AGRÉGATION DE BIOCHIMIE - GÉNIE BIOLOGIQUE SESSION 2004 ÉPREUVE PRATIQUE DE MICROBIOLOGIE

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1 1 AGRÉGATION DE BIOCHIMIE - GÉNIE BIOLOGIQUE SESSION 2004 ÉPREUVE PRATIQUE DE MICROBIOLOGIE Sujet proposé par I. ETIENNE, B. SALLEN, F. VINCENT et D. LONCLE, P. MICHAUX, JC. OGIER Les antibiotiques Souches productrices, mécanismes d'action et de résistance Cadre de l'étude Le problème croissant de la résistance des bactéries pathogènes aux antibiotiques passe par le développement de nouvelles molécules, une meilleure compréhension de leur mode d'action et des mécanismes de résistance. Le sujet aborde ces 3 aspects. Historiquement, les premiers antibiotiques utilisés furent des métabolites sécrétés par des moisissures. Dans la partie A, on cherchera à mettre en évidence la sécrétion par une souche de moisissure d'un tel métabolite, directement et après extraction. Trois souches bactériennes tests seront utilisées pour cette étude. On procèdera également à une identification microscopique de la souche de moisissure. Dans la partie B, on se propose d'analyser un mécanisme de résistance par efflux actif de l'antibiotique grâce à la pompe NorA de Staphylococcus aureus, et de mettre en évidence l'action d'un inhibiteur de cette pompe, la réserpine. La pompe NorA est un transporteur comprenant 12 segments transmembranaires ; elle utilise la force protonmotrice pour expulser diverses molécules dont les fluoroquinolones, en particulier la ciprofloxacine. La réserpine est décrite dans la littérature comme un inhibiteur de la pompe NorA. Lorsque des bactéries sont cultivées en présence de ciprofloxacine et de réserpine, la concentration intracellulaire en antibiotique est augmentée. La souche utilisée pour cette étude est Staphylococcus aureus NorA, mutée sur le promoteur du gène NorA : cette mutation entraîne une surexpression de la pompe d'efflux NorA et une augmentation de la résistance aux fluoroquinolones. Les peptides antimicrobiens présents chez les insectes constituent une nouvelle source potentielle d'antibiotiques. Les études concernant ces peptides utilisent comme référence la mélittine, principal composant du venin d'abeille. Ce peptide de 26 acides aminés exerce une action antibactérienne en perméabilisant la membrane plasmique. Dans la partie C, on étudiera l'action de la mélittine sur la souche Escherichia coli ML35, constitutive pour la bêta-galactosidase et déficiente en lactose perméase.

2 2 TRAVAIL DU PREMIER JOUR A- Mise en évidence de la production de métabolites antibactériens par une souche de moisissure Pour cette étude, la souche de moisissure M a été ensemencée sous forme d'une strie centrale sur une boîte carrée de gélose Mueller-Hinton. Une culture de cette souche est également fournie sur gélose Sabouraud afin de procéder à son identification. Ces boîtes ont été incubées une semaine à 30 C. Trois souches bactériennes tests sont disponibles pour rechercher la production de métabolites antibactériens à partir de la culture sur gélose Mueller-Hinton : par méthode directe au contact de la moisissure, par méthode indirecte en comparant plusieurs protocoles d extraction des métabolites. L'annexe 1 présente la démarche opératoire de cette étude. Cultures - Moisissure : 1 culture sur gélose Mueller-Hinton en boîte carrée ("M") 1 culture sur gélose Sabouraud ("M") - Cultures de 18 h en bouillon ordinaire des souches bactériennes suivantes : Escherichia coli ("Ecoli") Staphylococcus aureus TC ("SaTC") Staphylococcus aureus 6538 P ("Sa6538P") Milieu de culture - 5 boîtes de gélose Mueller-Hinton ("MH") Réactifs - 1 flacon de 20 ml de tampon phosphate de potassium ph7 10mmol/L stérile ("Tp7") - 2 tubes de 9 ml d eau physiologique stérile Matériels spécifiques - 2 minicolonnes stériles - 2 microtubes sans opercule stériles - 2 écouvillons stériles - 2 emporte-pièces - 1 spatule métallique - microtubes stériles - pipettes Pasteur Poste sous PSM - lames - rouleau de ruban adhésif - 1 flacon de bleu Cotton - 2 pinces Manipulations Il est recommandé de lire l ensemble des parties A1 et A2 ainsi que l annexe 1, afin de préparer au préalable les boîtes nécessaires en y inscrivant notamment au feutre sur le fond les emplacements des stries.

