Introduction à la Biochimie

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1 Introduction à la Biochimie I. Généralités sur les Molécules en biochimie Organisme Humain : H2O = plus Grande Masse % Adulte 78 % Nouveau-Né 70 % Nourrisson Biochimie : Centrée sur le Carbone Permet de constituer 100'000 molécules chez l Homme 50% Poids sec du corps Humain 4 Liaisons : Simples (saturées) CH4 Doubles (insaturées) O = C = O Triples (insaturées) H C = C H Les Molécules sont de 2 types : Simples (assez inertes) : Carbone + Hydrogène (linéaire, ramifié ou cyclique) Complexes (réactives ++) : H remplacé par N, P, O, S [plus électro-réactifs] Augmentation polarité, solubilité et réactivité des molécules Groupement Phosphate Aldéhyde Cétone Sulfhydryl Façon d activer/désactiver une fct protéique Ajout = Kinase Suppr = Phosphatase Molécules simples (monomère) Complexes (polymères / macromolécules) Glucose Glycogène 4 Familles : Lipides (Acides Gras, Triglycérides, Cholestérol, ) Glucides (oses simples [glucose], polysaccharoses [glycogène]) Acides Aminés, Peptides, Protéines Nucléosides, Nucléotides

2 II. Liaisons entre Atomes Fortes énergie = > 100 kj.mol -1 Faible énergie = < 100kJ.mol -1 A. Liaisons Covalentes Moyenne : 400 kj.mol -1 (fortes) Partage : d un ou plusieurs e - (ex C C) Règle de l octet : stabilisation de sa couche ext d e - 1 à 3 paires d e - entre 2 atomes (1 à 3 liaisons) [de + en + solide] Pas de 4 liaisons entre 2 atomes en bio Hum Molécules Polaires / Apolaires : Si Liaison avec Atomes + électronégatif (O & N) : dipôle (δ + et δ - ) Molécule polaire δ + δ - Grande réactivité chimique C = O Si pas de déséquilibre (surtout avec C & H) alors Apolaire (peu réactives) Polaire : Hydrosoluble : pas transporteur dans le sang (Glucose) Apolaire : Non Hydrosoluble : transporteur sanguin (lipides se lient avec apoprotéines) Ionisation : tellement de déséquilibre Rupture électrolytique Na Cl Na + (cation) & Cl - (cation) Radicaux Libres : Rupture de liaison homolytique O = O 2 O Electrons non Appariés = très instable! Altération d autres molécules : Acides Nucléiques, Lipides, TOXIQUES Mutations ADN Cancérisation Peroxydation lipidique Mort Cell R, Vieillissement Dérivés Réactifs de l Oxygène (DRO) : Radical hydroxyde HO Radical Alkoxyle RO Stress Oxydant (si plus d oxydants que d antioxydants)

3 Lutte Enzymatique : Superoxyde dismutique, catalase, péroxyrédoxine, lactoperoxydase, glutathion peroxydase Antioxydant : Glutathion, Vit E & C (intracell ++) Acide urique (extracell) B. Non Covalente Pas de mise en commun d e - donc : Moins forte que covalente (10x moins) Reformation facile Liaison Ionique (en solution) : Entre un atome + et atome Liaison hétéro-polaire / «pont de sel» 4 kj.mol -1 / si même atomes mais état solide (200kJ.mol -1 ) Liaison Hydrogène : 40 kj.mol -1 Quand H lié avec atome fortement électronégatif (O ou N) H : petite charge positive Peut interagir avec atome avec petite charge négative Et aussi entre et avec molécules d eau Liaisons de Van Der Waals : 10 kj.mol -1 (en moy) Quand déséquilibre = formation temp de dipôle élec 2 molécules dipolaires = rapprochement / même moment Orientation appropriée Faible attraction de Van der Waals Liaison H : type particulier de liaison de Van der Waals incluant H Interaction hydrophobe : Hydrophobes : éviter le contact avec l eau

