THESE. Carla SAMPAIO. RÔLE DE GAB1 DANS L INTERCONNECTION ENTRE LES VOIES Ras/MAPK ET PI3K EN AVAL DU RECEPTEUR DE L EGF

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1 UNIVERSITE TOULOUSE III- PAUL SABATIER U.F.R Sciences THESE En vue de l obtention du DOCTORAT DE L UNIVERSITE DE TOULOUSE délivré par l Université Toulouse III- Paul Sabatier Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée Présentée et soutenue par Carla SAMPAIO Le 31 mars 2008 RÔLE DE GAB1 DANS L INTERCONNECTION ENTRE LES VOIES Ras/MAPK ET PI3K EN AVAL DU RECEPTEUR DE L EGF Directeurs de thèse : Pr. Jean-Pierre Salles et Dr. Patrick Raynal JURY : Pr. Bertrand Perret INSERM U563, Toulouse Président Dr. Jacques Nunès INSERM UMR 891, Marseille Rapporteur Pr. Gérard Mauco INSERM ERM 324, Poitiers Rapporteur Pr. Marie-Odile Jauberteau Faculté de Médecine EA 3842, Limoges Examinateur Dr. Patrick Raynal INSERM U563, Toulouse Examinateur Pr. Jean-Pierre Salles Université Paul SABATIER, Toulouse III Examinateur INSERM U563 Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan Département Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques CHU Purpan, Toulouse, France

2 Je dédie ce travail A mes parents, A Christophe,

3 Je tiens tout d abord à remercier les membres du jury : Remerciements Monsieur le Professeur Bertrand Perret, pour avoir accepté de présider ce jury. Je vous suis également reconnaissante pour votre disponibilité et pour l intérêt que vous avez porté à mon travail tout au long de ma thèse. Monsieur le Docteur Jacques Nunès et Monsieur le Professeur Gérard Mauco pour avoir accepté d être rapporteurs de ce cette thèse. Je les remercie pour le temps qu ils ont consacré pour juger ce travail. Merci de l intérêt que vous avez porté à cette thèse. Madame le Professeur Marie-Odile Jauberteau pour avoir accepté de juger ce travail en tant qu examinateur. Je tiens à vous exprimer ma respectueuse considération et ma sincère gratitude. Merci d avoir pris le temps de venir à Toulouse et pour votre gentillesse. Monsieur le Professeur Jean-Pierre Salles et Monsieur le Docteur Patrick Raynal, mes directeurs de thèse, pour m avoir accueillie dans leur équipe. Je remercie tous les membres passés et présents du labo 107 : Merci à Marie et à Armelle pour votre participation pour le papier, pour votre motivation. Bonne chance à toutes les deux autant sur le plan professionnel que personnel. Merci à Alex pour tes conseils et également pour ta disponibilité. Bonne chance en Suisse pour ton post-doc et dans la réalisation de tes projets personnels. Merci à Audrey pour ta gentillesse, ta bonne humeur. Merci également pour le nouvel an très réussi (tu remerciera Thibault également). Je te souhaite bonne chance pour la suite de ta thèse. Merci à Marie-Anaïs pour ta gentillesse, ta spontanéité. J espère que tu réussiras à avoir une bourse de thèse. Je te souhaite le meilleur pour la suite. Et à Sophie que je remercie pour sa bonne humeur. Je te félicite pour ton mariage. Au milieu de toutes ces filles, il y a quand même deux représentants de la gente masculine. Tout d abord, le premier venu, le docteur Thomas. Je le remercie pour sa gentillesse, sa motivation, sa bonne humeur, son écoute. Bonne chance pour la suite tant du point de vue professionnel que