3 3 A1 Méthode directe Homogénéiser soigneusement chaque culture bactérienne test et procéder successivement aux opérations ci-dessous : charger une pipette Pasteur stérile avec la 1ère souche bactérienne faire une 1ère strie sur la boîte carrée perpendiculairement à la culture de la moisissure, en amenant la pipette du bord de la boîte au contact de cette culture sans recharger la pipette, faire alors une strie sur une boîte de Mueller-Hinton éliminer la pipette. Répéter ces opérations pour la 2 ème strie en face de la première. Utiliser une boîte de Mueller-Hinton par souche bactérienne test. Recommencer de même avec les 2 autres souches bactériennes tests. Les boîtes seront incubées 24 heures à 37 C. 1. Pourquoi est-il nécessaire d ensemencer chaque souche bactérienne test sur une boîte de gélose Mueller-Hinton après avoir fait la strie sur la boîte carrée? 2. Justifier le choix de la température d'incubation. A2 Méthode indirecte A21 Extractions Au voisinage immédiat de la culture de moisissure mais sans prélever celle-ci, découper 7 cylindres de gélose par «carottage» à l aide du «dos» d une pipette Pasteur. Placer une minicolonne à l intérieur d un microtube sans opercule. Prélever 3 cylindres à l'aide d'une spatule stérile et les placer dans cette minicolonne. Centrifuger 5 minutes à vitesse maximale. Transférer le filtrat dans un microtube stérile, puis le stocker en glace. Prélever 2 cylindres et les placer dans un microtube contenant 500 µl de tampon Tp7. Laisser 1 heure à température ambiante (loin du bec électrique), puis stocker en glace. A22 Réalisation des boîtes - tests Les tests seront effectués en double sur gélose Mueller-Hinton en utilisant comme souche test Staphylococcus aureus 6538 P. Préparer 10 ml de dilution au 1/100 ème en eau physiologique stérile de cette souche en effectuant 2 dilutions successives. Ensemencer chaque boîte par écouvillonnage : immerger l écouvillon dans la suspension essorer l écouvillon contre la paroi du tube réaliser des stries parallèles sur la totalité de la surface de la gélose faire tourner la boîte de 60 et refaire des stries parallèles sans recharger l écouvillon faire tourner de nouveau la boîte de 60 et répéter l opération. Pour chaque boîte : Creuser 2 puits à l aide d'un emporte-pièces. Déposer alors dans les puits respectivement : 40 µl de filtrat obtenu en minicolonne 40 µl d extrait obtenu dans le tampon Tp7 Déposer directement sur la boîte un cylindre de gélose en veillant à son adhérence. Laisser prédiffuser 30 minutes à la température du laboratoire, à distance du bec électrique. Incuber les boîtes 24 heures à 37 C. 3. A quel critère doit satisfaire la souche test utilisée? 4. Donner le principe de l'extraction par minicolonne.