4 III. Acides Aminés A. Introduction Cadre des protéines : grec protos = premier, + important, car : Cellule : > 50% des molécules (poids sec) Structure liée au code génétique Molécule induisant formation d autres molécules (enzymes) Acides Aminés (AA) : sous-unités monomériques des peptides / protéines Liaison peptidique Protéine > peptide > AA Acide Aminé : Nom général dû à leur structure (Fct COOH / NH2) Forte Conservation entre Eucaryote et Procaryote Les Bactéries peuvent produire des protéines humaines ( «Recombinantes» ) Production Bactérienne ADN C Humain de l Insuline Diabète de type 1 Hormone de Croissance Retard de Croissance Osseux 2 Grandes Familles : Appartenance non exclusive 1) A.A. à Rôle Protéinogène Synthèse peptidique/protéique ( g par jour chez l H) 20 A.A. historiques Retrouvés identiques ou modifiés (modif post traduc) dans structure peptidique/protéique + 2 AA rajoutés : Sert product Sélénocystéine : homme/bactérie Sélénium prend la place du soufre dans la cystéine (mais formée à partir sérine) Glutathion peroxydase (lutte DRO) Thioréduxine réductase / désiodase (métabolisme hormone thyroïdienne) Pyrolysine = archéobactérie méthanogène Méthyl-transférase 2) A.A. à Rôle Non Protéinogène 300 AA Précurseur de molécules complexes : Glycine Hème Hémoglobine Réserve d énergie : Créatine Phosphate (vertébrés) Arginine Phosphate (invertébrés) liaison type Phospho Amidine

5 Précurseur Hormonal : Dérivé iodé de tyrosine / hormone thyroïdienne Mono-Iodotyrosine (MIT) / Di-Iodotyrosine (DIT) T3 (tri-iodotyrosine : MIT + DIT) / T4 (tétra-iodotyrosine : DIT + DIT) Coagulation Sanguine : γ Carboxy-Glutamate (liaison Ca 2+ ) Neurotransmission (excitateur / inhibiteur) Glutamate (+) Glycine (-) Acide γ aminobutyrique (GABA) : dérivé Glutamate (-) Métabolisme : A.A. Glucoformateur (néoglucogenèse) Métabolisme, transport et élimination de l azote Production du monoxyde d azote (NO) B. Structure / Propriétés Physico-Chimiques 1) Structure Fonction Acide Carboxylique Fonction amine primaire (basique) Sauf Proline : amine secondaire (α imino-acide / acide α iminé) Groupe R : Radical Latéral Responsable des propriétés chimiques et physiques Carbone α : porteur COOH, NH2, H et R (donc n 2) Autres carbones β (3), γ (4), δ (5), ε (6) α 2) Propriétés Physiques Présence d un Carbone asymétrique 17 AA = 1 C* 2 AA = 2 C* Glycine = 0 C* (Thréonine / Isoleucine) Convention de Fischer / Modèle Glycéraldéhyde L : laevus (gauche) / D : Dextra (droite)

6 Si 2 C* D (α = D & β = L) D-Allo (α & β = D) L (α = L & β = D) L-Allo (α & β = L) Ex : L-Allo-Isoleucine (maladie des urines à odeur de sirop d érable) l et d : Même propriétés chimiques et physique SAUF déviat de la lumière polarisée d (dextrogyre) + / l (lévogyre) Pas de lien avec D ou L Mélange équimolaire (dit racémique) = aucun pouvoir polarisant A.A. Humaine de type L (homochiralité humaine) Lors du décès des cellules = racémisation progressive L <=> D Datation de la date du décès avec ration L/D Bactérie : présence peptides à A.A. de type D (D alanine & D glutamine paroi bactérie) Insensibilité L-peptidase humaine 3) Radical Aromatique : tryptophane, Tyrosine, Phénylalanine Absorption à 280nm (Trp > Tyr > Phe) Tryptophane : λ = 280nm A =1 seul dont le pic est à 280 Tyrosine : λ = 275nm A = 0,2 Tyrosinate : λ = 295nm A = 0,2 Oscillation entre les 2 produits donc absorption à 280nm Phénylalanine λ = 257nm A = 0,02 A.A. pas d absorption dans la lumière visible (solution incolore) Loi de Beer Lambert / coefficient d extinction molaire ε Dosage peptides et protéines si Trp et/ou Tyr Rapport 260nm (ADN,ARN) 280nm (protéines) Si > 1,8 (pureté de l extraction nucléique pour utilisation ADN et ARN) DO : Densité Optique A : Absorbance L : longueur de la cuve I : intensité lumineuse DO = A = log(i0/i) = ε.c.l ε et l fixes donc : A = K (constance). [c]

