats rapides alors que d autres ont trainés dans les tribunaux pendant des années, et c est les enfants en question qui ont pris la charge de suivre la procédure ou de la réactiver de nouveau (comme dans le cas du dossier d expertise n 05F10 où l enfant est âgé de 21 ans). En recherche de paternité, les tests d ADN sont tout à fait fiables lorsqu ils sont pratiqués dans de bonnes conditions de laboratoire et leurs résultats doivent être identiques même s ils sont faits par différents laboratoires. Ils sont réalisés, dans les pays où des lois encadrant cette activité existent, par des spécialistes ayant des qualifications dans les domaines de la génétique et de la biologie moléculaire, ayant une expérience prouvée dans des laboratoires d analyse de l ADN et exerçant dans des structures accréditées. Ces spécialistes sont appelés également à s inscrire comme des expertes auprès des tribunaux. Si ces tests sont fascinants du point de vue technique, ils ne peuvent être librement proposés à toute personne souhaitant vérifier sa filiation. Les conséquences d une telle utilisation abusive seraient dramatiques 122

148 pour les familles et la société. C est la raison pour laquelle de nombreux pays limitent leur utilisation à des situations bien précises et dans la plupart des cas en réponse à une procédure judiciaire. Le consentement de la personne est obligatoire pour réaliser des tests ADN, car sans ce dernier, ils constituent une atteinte à son intégrité physique et une intrusion à son intimité personnelle, puisqu il s agit de son patrimoine génétique. Au département de Génétique Médicale de l INH, malgré l absence d une loi claire qui encadre ce type de recherche, le chef de département a mis en place des règles qui interdisent tout test ADN en dehors d une demande de la part de la justice ou sans le consentement éclairé rédigé en arabe et signé par les personnes concernées (voir Annexe II). Cette attestation est une pièce maitresse qui figure dans tous les dossiers traités. Les rapports d expertise (voir Annexe IV) sont rendus directement, sans intermédiaire, aux juges qui ont en fait la requête. Ces tests de paternité réalisés à l Institut National d Hygiène de Rabat ont été d une grande utilité pour les familles surtout depuis la mise en place du nouveau code de la famille. Cependant, cette activité est actuellement suspendue (voir Annexe VII) en raison du vide juridique, en la matière qui existait toujours et le nombre important des demandes qui génèrent une gestion trop lourde et non informatisée des dossiers nécessitant ainsi un réel besoin de structuration nouvelle de Département de Génétique Médicale et le renforcement de ses moyens humains. 123

149 Conclusion et Perspectives 124

150 L analyse d ADN au service de la justice est devenue un outil incontournable depuis son développement dans les années 80. Historiquement, elle trouve son origine dans l évolution rapide des techniques de génétique moléculaire dont les applications les plus importantes se retrouvaient dans le monde médical. «L empreinte génétique» ou encore «profil génétique» a rendu possible la recherche de la vérité biologique et donc faciliter et accélérer les démarches d une recherche de paternité. Nous avons cherché à travers ce modeste travail à étudier des dossiers relatifs à la recherche de paternité traités de 2004 à 2006 au Département Génétique Médicale à l INH de Rabat. L analyse de 16 dossiers a révélé 06 exclusions et 10 inclusions de paternité. Quand celle-ci est exclue, on peut donner une réponse absolue. Cependant dans le cas contraire, un calcul de probabilité a été effectué. Ce dernier a donné une précision d ordre 99,99% ce qui prouve la fiabilité des méthodes utilisées dans une telle recherche. Un constat important de cette étude est la variété d âges des enfants objets de cette recherche ainsi que les circonstances de leur naissance. Les techniques de profils génétiques ou génotypage ont mis en évidence les régions polymorphes du génome des individus. Elles ont permis d'établir les relations de parenté intrafamiliales. Aujourd'hui, les méthodes appliquées en routine sont complémentaires. L analyse des marqueurs de l ADN mitochondrial permettent de retracer les lignées maternelles et ceux du chromosome Y les lignées paternelles. Alors que celle des marqueurs de l ADN nucléaire (STRs autosomaux) permet de déduire des liens de proche parenté (parents/enfants, grand parents/petits enfants, oncle/neveu, frère/frère, etc.) et d'obtenir ainsi des résultats fiables, reproductibles et applicables à de nombreux 125