4 A3 Identification microscopique de la souche M Cette identification sera réalisée à l aide de l annexe 2, à partir de la culture présentée sur gélose Sabouraud. La préparation de la lame pour l'observation microscopique sera réalisée sous PSM (poste de sécurité microbiologique). Déposer 1 goutte de bleu Cotton au centre d une lame. Découper un morceau de ruban adhésif de 2 à 3 cm environ (ne pas placer les doigts au centre de la surface adhésive). Tenir ensuite le morceau de ruban adhésif à l'aide de pinces. Effectuer le prélèvement en plaçant le morceau de ruban adhésif directement sur la culture. Appuyer fermement sur le ruban avec une pince. Décoller le morceau de ruban adhésif puis le placer sur la goutte de bleu Cotton. Observer. Faire le dessin légendé de l observation réalisée. Montrer à un examinateur le champ microscopique accompagné du dessin correspondant. 5. Identifier la moisissure en justifiant la démarche utilisée. 4 B- Résistance aux fluoroquinolones par la pompe d'efflux NorA Culture - Un erlen contenant 10 ml de culture de 18 h de Staphylococcus aureus NorA : "SaNorA" son absorbance à 600 nm est de 1,060 Milieux et réactifs - 1 flacon de 15 ml de bouillon Mueller-Hinton ("MH 15 ml") - 1 flacon de 10 ml exactement de bouillon Mueller-Hinton ("MH 10 ml") - 1 microtube contenant 1 ml de ciprofloxacine à 512 µg/ml en bouillon MH, dans la glace ("CIP") - 1 tube à hémolyse contenant 2 ml de réserpine à 320 µg/ml, dans la glace ("RES") Cette solution a été obtenue par dilution en bouillon MH d'une solution stock de réserpine à 2 mg/ml en DMSO-eau (86%-14%) - 1 microtube contenant 100 µl d une solution de DMSO (diméthyl sulfoxyde) à 13,8 % ("DMSO") - 1 flacon de 20 ml d eau physiologique ("eau phy") Matériels spécifiques - 1 microplaque stérile à fond rond - microtubes stériles de 2 couleurs différentes Poste spécifique "BET" - 1 microtube de BET à 5 mg/ml ("BET 5mg/mL") - 1 microtube de NH 4 Cl à 1 mol/l ("NH 4 Cl 1mol/L") Poste spécifique "fluorimètre" - 1 flacon de milieu LB ("LB") - cuve de spectrofluorimètre : fournie au moment du passage à l'appareil B1 Isobologramme en microplaque On étudiera l'effet de la réserpine (RES) à différentes concentrations sur la croissance de SaNorA en présence de ciprofloxacine (CIP) à différentes concentrations. Cette étude, qualifiée d'isobologramme par analogie avec l'analyse de l'association d'antibiotiques, sera réalisée en microméthode en milieu liquide.

5 Manipulations Le tableau ci-dessous schématise la microplaque. La plage B12:G12 (cupules de B12 à G12) ne sera pas utilisée. Au préalable, des dilutions de la ciprofloxacine, de la réserpine et de la préculture doivent être effectuées. [RES] décroissantes A B C D E F G H B11 Gamme de dilution de la ciprofloxacine Concentrations décroissantes en CIP fi Réaliser en microtubes des dilutions au 1/2 en série, selon le tableau ci-dessous. Les numéros font référence aux dépôts ultérieurs dans la microplaque bouillon MH (µl) CIP à 512 µg/ml (µl) 500 Redistribution (µl) B12 Gamme de dilution de la réserpine Réaliser en microtubes des dilutions au 1/2 en série, selon le tableau ci-dessous. Les lettres font référence aux dépôts ultérieurs dans la microplaque. A B C D E F G bouillon MH (µl) RES à 320 µg/ml (µl) Redistribution (µl) B13 Préparation de l'inoculum calibré Préparer 10 ml de dilution au 1/100 de la culture en milieu MH en déposant 100 µl de culture de la souche SaNorA dans le flacon contenant 10 ml de bouillon MH. B14 Répartition en microplaque Déposer 200 µl de milieu MH dans la cupule A12. Distribuer, dans chaque cupule de la colonne 1, 50 µl de la dilution de CIP notée 1 dans la partie B11. Répartir de même les autres dilutions préparées dans les colonnes 2 à 10. Distribuer 50 µl de milieu MH dans les cupules A11:H11 et dans les cupules H1:H12. Déposer 50 µl de solution de DMSO à 17,2% dans la cupule H12. Distribuer 100 µl d'inoculum calibré dans chacune des cupules de la plaque sauf en A12. Distribuer, dans chaque cupule de la ligne A, 50 µl de la dilution de RES notée A dans la partie B12. Répartir de même les autres dilutions préparées dans les lignes B à G. Recouvrir la microplaque, homogénéiser sur agitateur. Incuber 24 heures à 37 C. 1. Compléter le tableau fourni en annexe 3 en indiquant pour chaque cupule les concentrations finales en ciprofloxacine et en réserpine, en utilisant 2 couleurs différentes. 2. Si l'on considère que 1 unité d'absorbance à 600 nm correspond à bactéries/ml, quelle est la concentration bactérienne dans les cupules après préparation de la plaque? 3. Quel est le rôle des cupules A12 et H11? 4. Quel est le rôle de la cupule H12? Justifier sa composition. 5. Quel est le rôle des cupules A11:G11? 6. Quel est le rôle des cupules H1:H11? 5