7 4) Propriétés Acido-Basiques AA comporte au moins deux fonctions ionisables : groupement acide COO - Molécule Amphotère groupement Basique NH3 - pk du groupement ionisable : ph pour lequel ce groupement se trouve à 50% ionisé et 50% non ionisé AA a au moins deux pk : acide pka et basique pkb Point isoélectrique : ph où somme des charges intramoléculaires est nulle pas de migration dans un champ électrique pi = ph AAneutre = phi = ½ (pka + pkb) Existence trois formes en équilibre selon ph : ph < phi (ph acide) ph = phi (ph neutre) ph > phi (ph basique) Nombreux H + Nombreux OH - AA capte les H + «Zwittérion» AA libère des H + COO - COOH (sel interne) COOH COO - NH3 - prédomine NH3 - NH2 AA Chargé + Pas de Migration Acide chargé - AA migre vers la cathode AA migre vers l anode (pôle -) (pôle +) AA = cation AA = anion Conséquences Biologiques : ph Physiologique Cellulaire : nbx AA ionisés / liaisons électrostatiques Analytique : électrophorèse des AA : ph fixe (tampon) s/ acétate de cellulose 1) Dépôt, 2) Migration et 3) Révélation ninhydrine (bleu-violet) Base principale des Chromatographies échangeuses d ions : Utilisation des différents signes et amplitudes de charges électriques des AA en fonction du ph et des concentrations de sel

8 Groupement anionique fixé : échangeuse de cations : Ex : polysulfurisés / Résine SO3 - Na + + RNH3 + Résine SO3 - RNH3 + + Na + 1) Fixation des AA par échange avec Na + et RNH3 + (ph acide) 2) Elution des A avec augmentation de ph et de concentration en sels (acide vers basique) Groupement Cationique Fixé : échangeuse d anions : Ex : polyaminés / Résine NH3 + Cl - + RCOO - Résine NH3 + RCOO - + Cl - 1) Fixation des AA par échange avec Cl - et RCOO - (ph basique) 2) Elution des AA avec diminution de ph et augmentation de concentration en sels (basique vers acide) 5) Hydrophobie / Polarité Hydrophobie / Hydrophilie : varie en fct du ph Permet de séparer avec chromatographie de partage : phase stationnaire hydrophile, solvant hydrophobe (ou inverse), donc : AA hydrophobes restent dans solvant AA hydrophobes migrent vers phase stationnaire Selon polarité, 3 types pour 20 AA protéinogènes : R à chaine latérale apolaire (9) R à chaine polaire non-chargée (6) R à chaine polaire chargée (5) Soit : 9 AA apolaires / 11 AA polaires 15 AA neutres / 5 acides ou basiques C. Nomenclature 1) A.A. Apolaires (9) # 5 AA Aliphatiques : Aleiphas = gras (grec) / ancrage bicouche lipidique (phospholipides) Radical avec H et C / hydrophobe (repliement dans espace privé d eau) ~ Glycine (Gly / G) Pas de C* donc achirale Flexibilité structurale / encombrement stérique minimal Hyperglycinémie sans cétose : maladie métabolique du complexe protéique de dégradation de la Glycine (protéines P, T, H, L) Augmentation [Gly] dans urine, sang et LCS