151 types d'échantillons. En effet, ces microsatellites (STRs) sont détectés par amplification PCR grâce à des amorces marquées par des fluorophores et analysés par électrophorèse capillaire automatique. Les kits commercialement disponibles permettent l'analyse entièrement automatisée et simultanée de plusieurs marqueurs ainsi que celle du gène de l'amélogénine afin de révéler le sexe de la personne. Autres méthodes d identification basées sur l analyse de fragments d ADN plus courts sont en train de se développer comme les SNPs qui sont des polymorphismes ponctuels de séquence. Les avantages de l'analyse de ces marqueurs par rapport à celle des marqueurs traditionnels, permettent d'entrevoir un bon avenir pour eux. En effet, leur caractère biallélique permet une expression du résultat de détection simple compatible avec une grande diversité de plateformes d analyse et un fort potentiel d automatisation. Un autre aspect important de l'utilisation des marqueurs bialléliques réside dans leur tendance à être spécifiques d une population ; un marqueur qui est polymorphe dans une population peut ne pas l être dans une autre. Cette tendance, néanmoins observée, est moindre pour les marqueurs microsatellites qui sont généralement polymorphes à travers diverses populations. Dans les deux cas (SNP et STR), la plupart des génotypes se retrouvent dans toutes les populations humaines. Cependant, leur fréquence peut varier d'une population à l'autre. Cela signifie que les marqueurs SNP doivent être générés spécifiquement pour la population étudiée et que des études détaillées de très grands échantillons de populations doivent précéder leur généralisation. Encore faut-il préciser que la taille des fragments d intérêt est inférieure à celle des fragments ciblés lors de l analyse STR. Par définition, un SNP 126

152 correspond à une seule base mais sa détection spécifique dépend de ses séquences bordantes. De plus, le taux de mutation de ces marqueurs est d environ 10-8 contre 10-3 pour les marqueurs STRs. Ainsi, ces marqueurs portent l information relative à des périodes de temps plus longues en comparaison des microsatellites ou des minisatellites puisque les allèles seront transmis sans altération sur un plus grand nombre de générations d où leur utilisation en tests de parenté. En conclusion, les méthodes d analyses de notre patrimoine génétique vont encore évoluer, progresser et s améliorer. En effet, la connaissance du génome n est pas totale, du à la complexité de celui-ci, cependant elle est en plein essor. 127

153 Résumés

154 RÉSUMÉ Titre : Application des empreintes génétiques dans l'établissement de la filiation parentale: A propos de 16 dossiers analyses A L'INH de Rabat Rapporteur : Mr A. SEFIANI Auteur : Amira HORCHANI Mots clés : Filiation Empreintes génétiques Biologie moléculaire La recherche de paternité est une procédure normalement suivie en cas de problème de filiation. Longtemps basée sur des éléments phénotypiques : analyse des systèmes polymorphes tels que les systèmes Rhésus, ABO et HLA, cette procédure a bénéficié ces dernières années des progrès réalisés en biologie moléculaire et l usage des empreintes génétique couramment appelée «test de l'adn». Ces méthodes sont basées sur le concept que deux individus, ne peuvent avoir le même ADN, excepté les vrais jumeaux. L utilisation combinée de plusieurs marqueurs génétiques de type microsatellite (STR), actuellement commercialisés sous forme de kits, a rendu les recherches de paternité plus fiables avec une précision de l ordre de 99.99%. Aujourd hui les juristes tentent de faire coïncider la réalité juridique et la réalité biologique. Au niveau européen et depuis la mise en place du Code Napoléon, les pays concernés ont facilement adopté la technique d empreintes génétiques dans la confirmation du lien de paternité et acceptent en conséquence la preuve par l ADN. Au Maroc et depuis la promulgation du code de la famille, les tribunaux demandent de plus en plus ces tests pour résoudre des problèmes de filiation. Nous présentons ainsi dans ce travail, une analyse des premiers dossiers de la recherche de paternité par empreintes génétiques réalisés au Département de Génétique Médicale de l Institut National d Hygiène de Rabat. Si l utilité de cette analyse n est plus discutable comme preuve irréfutable de lien de paternité, il demeure urgent d accompagner le recours à ces tests ADN au Maroc par une mise en place de testes juridiques qui encadrent leur pratique.