6 B2 Cinétique d'efflux du BET Le bromure d'éthidium (BET) est un substrat de la pompe NorA. L activité de celle-ci peut être mesurée par le suivi fluorimétrique de la cinétique d'efflux du BET. Dans un premier temps, les cellules bactériennes sont mises en contact avec le BET, en présence de chlorure d ammonium (NH 4 Cl), agent découplant de la chaîne respiratoire. Lorsque le BET est intracellulaire, il s'intercale entre les bases des acides nucléiques et est ainsi rendu fluorescent. Après cette "charge", les cellules sont rapidement mises en suspension dans un milieu nutritif sans BET. La fluorescence dépend de la concentration en BET intracellulaire, sa décroissance matérialise donc la sortie du BET. Le même test peut être effectué en présence d'inhibiteurs potentiels de l'activité de NorA. Manipulations Une cinétique d'efflux sera suivie pendant 3 minutes, en absence d'inhibiteur de la pompe NorA. L'annexe 4 présente les résultats obtenus dans les mêmes conditions, mais en présence, lors de l'efflux, de la substance indiquée dans chaque cas. Pour cette partie, une heure précise et impérative de passage au fluorimètre sera notifiée à chaque candidat. B21 Charge en BET des cellules Heure de passage : Les étapes 4 et 7 seront réalisées au poste spécifique "BET", en présence d'un examinateur. Le BET est un agent mutagène. Le NH 4 Cl est un poison respiratoire. Précautions de manipulation et de gestion des déchets. Porter des gants. Eliminer les déchets liquides dans le flacon de récupération. Jeter les déchets solides (cônes, microtubes, gants) dans les sacs prévus à cet effet. Le BET présent dans les déchets liquides sera adsorbé sur charbon actif. Après filtration, ce charbon actif sera traité comme un déchet solide contaminé. Les déchets solides contaminés seront pris en charge pour incinération par une entreprise spécialisée. Deux culots seront préparés simultanément selon le protocole suivant : 1. Déposer dans un microtube un volume de culture de la souche SaNorA qui permettra d'obtenir à l'issue de l'étape 3 une suspension d'absorbance à 600 nm égale à 0, Centrifuger 3 minutes à vitesse maximale. 3. Eliminer le surnageant et remettre le culot en suspension dans 1 ml d'eau physiologique. 4. Ajouter 10 µl de NH 4 Cl à 1 mol/l puis 2 µl de BET à 5 mg/ml. Homogénéiser au vortex. 5. Incuber 20 à 30 minutes à température ambiante ; homogénéiser au vortex après 10 minutes. 6. Centrifuger 3 minutes à vitesse maximale. 7. Eliminer immédiatement le surnageant. 8. Laisser le culot dans la glace jusqu'à utilisation. Ce séjour en glace ne devra pas excéder 15 minutes. B22 Suivi fluorimétrique de la cinétique d'efflux Les longueurs d'onde utilisées sont égales à 505 nm pour l'excitation et à 605 nm pour l'émission. Les opérations suivantes seront réalisées en présence d'un examinateur au poste spécifique "fluorimètre". Déposer 500 µl de milieu LB dans la cuve de mesure fluorimétrique. Remettre l'un des culots en suspension par aspiration-refoulement dans 500 µl de milieu LB. Transférer quantitativement dans la cuve et homogénéiser par aspiration-refoulement. Placer la cuve dans le spectrofluorimètre. Lancer immédiatement le programme de cinétique. Imprimer la courbe obtenue. Ces 3 dernières opérations seront réalisées par un examinateur et la courbe imprimée sera fournie. 6