9 ~ Alanine (Ala / A) ~ Valine (Val / V) ~ Leucine (Leu / L) Résidus dans structure Protéique de liaison à l ADN : «Leucin Zipper» / Glissière à Leucine Permet à des protéines d interagir sur des sillons de l ADN ~ Isoleucine (Ile / I) 2 C* Augmentation Val, Leu, Ile + Apparition allo-isoleucine (L) Leucinose (détectable dans le sang & urines) Maladie des urines à odeur de sirop d érable : Déficit en céto-acide décarboxylase des acides α-cétoramifiés (Val, Leu, Ile) ou thiamine (cofacteur) [dégradation tellement lente, considérée inefficace] # 1 AA Soufré : ~ Méthionine (Met / M) R avec chaine thio-éther (S CH3) Rôle : Complexe d initiation biosynthèse protéique Donneur de radical méthyl (méthylation ++) # 2 AA Aromatiques : ~ Phénylalanine (Phe / F) Alanine substituée par Phényl Pathologie : Phénylcétonurie Normalité : Phénylalanine-hydroxylase Phénylalanine Tyrosine (cofacteur) BH4 BH2

10 Phénylcétonurie (PCU / PKU) : Absence (mineure/majeure) de Phénylalanine-hydroxylase et/ou Déficit en Tétrathydrobioptérine (BH4) et/ou Absence enzyme qui restaure le BH2 en BH4 cofacteur : la dihydrobioptérine réductase La nature essai d éliminer la Phe en la transformant en Ac Phényl-Pyruvique Biologie : accumulation de Phe sanguine D acide Phénylpyruvique (cétone) dans les urines (d où le nom de Phénylcétonurie) Clinique : Accumulation de Phe dans cerveau mort neuronale non réversible Retard mental si non prise en charge l idiotie Phénylpyruvique Anomalie de production des neurotransmetteurs nervosité, fatigabilité, troubles de concentration Problèmes de mémorisation diminution des performances intellectuelles Effets Inhibiteurs de la Phénylalanine sur la production de neurotransmetteurs - Tryptophane 5-Hydroxy-Tryptophane Sérotonine Phénylalanine Tyrosine DOPA - DOPAMINE XXX Neurotransmetteur NORADRÉNALINE - Inhibition de la formation ADRÉNALINE Dépistage Néonatal : Test de Guthrie (dosage Phe sang bébé / talon) 1/17'000 naissance en France Traitement : Régime sans Phénylalanine

11 Principe du TEST de Guthrie (historique) Bactérie qui : Pousse inhibée par la L-β2-thiénylalanine Pousse Stimulée par Phénylalanine (malgré la L-β2) [Phe] en corrélation avec la pousse bactérienne Maintenant, c est un dosage biochimique 5 Maladies dépistées en France à la Naissance + Surdité (Juin 2012) Phénylcétonurie (1972) / aug [Phe] Hypothyroïdie congénitale (1978) / aug [TSH] Hyperplasie Congénitale surrénales (95) / aug [17-OH-Progestérone] Mucoviscidose (2002) / aug Trypsine Immuno-réactive (TiR) Drépanocytose (69) / HbS au lieu de HbA 1 / 17 k 1 / 3,5 k 1 / 19 k 1 / 4 k Test au Talon : Assoc Fr pour le Dépistage et la Prévention des Handicap de l Enfant Test à faire après au moins 72H de naissance (J3 / 4 e jour de vie min) ~ Tryptophane (Trp/W) Hétérocycle indole A l origine de : Mélatonine : alternance jour/nuit (circadien) Sérotonine : satiété, sommeil, humeur Kynurénine (tics psychiatriques) # 1 A.A. Cyclique ~ Proline (Pro/P) Présence de Fonction amine II Noyau Pyrole / cycle pyrolidine Peut devenir α-iminé avec N = C(α) Rôle de Structure 3D particulière : Ex : Collagène : Rigidité Protéique (pas de rotation entre amine et C(α) Casse les hélices α Permet des coudes (changement direction au sein de protéine) Réticulation si hydroxylé : 4-OH Proline

