PSF et traitement de déconvolution sur les images 3D

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1 PSF et traitement de déconvolution sur les images 3D

2 Acquisition d une image 3D

3 De l objet à l image visible L acquisition

4 Émission de Fluorescence Z hv 2 hv 1 hv 2 Y X hv 2

5 Fluorescence dans un corps épais Z Z+1 Z Z-1 X Y

6 La formation de l image d un objet fluorescent L image est le produit de convolution de l objet et de la PSF g = h x f + n g : image de l objet h : PSF f : objet x : produit de convolution n : bruit additif

7 Sources de dégradation de l image - bruit de type photons, type gausséen - Diffusion de la lumière aux différentes interfaces à cause d indices de réfractions différents - L éblouissement (réflexion à l intérieur de l objectif) - imperfections optiques : Flou L estimation de cette dégradation se fait en mesurant la PSF

8 L image d une source ponctuelle de lumière : La PSF On dit aussi réponse impulsionnelle optique du système La PSF caractérise le microscope dans divers contextes expérimentaux en définissant les dégradations introduites par les différents éléments de l ensemble système optique / échantillon Y Z X X Images réalisées avec des billes fluorescentes dont la taille est < à la résolution optique du système utilisé

9 PSF en 3D

10 Caractéristiques générales de la PSF Taille infinie, mais signal bas confondu avec bruit de fond Somme des intensités hors focus doit être égale à l intensité au focus Pas de symétrie par rapport au plan focal Anneaux de diffraction situés à l opposé de l objectif Symétrie circulaire Objectif Taille PSF, objectif NA 1.4 : 0.2µm² au plan focal, Surface 90 fois plus étendue 1µm au dessus et en dessous du plan focal donnant le signal le plus intense

11 (PSF expérimentale) (PSF théorique) PSF en Microscopie plein champ et confocale plein champ confocal Fermeture du pinhole Réduction du volume de fluorescence récupéré Ajustement de la taille du pinhole à la limite de la tache de diffraction La présence du pinhole devant le détecteur permet une amélioration de la résolution latérale de 25% et de la résolution axiale de 30%.

12 Paramètres intervenant dans la formation d un PSF Variables intervenant dans le modèle de PSF pour la microscopie confocale

13 Variation de la réponse impulsionnelle du système en fonction d une variable de l OPD : indice d huile à immersion.

14 Utilisation d une PSF mesurée ou calculée? - Il est important d avoir une PSF peu bruitée pour la bonne exécution des algorithmes - La PSF calculée donne de moins bons résultats

15 PSF et diagnostics XY XZ XY Confocal XZ Choc pupille objectif Plein champ PSF de bonne qualité Défaut d alignement des optiques Aberration sphérique

16 Mesure de la résolution du système Résolution latérale Plot profile (intensité le long de la ligne) Mesure sur le plan le plus intense (mais non saturé) Résolution axiale Fit sur une gaussienne Mesure de la largeur à mi-hauteur (FWHM, Full Width at Half Maximum) Section XZ Résolution = largeur à mi-hauteur

17 De l image à l objet Le traitement de déconvolution

18 But du traitement de déconvolution Cône d excitation Plan focal 1 Plan focal 2 déconvolution - Amélioration contraste et résolution - Ré affectation de la fluorescence au point d émission

19 Les algorithmes de déflouage - Nearest Neighbour - Multi neighbour - No neighbour - Unsharp masking Ceux ne sont pas de vrais algorithmes de restauration

20 L algorithme : Nearest Neighbour Z+1 Z+1 Z 1 Z 2 Z Z-1 Z-1 1 : flouage de Z-1 et Z+1 2 : soustraction de Z (Z +1 ) et de Z (Z -1 )

21 Application de l algorithme Avantages: temps de calcul court, besoin d une pile de 3 images Inconvénients : augmente le contraste mais diminue le S/B et Introduit des artéfacts structuraux

22 Algorithmes de restauration Au lieu d enlever le flou, ces algorithmes tendent à réaffecter au mieux la lumière à son propre plan focal d émission. Définitions Produit de convolution : le produit de convolution est une opération mathématique complexe utilisée dans le traitement du Signal, cela formalise l effet d un filtre. Cela correspond à la Multiplication de TF de 2 fonctions. Le produit de convolution par un dirac Correspond à une translation de la fonction initiale d une valeur de a

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24 Transformée de Fourier Spectre de fréquence du signal périodique : amplitude A n f(fq)

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27 2 1

28 Transformée de Fourier : c est une transformation qui fait correspondre à une image qui est dans le domaine espace avec les variables x et y pour la position du point, une fonction qui est dans le domaine des fréquences avec 2 variables u et v. 8 2 La représentation se fait sous forme d une image qui donne L énergie en fonction de u et v ou spectre d énergie.