7 7. Justifier la présence de NH 4 Cl au cours de l étape B Sur la courbe imprimée, déterminer graphiquement les pourcentages de fluorescence aux différents temps indiqués dans le tableau de l'annexe 4. Normaliser les pourcentages de fluorescence initiale en prenant une base de 100% pour la fluorescence au temps Reporter ces valeurs sur le graphe fourni dans l'annexe Comparer la courbe obtenue aux 2 courbes déjà tracées. Interpréter l'ensemble des résultats. 7 C- Étude de l'action antibactérienne de la mélittine L'objectif de cette étude est de vérifier l'action perméabilisante de la mélittine et de tester son effet bactéricide à la concentration utilisée. La souche Escherichia coli ML35 exprime de manière constitutive la β-galactosidase, enzyme cytoplasmique. Elle est déficiente en lactose perméase, de sorte que l'entrée de l'onpg (2 nitrophényl βdgalactoside) ne sera possible que par simple diffusion. L'hydrolyse de l'onpg traduira donc l'accessibilité à l'enzyme de ce substrat. L'effet bactéricide sera testé en dénombrant sur milieu gélosé les cellules viables après contact avec la mélittine. On peut conclure à une bactéricidie si le taux de mortalité est au moins égal à 99,99%. Cultures - 1 tube de 5 ml de culture de 18 h de E.coli ML35 en milieu LB ("ML35") Milieux et réactifs - 1 microtube contenant 100 µl de mélittine à 1 mg/ml soit 350 µmol/l, dans la glace ("mélittine") - 1 tube de 5 ml de milieu LB ("LB") - 1 flacon de 20 ml d eau physiologique stérile ("eau phy") (cf. partie B) - 1 flacon de 20 ml de tampon phosphate de potassium ph7, 10 mmol/l stérile ("Tp7") (cf. partie A) - 1 microtube contenant 500 µl d'onpg à 25 mmol/l, dans la glace ("ONPG") - 8 boîtes de gélose pour dénombrement ("De") Matériels spécifiques - 1 tube à bouchon rouge de 10 ml stérile à usage unique - 2 cuves macros - 5 cuves semi-micros - microtubes stériles - billes de verre stériles - chronomètre Manipulations C1 Préparation de la suspension cellulaire ajustée 1 unité d'absorbance à 600 nm correspond à UFC/mL. Mesurer l'absorbance à 600 nm de la culture de ML35, sur une dilution au 1/5 en milieu LB, sous un volume de 2 ml, directement en cuve. Effectuer la lecture de l'absorbance en présence d'un examinateur. Lavage Préparer 2 microtubes contenant 1 ml de culture chacun. Centrifuger à vitesse maximale pendant 3 minutes. Eliminer le surnageant et remettre chaque culot en suspension par aspiration-refoulement dans 1 ml d'eau physiologique. Ajustage Préparer dans le tube à bouchon rouge 4 ml de suspension en eau physiologique ajustée à 0,2 unités d'absorbance à 600 nm. Homogénéiser. Contrôle Déposer 1 ml de suspension ajustée dans une semi-microcuve et lire l'absorbance à 600 nm. Effectuer la lecture de l'absorbance en présence d'un examinateur. Conserver la suspension ajustée dans la glace pour les opérations ultérieures.