12 2) A.A. Polaires NON Chargés # Groupement Hydroxyl (OH) Permet estérification avec acide phosphorique : activation / désactivation protéique O-Glycosylation (réaction enzymatique, volontaire) ( glycation non enzymatique, non volontaire : réaction chimique) à l origine de l hémoglobine glyquée : marqueur sanguin du diabète (HbA1C) Enzyme OH O - : site catalytique (substrat +) ~ Sérine (Ser/S) Alcool I (CH2 OH) Sérine utilisée par la Sélénocystéine-synthétase pour fixer un atome Se issu du grpmt donneur SélénoPhosphate ~ Thréonine (Thr/T) 2 C* Fonction Alcool II ~ Tyrosine (Tyr/Y) Présence d un groupement phénol (AA aromatique) Mise en équivalence fonction phénol utilisée dans dosage protéique des liquides bio. (réaction chimique, pas spectrale) Origine : Des hormones Thyroïdiennes De la DihydroxyPhénylalanine (DOPA) Dopamine Intermédiaire d autres catécholamines Neuromédiateur des neurones dopaminergiques du SNC / locus niger (touché par Parkinson) Implication réaction émotionnelle, apprentissage et mouvement fins Si déficit maladie de Parkinson / Traitement par L-DOPA De la mélanine (mélanocytes) par tyrosinase : Mélanine : protection contre les UV Albinisme : cheveux décolorés / yeux très clairs Problèmes dermato / oculaire Hypersensibilité aux UV

13 # Fonction Amide (CO NH2) Transport sanguin de l azote Phénomène de N-glycosylation ( N glycation) ~ Asparagine (Asn/N) ~ Glutamine (Gln/Q) [c] sanguine la plus importante des 20 AA (Culture Ȼ : milieu de culture enrichi en Gln) A l origine du glutathion (détoxification / lutte contre les DRO) # Soufré ~ Cystéine (Cys/C) Fonction Thiol : pont disulfure / liaison covalente Au sein d une même chaîne ou entre chaînes (SH + SH = S S) Cys Cys = Cystine dans glutathion Implication dans réaction d oxydo-réduction 3) A.A. Polaires Chargés # A.A. Dicarboxyliques : caractère acide net / Chargé négativement (COO - ) ~ Acide Aspartique / Aspartate (Asp/D) A.A. le plus acide des 20 ~ Acide Glutamique / Glutamate (Glu/E) Origine γ-carboxy-glutamate (coagulation) Coagulation anormalement élevée = Thromboses, embolies

14 # A.A. Basiques : Chargés positivement (NH3 + ) ~ Histidine (His/H) Noyau Imidazole imidozalium (NH3 + ) Site catalytique enzymatique (proton) Interaction avec substrat chargé - Origine de l histamine ~ Lysine (Lys/K) Butyl-Amine Butyl-Ammonium (NH3 + ) Permet synthèse Carnitine (entrée AG dans mitochondrie β-oxydation) 5-OH lysine : structuration du Collagène ~ Arginine (Arg/R) Guanidine Guanidium (NH3 + ) Donneur NO (vasodilatateur / Nobel 1998) 4) A.A. Essentiels / Non Essentiels Dépend des espèces Organisme incapable de les produire à partir de composés intermédiaires tributaire apport exogène (alimentation ++) 8 Essentiels : Val, Leu, Ile, Mét, Phe, Trp, Thr, Lys 2 Semi-Essentiels : His, Arg [grossesse, croissance]