155 Summary Title: Application of genetic fingerprints in the estabilishment of the parental filiation: about 16 files analyzed in the INH of Rabat Reporter: Mr A. SEFIANI Author: Amira HORCHANI Keywords: Filiation Genetic fingerprinting Molecular biology The establishment of paternity is a procedure normally followed in case of problem of filiation. For a long time, based on phenotypic features: an analysis of polymorphic systems such as systems Rhesus, ABO and HLA, this procedure has benefited these last years from the progress realized in molecular biology and the use of genetic fingerprinting usually called DNA test. These methods are based on the concept that two individuals can not have the same DNA, except identical twins. The combined use of several genetic markers of STR, currently marketed in kit form, made paternity research more reliable with a precision of the order of 99.99%. Today jurists are trying to coincide the legal reality and the biological reality. At European level since the introduction of the Code Napoleon, the concerned countries easily adopted the technical of genetic fingerprints in the confirmation of the link of paternity and accept consequently the proof by the DNA. In Morocco and since the promulgation of the code of family, the courts require more these tests to solve problems of paternity. We shall present in this work, an analysis of the first cases of the establishment of paternity by genetic fingerprints realized in the Department of Medical Genetic of the National Institute of Hygiene of Rabat. If the utility of this analysis is not debatable any more as irrefutable proof of paternity link, it remains urgent to support the use of DNA tests in Morocco by setting up legal text which supervise their practice.

156 «HLA» ABO Rhésus %

157 Annexe

158 Annexe I : Exemple d une lettre de convocation envoyée par l expertise aux personnes concernées par la recherche de paternité

159 Annexe II : Le consentement rédigé en arabe Annexe III : Exemple du dossier d étude de filiation par empreintes génétiques

160

161

162 Annexe IV : Exemple du rapport d expertise envoyé au tribunal

163

164 Annexe V : Tableau des allèles

165 Annexe VI : Schémas de transmission des parents à l enfant

166 Annexe VII : Exemple de lettre de refus envoyée par l unité de Génétique au tribunal demandeur de recherche de paternité par test d ADN

167 Références bibliographiques

168 [1] Wikimediafoundation.org: [2] Laboratory of Forensic Genetics and Molecular Archeology URL: [3] M. Christian CABAL (a), M. Jean-Yves LE DÉAUT (b), M. Henri REVOL (c) : OPECST - Empreintes génétiques, rapport n 3121 sur LA VALEUR SCIENTIFIQUE DE L'UTILISATION DES EMPREINTES GÉNETIQUES DANS LE DOMAINE (a) Député, (b) Premier Vice Président de l'office, (c) Président de l'office - [4] B. LUDES (a), P. MAGIN (b) : Les empreintes génétiques en médecine légale (a) Maitre de conférences à la faculté de médecine de Strasbourg, (b) Professeur de médecine légale à la faculté de médecine de Strasbourg, Directeur de l Institut de médecine légale de Strasbourg. [5] H. Chaabouni : Analyses de l ADN : tests génétiques au service de la justice, Service des maladies congénitales et héréditaires, hôpital Charles Nicolle de Tunis [6] H. HAYES : ADN et chromosomes, INRA, Laboratoire de Génétique Biochimique et de Cytogénétique, Jouy-en-Josas cedex hayes@biotec.jouy.inra.fr [7] L'ADN :Qu'est-ce Que C'est? [8] H. Boris : Les marqueurs moléculaires en génomique structurelle et fonctionnelle, les SNP concepts et applications [9] J.M.Butler: Forensic DNA typing, Elsevier, USA (2005) [10] J. Etienne, J.E.Decant, E.Clauser, C.Housset, P. Roingeard : Biochimie génétique, biologie moléculaire (2006) (Figure 4).