8 8 1. Indiquer les volumes utilisés pour la préparation de la suspension ajustée. C2 Test de l'activité bactéricide Dans cette partie, les dénombrements seront réalisés en déposant 100 µl d inoculum sur boîte de gélose De et en étalant à l'aide de billes de verre stériles. Essai Dans un microtube, déposer : 885 µl de tampon Tp7 15 µl de mélittine 100 µl de suspension ajustée. Homogénéiser et laisser 30 minutes à la température du laboratoire. Centrifuger 3 minutes à vitesse maximale. Remettre le culot en suspension dans 1 ml d eau physiologique. Centrifuger 3 minutes à vitesse maximale. Remettre le culot en suspension dans 500 µl d eau physiologique. Effectuer 2 dilutions décimales en série de cette suspension, sous un volume final de 1 ml d eau physiologique, en microtubes. Dénombrer en double la suspension non diluée, et en simple chacune des dilutions. Témoin Dans un microtube, déposer : 900 µl de tampon Tp7 100 µl de suspension ajustée. Homogénéiser et laisser 30 minutes à la température du laboratoire. Effectuer des dilutions décimales en série de cette suspension, sous un volume final de 1 ml d eau physiologique, en microtubes, jusqu'à la dilution Réaliser une dilution devant un examinateur. Dénombrer en double la dilution 10-4 et en simple chacune des dilutions 10-3 et Incuber les 8 boîtes 24 heures à 37 C. 2. Justifier le choix des dilutions ensemencées pour le témoin. 3. Quel nombre de colonies attend-on sur la boîte correspondant à l'essai non dilué? C3 Test de perméabilisation membranaire Deux cinétiques d'hydrolyse de l'onpg, avec et sans mélittine, seront réalisées selon le protocole ci-dessous. Elles seront suivies simultanément, avec un décalage de temps entre chacune. Protocole Dans une semi-microcuve, déposer : 800 µl de tampon Tp7 15 µl de mélittine (ou 15 µl d eau physiologique pour le témoin) 100 µl de suspension ajustée. Ajouter 100 µl d'onpg équilibré à température ambiante. Recouvrir la cuve d'un parafilm, homogénéiser par retournement et lire immédiatement l'absorbance à 420 nm contre le tampon Tp7. Cette première lecture définit le temps 0. Mesurer ensuite l'absorbance toutes les 2 minutes pendant 10 minutes. Laisser les cuves entre chaque lecture à côté du spectrophotomètre, à température ambiante. Effectuer une homogénéisation par retournement avant chaque lecture. Réaliser le début des cinétiques en présence d'un examinateur. 4. Déterminer la concentration en mélittine dans le milieu réactionnel. 5. Tracer sur un même graphe les 2 courbes A 420 nm = f (temps). 6. Analyser ces courbes. Conclure quant à l'action de la mélittine.

9 9 C4 Test complémentaire Ce test a été effectué. Le protocole et les résultats obtenus sont indiqués ci-dessous. Protocole Déposer dans un microtube 500 µl de suspension ajustée. Ajouter 8 µl de mélittine dans le cas de l essai et 8 µl d eau physiologique dans le cas du témoin. Homogénéiser et incuber 30 minutes à température ambiante. Centrifuger 3 minutes à vitesse maximale. Récupérer 200 µl de surnageant dans un nouveau microtube. Eliminer le surnageant restant et remettre le culot en suspension dans 500 µl d'eau physiologique. Déterminer l'activité β-galactosidase du surnageant et du culot, de la manière suivante : Dans une semi-microcuve, déposer : 800 µl de tampon Tp7 100 µl d'onpg 100 µl d extrait (surnageant ou culot). Homogénéiser, lire immédiatement l'absorbance à 420 nm contre du tampon Tp7. Incuber 10 minutes à température ambiante. Lire à nouveau l'absorbance à 420 nm contre le tampon Tp7. Résultats obtenus DA 420 nm obtenu en 10 minutes pour le culot DA 420 nm obtenu en 10 minutes pour le surnageant Témoin 0,055 0,013 Essai 0,688 0, Que cherche-t-on à vérifier dans ce test? 8. Quelle(s) conclusion(s) peut-on tirer de ces résultats? Le sujet du jour 1 est à remettre avec la copie.