15 D. Réactions liées au Groupe Carboxylique des A.A. 1) Activation des A.A. Incorporation des AA dans protéine : nécessité d activation Activation = liaison à ARNt ARNt : adaptateur (bras anticodon avec ARNm + bras AA, terminé par l AA à incorporer) Liaison entre OH en 3 de l ose et COOH de l AA Formation d acyl ARNt (amino-acyl ARNt synthétase) AA + ARNt + ATP AA ARNt + AMP + PPi (pyrophosphate) 2) Formation de sels R COOH RCOO - Cat + APARTÉ SUR LES ENZYMES Enzyme : Responsable de réaction enzymatique : Substrat Produit Partie de l enzyme : 3D / Site catalytique (lieu unique) Terminée par -ase mais aussi code : EC : syst numérique de la connaissance des enzymes W : indique la réaction catalysée (1-6) X : indique le substrat général (ou groupe de substrat) impliqué Y : indique le substrat spécifique (grp substrat) ou la coenzyme Z : le numéro de série de l enzyme Ex : oxydase de glucose EC Notion de cofacteurs : Non protéique Simple : atome ionisé (Zn 2+ ), molécule d eau Complexe : coenzyme (ex : Vit du groupe B) Cinétique enzymatique : équation Michaelis Menten K1 K2 K3 Mesure activité enzymatique : unité internationale (UI) / Katal (Kat)

16 3) Décarboxylation Transformation enzymatique visant à enlever un COOH : L Amino-Décarboxylase Co-Facteur : phosphate de pyridoxal (forme active Vit B6) Hydrosoluble (comme Vit A, D, E, C, K) Need 2 mg / j Histidine Histamine : par histidine décarboxylase o Neurotransmetteur o Médiateur allergique : mastocytes vasodilatation capillaire, inflammation Flore bactérienne, intoxicat alimentaire (poisson cru mal préparé/pourri) o Sécrétion gastrique (+) récepteurs sur estomac (sécrétion HCl), ulcération o Médicament anti-histaminiques anti-allergie / anti-ulcéreux (récepteur Histaminique) Anti RH1 Anti RH2 Synthèse des Catécholamines : Enzyme / Cofacteur Tyrosine Adrénaline Tyrosine Hydroxylase BH4 BH2 Phényléthanolamine N-Méthyl Transférase L-DOPA Noradrénaline Décarboxylase des A.A. Aromatiques Phosphate de Pyridoxal Vit C Dopamine Hydroxylase Dopamine Absence Dopamine maladie de Parkinson (locus niger) 1 e et 3 e étapes = hydroxylation / 2 e étape = décarboxylation

17 Adrénaline : hormone de Stress / réponse rapide Aug glycémie (Glycogénolyse) / stimule lipolyse (TG en AG libérés) Oriente flux sanguin vers organes «nobles» : cœur, cerveau, muscles Aug rythme cardiaque / aug pression artérielle / dilatation bronchique E. Réactions dues au groupement Amine 1) Transamination Nécessité de formation de base de Schiff! o Réaction entre NH2 d AA et aldéhyde aromatique (phosphate de pyridoxal) o Passage du phosphate de pyridoxal en phosphate de pyridoxine 2 enzymes importantes en bio Humaine (échanges entre AA et AcCétonique) ~ Alanine Amino-Transférase (ALAT/SGPT) (Cytoplasme) Alanine (AA1) + α-céto-glutarate L-Glutamate (AA2) + Pyruvate ~ Aspartate Amino-Transférase (ASAT/SGOT) (Mitochondries) L-Aspartate (AA1) + α-céto-glutarate L-Glutamate (AA2) + Ac Oxaloacétique Intérêts dosage lors Nécrose Hépatique (hépatite) : Si augmentation ALAT : Atteinte Cytoplasmique Apparition ASAT : Atteinte mitochondriale 2) Désamination 3 enzymes : désaturante / non oxydative / oxydative Production de NH3 / toxicité sauf foie (cycle de l urée) 3) N-Alkylation / N-Arylation / N-Acylation Substitution par R d un H du groupement amine : I R II R R = groupement aliphatique (alkylation), aromatique (Arylation) Groupement formyl, acétyl ou carbobenzoxyl (Acylation)

18 4) Condensation avec Ninhydrine 2 molécules de ninhydrine réaction avec : o Amino-acides : couleur pourpre (bleu-violet) appl. Empreinte digitale o Imino-acides (proline) : couleur jaune Destruction de l Acide Aminé Intensité de coloration proportionnelle à la concentration d AA (dosage Beer Lambert) Détection : 1 nano (10-9 ) mol.l -1 (fluorexamine 1 pico (10-12 ) mol.l -1 )