29 Fonctionnement des algorithmes de restauration Les algorithmes de restauration estime l objet en suivant la logique qu une bonne estimation de l objet est réalisée quand Celui-ci convolué avec la PSF donne l image brute. O x h = i i : image brute o : objet estimé h : PSF x : opération de convolution

30 Calcul facilité en transformée de Fourier Si l image et la PSF sont transformés dans l espace de Fourier La convolution de l image par la PSF peut être calculée en Multipliant leurs transformées de Fourier o x h = i i : transformée de Fourier de l image h : transformée de Fourier de la PSF o : transformée de Fourier de l objet x : opérateur de multiplication

31 Algorithmes de filtre inversé, ou approche directe - Wiener déconvolution : Image J - Regularized least Squares - Tikhonov-Miller regularization, 1977

32 Déconvolution de Wiener Transformée de Fourier Transformée de Fourier Image Spectre d énergie (i) OTF (h) PSF calculée o = h -1 x i Inversion instable bruit Traitement de régularisation Objet o défloué + bruit Filtre de Wiener et Transformée de Fourier inverse Image finale

33 Application de l algorithme Avantages : calcul rapide Inconvénients : Amplification du bruit et création d un artefact (ringing)

34 Approches Itératives Algorithme d itérations contraintes : PSF mesuré ou calculé Image brute OTF Estimation de l image Espace de Fourier x + Filtre de Wiener Image floue d estimation Comparaison avec l image brute Lissée par filtre Gausséen Modification de l estimation de l image Génère un critère d erreur Si critère d erreur atteint Image estimée bonne

35 L algorithme en pratique Avantages : Augmentation du rapport S/B Inconvénient : temps de calcul long

36 Algorithme statistique itératif L algorithme Maximum Likelihood (Lucy 1974 richardson1972) approche statistique avec contrainte de recherche de maximum d entropie Commercialisé par : SVI, Bitplane, Improvision, Zeiss, Autoquant Avantage : Produit de meilleurs résultats sur les images avec beaucoup de bruit Inconvénient : temps de calcul encore plus long

37 Algorithme de déconvolution aveugle PSF calculé Image brute OTF Modification de l OTF estimé Estimation de l image Espace de Fourier x Image floue d estimation Comparaison avec l image brute Modification de l estimation de l image Génère un critère d erreur Si critère d erreur atteint Image estimée bonne

38 Cet algorithme incorpore une méthode où la PSF est évolutive Commercialisé par métamorph Avantages : bon résultats sur les images avec du bruit et souffrant d aberration sphérique Inconvénient : temps de calcul long

39 Systèmes d acquisition Système intégré Système modulaire - Statif motorisé - Logiciel d acquisition - Kit de motorisation en Z par piézoélectrique - Caméra 12, 16 bits - Objectifs avec grande ouverture numérique >1.4

40 L acquisition Sur tout type d échantillons, il faut : - immobiliser l échantillon - stabilité du fluorochrome - rester à la température à laquelle la PSF a été réalisée - pour chaque longueur d onde d émission utilisée dans l échantillon, il faut réaliser une PSF à la même longueur d onde -Si un élément du trajet optique est modifié (diaphragme, lentille supplémentaire.) il faut une autre PSF réalisée dans les mêmes conditions De la qualité de l acquisition dépend le résultat de la restauration

41 IDEALEMENT Il faudrait inclure dans chaque échantillon à observer, des billes fluorescentes afin de réaliser une PSF dans le milieu se rapprochant le plus possible de celui de l échantillon Ce qui est fait dans la déconvolution adaptative

42 Faire la différence entre : - algorithmes itératifs de restauration - algorithmes de déflouage - microscopie confocale En fonction du système d imagerie : champ plein, confocal pinhole fixe, confocal pinhole mobile, confocal avec fente, double photon, il faut utiliser un algorithme de déconvolution approprié. Après restauration, l intensité des pixels augmente à l intérieur des structures mais la somme totale d intensité reste la même.

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