169 [11] E. Petkovski : Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l Université Louis Pasteur, StrasbourgI, Discipline : Sciences du vivant - Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Polymorphismes ponctuels de séquence et identification génétique, Etude par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Time Of Flight), Soutenue publiquement le 10 février 2006 [12] A. M. Lupo (a), V. V. Huffel (a) and P. Rouger (a ) : Les empreintes génétiques : nouvel outil en médecine légale a) Unité de polymorphisme génétique, institut national de la transfusion sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, Paris cedex 15, France [13] W. Schuller, L. Fereday, R. Scheithauer : Recommandations du Groupe d experts d Interpol sur le suivi des techniques dans le domaine de l analyse d ADN, Première édition : Lyon, juin 2001, [14] Ch. Doutremepuich (a) et F. Doutremepuic (b) : Les empreintes génétiques en pratique judiciaire (a) Expert judiciaire, professeur à l université de Bordeaux II, agrée pour la réalisation des empreintes génétiques (b) Expert judiciaire, agrée pour la réalisation des empreintes génétiques [15] Balisage du génome - Génétique [16] F. PITEL, J. RIQUET : Polymorphismes génétiques : Les marqueurs Anonymes et la détection de leur polymorphisme, INRA Laboratoire de Génétique Cellulaire, BP, 27, Castanet-Tolosan cedex, pitel@toulouse.inra.fr)

170 [17] Cours de Génétique des Populations, par F. Fleury Univ. CB Lyon 1- Chapitre 2 - La variabilité génétique dans les populations naturelles). [18] Genetics Analysis of genes and genomes, D L Hartl, Jones and Bartlett Publishers, 2004, p. 73) [19] B. Najimi : Applications des marqueurs moléculaires dans l amélioration du blé tendre pour la résistance aux maladies et aux insectes, Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2003) [20] S. HERDER : THESE présentée à l Université de Montpellier II Sciences et Techniques du Languedoc pour obtenir le diplôme de DOCTORAT SPECIALITE : Biologie des Populations et Ecologie, Formation doctorale : Parasitologie, Ecole Doctorale : Biologie des Systèmes Intégrés, Agronomie - Environnement VARIABILITE GENETIQUE D ONCHOCERCA VOLVULUS (LEUCKART, 1893). RELATIONS AVEC LES FACIES ; EPIDEMIOLOGIQUES DE L ONCHOCERCOSE. Soutenue le 28 Juin 1994) [21] Discovery and Application of SNP Markers in Plants, DBHATTRAMAKKI, CAB International, 2001) [22] L. Quintana-Murci, S. Jamain and M. Fellous : Origine et évolution des chromosomes sexuels des mammifèresthe origin and evolution of mammalian sex chromosomes.unité d immunogénétique humaine, Inserm E21, Institut Pasteur, 25, rue du Dr-Roux, Paris cedex 15, France.

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174 Serment de Galien Je jure en présence des maîtres de cette faculté : - D honorer ceux qui m ont instruit dans les préceptes de mon art et de leur témoigner ma reconnaisse en restant fidèle à leur renseignement. - D exercer ma profession avec conscience, dans l intérêt de la santé public, sans jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et sa dignité humain. - D être fidèle dans l exercice de la pharmacie à la législation en vigueur, aux règles de l honneur, de la probité et du désintéressement. - De ne dévoiler à personne les secrets qui m auraient été confiés ou dont j aurais eu connaissance dans l exercice de ma profession, de ne jamais consentir à utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et favoriser les actes criminels. - Que les hommes m accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses, que je sois méprisé de mes confrères si je manquais à mes engagements.

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