4 Remerciements personnel. Enfin, Jean-Philippe pour sa motivation et sa gentillesse. Je te souhaite bonne chance pour la suite de ta carrière. Tes enfants sont vraiment mignons, profites en bien. Je penses également à deux personnes qui sont passées au 107 : Delphine et Rana. Je les remercie pour leurs encouragements, leur gentillesse, leur bonne humeur. Bonne chance à toutes les deux : Delphine en Alsace et Rana entre la France et le Liban. Après le 107, je tiens à remercier les autres personnes qui font partis du premier étage : Merci tout d abord à Nicole pour ta gentillesse, ta disponibilité et les conversations que nous avons eu. Merci pour ta contribution pour le papier. Je remercie également Clo pour tout ce que tu fais pour le labo, pour ton franc parlé, pour ta disponibilité et ta gentillesse. Merci à Monique pour autant de gentillesse, de disponibilité. Je remercie également Fabienne, Muriel, Anne, Marianne, Sara et Hélène pour leur gentillesse et leur bonne humeur quotidienne. Merci à Safouane pour tes encouragements et tes bons conseils. Merci également pour ta gentillesse. Merci également à Françoise qui m a aidé pour les transfections dans les HEK293. Merci pour ton naturel et ta gentillesse. Merci à Ama et à layal pour leur gentillesse et leurs encouragements. Merci à Ronan pour sa gentillesse. Bonne chance pour la fin du master. Je finirai par les expertes en lipidomique : Véronique et Justine. Merci pour votre naturel et votre gentillesse. Je remercie également deux personnes qui ont fait parti du premier étage : Michel Record et Caro. Merci à tous les deux pour votre bonne humeur, votre simplicité. J ai été contente de vous revoir au congrès du GSO. Merci Caro pour nos longues conversations quand tu étais au bâtiment C. Je te souhaite bonne chance pour la fin de ta thèse et pour ta soutenance. Tu es courageuse car tu fais une thèse en étant maman de deux mignonnes petites filles. Bravo!

5 Je remercie également l ensemble des personnes qui font parti du thème A : Remerciements Merci à Claudia pour ses encouragements et ce qui l a caractérise avant tout, sa gentillesse. Je remercie Aurélie, Pierre, Anne-Lise, Mihaela pour leur naturel, leur gentillesse et leur soutien. Merci beaucoup. Un grand merci également à Michel, Christine C., Christine P., Coco pour votre bonne humeur, votre disponibilité, votre gentillesse. Je remercies également le reste des membres du thème A : Xavier, François, Laurent, Eric, Gérald, Véro, Jayati, Stéphane. Un très grand merci à Yvette qui est toujours disponible pour nous tous. Merci pour ta gentillesse et tes qualités humaines. Bonne chance pour la suite. Je vous remercie tous pour vos encouragements. Je vous souhaite à tous une bonne continuation, une bonne réussite. Bon courage et bonne chance à tous les étudiants. Je remercies également mes ami(e)s qui m ont encouragé tout au long de ces quatre années de thèse : Merci à Faby pour ton écoute, d avoir été toujours là pour moi. J espère que je ne t ai pas trop embêtée avec mes ras le bol. Tu es une véritable amie. Merci d être venue à ma soutenance. Merci à Nico pour ses encouragements, et son soutien. Dommage que tu ne sois pas venu à ma soutenance. J espère qu on aura bientôt l occasion de se revoir. Merci à Nath et Nico d avoir pris votre journée pour venir m encourager. Dommage que vous n ayez pas pu rester le soir. On se fera un restau à Limoges. Vivement le 26 juillet, tu vas être magnifique dans ta robe Nathalie. J ai intérêt d emmener les mouchoirs. Je vous remercie encore d avoir été là. Merci à Catherine que je n avais pas vu depuis de nombreuses années. J ai été vraiment contente de te revoir. Merci d être venue. Je te souhaite bon courage pour la fin de ta thèse. Tu y arriveras sans problème. Merci à Abdel et à Ibtissam (poupougne), que j ai connu pendant mon année de DEA, pour votre soutien. Merci Ibtissam d être venue à ma soutenance. Vous avez un petit garçon magnifique. A très bientôt à Limoges.

6 Remerciements Un grand merci à mes ami(e)s de Dijon avec lesquels(lles) je n ai pas eu l occasion de fêter ma réussite: A Natacha qui est mon amie depuis plus de 15 ans, et avec qui j ai passé de bons moments. Merci pour tes appels qui m ont détendu pendant que j écrivais mon manuscrit. A Rémy et à Emilie pour vos encouragements. Super moments sur msn. Elles sont belles tes photos Rémy. A Delph, JC et leur petit Gaby qui maintenant habitent assez loin de Dijon. J espère avoir l occasion de venir voir votre maison. Merci pour votre soutien. On fera la fête lors de ma venue sur Dijon. Je remercie également Nono, Cris, Cédric et Céline pour vos encouragements. Il faut absolument qu on se revoie car ça fait un moment. Le temps passe vraiment vite. Je pense également à Maha qui est partie en Palestine depuis plus d un an. Bonne chance à toi. J espère pouvoir te revoir un jour. Merci également à Séverine pour tes encouragements. J espère qu on pourra se revoir bientôt. Merci à chacun pour votre amitié. Que cette amitié dure encore longtemps. Je vous souhaite à tous beaucoup de bonheur. Un grand merci à mes parents qui ont cru en moi, qui m ont encouragé et qui ont fait des sacrifices pour que je réussisse. C est grâce à eux que j ai réussi, je leur serais à tout jamais reconnaissante. Je vous dois énormément. Encore merci! Je vous aime. J ai une pensée particulière pour ma grand-mère qui aurait été très contente et fière. Je remercie également mes futurs beaux parents pour être venus à ma soutenance après un long voyage. Merci pour vos encouragements et votre soutien. Enfin, un grand merci à Christophe pour ton amour, ta présence, tout ce que tu as fait pour moi. Merci pour m avoir tant aidé durant ces quatre années de thèse, de m avoir soutenue. Heureusement que tu étais là pour me préparer à l oral. Je t aime. Toutes mes excuses aux personnes que j ai oubliées.