10 10 Méthode directe ANNEXE 1 Méthodes directe et indirecte 1 2 Culture d'une souche bactérienne test Ecoli SaTC Sa6538P Boîte de gélose Mueller-Hinton Culture de la moisissure M Méthode indirecte Microtube stérile sans opercule Minicolonne stérile contenant du coton cardé et perforée dans sa partie inférieure Filtrat Cylindre de gélose déposé sur la boîte ensemencée Microtube stérile contenant 500 µl de tampon Tp7 Boîte de gélose Mueller-Hinton ensemencée avec la souche bactérienne test

11 11 ANNEXE 2 Document pour identification de la moisissure Verticillum Trichoderma Scopulariopsis Moniliella Curvularia Stachybotris Penicillium Mucor Chaemophora Acremonium Botrytis Fusarium Aspergillus d'après BOTTON et Coll, Moisissures utiles et nuisibles, MASSON, 1985

12 12 A RENDRE AVEC LA COPIE Numéro de Poste : ANNEXE 3 Concentrations dans la microplaque A B C D E F G H Prévoir un emplacement dans chaque case pour consigner le résultat du jour 2.

13 13 A RENDRE AVEC LA COPIE Numéro de Poste : ANNEXE 4 Efflux du BET % de la fluorescence initiale 100,0 98,0 96,0 94,0 92,0 90,0 88,0 86,0 84,0 82,0 80,0 78,0 76,0 74,0 Efflux du BET temps en minutes en présence de réserpine (20 µg/ml) en présence de NH4Cl (10 mmol/l) temps en minutes 0 0, % de fluorescence lu sur l'enregistrement % de la fluorescence initiale 100

14 1 AGRÉGATION DE BIOCHIMIE - GÉNIE BIOLOGIQUE SESSION 2004 ÉPREUVE PRATIQUE DE MICROBIOLOGIE Sujet proposé par I. ETIENNE, B. SALLEN, F. VINCENT et D. LONCLE, P. MICHAUX, JC. OGIER TRAVAIL DU DEUXIÈME JOUR Les antibiotiques Souches productrices, mécanismes d'action et de résistance A- Mise en évidence de la production de métabolites antibactériens par une souche de moisissure A1 Méthode directe Lire l inhibition de culture des souches tests. Lire les boîtes témoins. 1. Présenter l'ensemble des résultats sous forme d'un tableau. 2. Analyser ces résultats. A2 Méthode indirecte Mesurer les diamètres d'inhibition. 3. Regrouper l'ensemble des résultats sous forme d'un tableau. 4. Comparer ces résultats. Les discuter. 5. En quoi ces résultats précisent-ils ceux obtenus par méthode directe? B- Résistance aux fluoroquinolones par la pompe d'efflux NorA B1 Isobologramme en microplaque Observer pour chaque cupule la présence (+) ou l'absence (-) de culture. 1. Consigner les résultats dans le tableau de l'annexe Analyser les cupules témoins. 3. Déterminer la CMI de la ciprofloxacine pour la souche SaNorA. Justifier. 4. Conclure quant aux résultats des cupules A11:G Analyser l ensemble des résultats de la plage A1:G Conclure quant à l effet de l association ciprofloxacine-réserpine.

15 2 C- Étude de l'action antibactérienne de la mélittine C2 Test de l'activité bactéricide Dénombrer les colonies sur les boites "essai" et "témoin". 1. Présenter les résultats dans un tableau. 2. Analyser ces résultats. 3. Conclure. Bibliographie Marquez, B., Neuville, L., Bouhours, P., Moreau, N., «Recherche d inhibiteurs de pompes d efflux de Staphylococcus aureus», Poster. Kaatz, W., Seo, S.M., O Brien, L., Wahiduzzaman, M., Foster, T.J. (2000), Evidence for the existence of a multidrug efflux transporter distinct from NorA in Staphylococcus aureus, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol 44 No 5, p Silvestro, L., Weiser, J.N. and Axelsen, P. H. (2000), Antibacterial and Antimembrane Activities of Cecropin A in Escherichia coli, Vol 44 No 3, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p Nos remerciements à Mme Moreau (ENSCP) et M. Peduzzi (MNHN).