7 Sommaire Résumé.4 Abstract....5 Abréviations. 6 Liste des figures et des tableaux.8 Introduction générale Introduction bibliographique Chapitre I: Les récepteurs à activité tyrosine kinase I. Généralités sur les récepteurs à activité tyrosine kinase Introduction Structure des RTK Le domaine extracellulaire Le domaine transmembranaire Le domaine intracellulaire et l activité tyrosine kinase Activation des RTK Dimérisation des récepteurs Autophosphorylation des tyrosines II- Les récepteurs de la famille ErbB Introduction Structure des récepteurs ErbB Les ligands des récepteurs ErbB Dimérisation des récepteurs ErbB Rôles physiologiques des récepteurs ErbB Transactivation des récepteurs ErbB Mécanismes de régulation de l activation de l EGFR Régulation par des antagonistes de l EGFR Régulation par les protéines phosphatases Régulation par l inhibition de l activité catalytique par la PKC Régulation par endocytose dépendant de la clathrine Les voies de signalisation activées par les récepteurs ErbB Chapitre II : Les voies de signalisation Ras/MAPK et PI3K I. La voie de signalisation des MAPK La voie canonique Ras/MAPK Présentation de la superfamille Ras La protéine Ras

8 a. Structure des isoformes de Ras b. Modifications et localisation des isoformes de Ras 37 c. Activation de Ras.38 d. Mécanismes de régulation négative de l activation de Ras.. 39 e. Effecteurs de Ras..39 f. Invalidation de Ras chez la souris Le module Raf/MEK/ERK La famille Raf.42 a. Structure des protéines de la famille Raf..42 b. Activation de Raf c. Inhibition de Raf 44 d. Invalidation des isoformes de Raf chez les souris Les kinases MEK1/ Les kinases ERK1/ Les substrats de ERK1/ a. Substrats nucléaires b. Substrats cytoplasmiques Régulation de la voie des MAPK 48 a. Les protéines dites scaffold.. 49 b. Les régulateurs positifs et négatifs.. 51 c. Les phosphatases..52 II. Les protéines Gab et SHP Les protéines Gab Structure et expression Phosphorylation des protéines Gab Recrutement des protéines Gab Rôles fonctionnels des protéines Gab : études des KO La protéine phosphatase SHP Gab1, SHP2 et la voie des MAPK. 57 III. La voie PI3K Présentation de la famille des PI3K Fonctions biologiques des différentes isoformes des PI3K Mécanisme d activation des PI3K de classe I Les 3- phosphoinosides Phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P) Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PI3,4P2) Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3) Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI3,4P2) La sérine/thréonine kinase Akt Structure et expression de Akt Mécanisme d activation de Akt Effets biologiques de l activation de la voie PI3K/Akt Régulation des PI3K Gab1, SHP2 dans l activation de la voie des PI3K 72 IV. Interconnection entre les voies Ras/MAPK et PI3K Régulation de la voie MAPK par la voie PI3K Régulation de la voie PI3K par la voie Ras/MAPK

9 Chapitre III : Implications des récepteurs ErbB dans les cancers..77 I. Dérégulations des récepteurs ErbB dans les cancers 77 II. Inhibiteurs des ErbB en thérapie anti-cancéreuse Les anticorps monoclonaux Les inhibiteurs de l activité kinase Autres inhibiteurs.85 III. Phénomène de résistance.. 86 Résultats expérimentaux.88 Rôle conditionnel de PI3K dans l activation de la voie Ras/MAPK en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2..89 I. Introduction II. Résultats. 90 III. Conclusion Perspectives Références bibliographique

10 Résumé Résumé Mes travaux de thèse se sont portés sur l étude des voies de signalisation cellulaire induites par le récepteur de l EGF (EGFR) et plus particulièrement sur l'activation de la voie Ras/MAPK en aval de l EGFR. L EGFR joue des rôles fondamentaux en terme de prolifération, de différenciation et de survie cellulaire, notamment au cours du développement embryonnaire de multiples organes. L activité biologique de l EGFR est étroitement liée à sa capacité à initier des voies de signalisation telles que la voie Ras/ Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) et la voie des phosphoinositide-3-kinases (PI3K). De plus, la dérégulation de l EGFR, sa surexpression ou des mutations oncogéniques sont retrouvées dans de nombreuses tumeurs solides (les glioblastomes, les cancers du sein, les cancers ovariens, etc...) et sont corrélées à un mauvais pronostic. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces voies de signalisation permettrait d identifier de nouvelles cibles potentielles aboutissant à une pharmacologie anti-tumorale. Le but de notre travail a été de rechercher dans quelles conditions la PI3K participe à l activation de la voie Ras/MAPK en réponse à l EGF. Nous avons alors proposé un modèle selon lequel la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de PI3K, en réponse à l EGF serait en fait conditionnée par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2. En effet, nous avons montré que selon la force du signal ou la quantité d EGFR mobilisés, le module Gab1/SHP2 est soit recruté par le domaine PH de Gab1 qui présente une affinité spécifique pour le PIP3, soit par l intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2, rendant ainsi l activation des MAPK dépendante ou pas de la voie PI3K. De plus, nous avons montré que ce mécanisme de recrutement de Gab1 est retrouvé dans les cellules de glioblastomes résistantes aux inhibiteurs de l EGFR. Ainsi, dans les cellules de glioblastomes qui présentent une activation résiduelle de l EGFR, ce mécanisme de recrutement de Gab1 devient nécessaire pour activer efficacement la voie Ras/MAPK, ce qui pourrait alors expliquer la résistance aux inhibiteurs de l EGFR. Dans ce cas là, les inhibiteurs de PI3K combinés aux inhibiteurs de l EGFR vont permettre d inhiber l activation de la voie Ras/MAPK. Ainsi, la protéine adaptatrice Gab1 a pu être identifiée comme étant la protéine centrale dans l activation de la voie Ras/MAPK induite par l EGFR. De ce fait, Gab1 pourrait potentiellement devenir une cible thérapeutique de choix dans une stratégie anti-tumorale dirigée contre certaines tumeurs solides comme par exemple les glioblastomes, permettant ainsi de ralentir la croissance tumorale et à terme une diminution de la masse tumorale. 4

11 Abstract Abstract My thesis work fell on the study of signalling pathways induced by the EGF (Epidermal Growth Factor) receptor (EGFR) and more particularly on the activation of the Ras/MAPK pathway downstream of EGFR. EGFR plays fundamental roles in proliferation, differentiation and cell survival, particularly during embryonic development of multiple organs. The biological activity of EGFR is closely linked to its ability to initiate signalling pathways such as the Ras/ Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) and the phosphoinositide-3-kinase (PI3K) pathways. In addition, dysregulation of EGFR, its overexpression or oncogenic mutations are found in many solid tumors (glioblastoma, breast cancer, ovarian cancer ) and are correlated with a poor prognosis. Thus, understanding the molecular mechanisms involved in these signalling pathways would identify new targets leading to a potential anti-tumor pharmacology. The goal of our work was to seek conditions when PI3K is involved in the activation of the Ras/MAPK pathway in response to EGF. We then proposed a model according to which the dependence of the Ras/MAPK pathway towards PI3K in response to EGF is in fact determined by the mechanism of recruitment of Gab1/SHP2 module. Indeed, we have shown that depending on the signal strength or the amount of EGFR mobilized, the Gab1/SHP2 module is either recruited through the Gab1PH domain which displays a specific affinity for the PIP3, either through the adaptor protein Grb2, thus making the activation of MAPK dependent or no of the PI3K pathway. In addition, we have shown that this mechanism of Gab1 recruitment is found in glioblastoma cells resistant to EGFR inhibitors. Thus, in glioblastoma cells where there is a residual activation of EGFR, the mechanism of Gab1 recruitment becomes necessary to activate effectively the Ras/MAPK pathway, which could explain the resistance to EGFR inhibitors. In this case, PI3K inhibitors combined with EGFR inhibitors will help to inhibit the activation of the Ras/MAPK pathway. Thus, the docking protein Gab1 has been identified as the central protein to the activation of the Ras/MAPK pathway induced by EGFR. As a result, Gab1 could potentially become a therapeutic target in an anti-tumor strategy against some solid tumors such as glioblastomas, thus slowing tumor growth and ultimately a reduction of the tumor mass. 5

12 Abréviations ABREVIATIONS ADAM: A Disintegrin and Metalloprotease ADN: Acide désoxyribonucléique AMPc: Adénosine monophosphate cyclique ARN: Acide ribonucléique ATP: Adénosine Trisphosphate CR: Conserved Region CRD: Cystein-rich domain CREB: camp response element-binding CNK: Connector Enhancer of KSR EGF: Epidermal Growth Factor EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor EPO: Erythropoïétine Eps15: EGFR pathway substrate 15 ERK : Extracellular-Regulated Kinase FGF: Fibroblast growth factor FGFR: Fibroblast growth factor receptor FYVE: Fab1p, YOTB, Vps27p, EEA1 Gab: Grb2-adapter binder GAP: GTPase Activating Protein GEF: Guanine Nucleotide Exchange Factor GDP: Guanosine diphosphate GH: Growth hormone GHR: Growth hormone receptor GM-CSF: Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor Grb2: Growth Factor Receptor binding Homology 2 GSK3: Glycogen Synthase Kinase 3 GTP: Guanosine Trisphosphate GTPase: Guanosine triphosphate hydrolase HB-EGF: Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HGF: Hepatocyte Growth Factor HGFR: Hepatocyte Growth Factor receptor HRS: Hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate Hsp: Heat Shock Protein Ig: Immunoglobuline IGF-1: Insuline Growth-1 IL: Interleukine KO: Knock out KSR: Kinase Supprossor of Ras MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MAPKK: MAPK Kinase MAPKKK: MAPKK Kinase MEK: MAPK/ERK Kinase MK: MAPK-activated protein kinases MBD: Met Binding Domain MDCK: Madin-Darby canine kidney MKP: MAPK Phosphatase MNK: MAPK interacting kinases MORG1: MAPK Organizer mtor: mammalian target of rapamycin 6

13 Abréviations MP1: MEK Partner 1 MSK: Mitogen- and stress activated kinases) NF: Neurofibromine NF1: Neurofibromatose de type 1 NFkB: Nuclear factor κb NGF: Nerve Growth Factor NRG: Neuréguline PDGF: Platelet Derived Growth Factor PDK: Phosphatidylinositol-dependent kinase PH: Pleckstrin Homology PI: Phosphatidylinositol PI3,4,5P3: Phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphatase PI3,4P2: Phosphatidylinositol 3,4 biphosphatase PI3K: Phosphoinositide 3-Kinase PI3P: Phosphatidylinositol 3 Phosphatase PI4,5P2: Phosphatidylinositol 4,5 biphosphate PKA, PKB, PKC: Protein Kinase A, B, C PLC, PLD: Phospholipase C, D PP: Protein phosphatase PRD: Paired domain PTB: Phosphotyrosine Binding PTEN: Phosphatase and tensin homolog PTK: Protéine Tyrosine Kinase PTP: Phosphotyrosine Phosphatase RA: Ras Associating RASSF: Ras-association domain family 1 RBD: Ras Binding Domain RCPG: Récepteur Couplé aux Protéines G RIN: Ras and Rab Interactor RSK: Ribosomal S6 Kinase RKIP: Raf kinase inhibitor protein RTK: Récepteur à activité Tyrosine Kinase SH2: Src Homology 2 SH3: Src Homology 3 SHIP2: SH2 domain-containing Inositol 5-Phosphatase SHP2: SH2 domain-containing Phosphatase 2 SHPS-1: SHP Substrate SIRP: Signal-Inhibitor Regulatory Protein Sos: Son of Sevenless SPRED: Sprouty- related proteins with EVH1 domains Spry: Sprouty STAT: Signal transducer and activator of transcription Sur8: Suppressor of Ras TGFα: Transforming Growyh Factor α TKI: Tyrosine kinase inhibitor VEGF: Vascular Epidermal Growth Factor 7

14 LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX Liste des figures et tableaux Figures : Figure 1: Classification des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), représentés suivant leurs caractéristiques structurales Figure 2: La liaison du ligand stabilise la formation de dimères activés Figure 3: Modèle de stimulation des tyrosines kinases par dimérisation des récepteurs Figure 4: Structure schématique des récepteurs ErbB Figure5: Mécanisme d hétérodimérisation des récepteurs ErbB, exemple de l hétérodimère ErbB2/ErbB3 Figure 6: Activation des récepteurs ErbB indépendante du ligand, exemple de l EGFR Figure 7: Mécanismes de transactivation des récepteurs ErbB par les RCPG Figure 8: Mécanisme de régulation par endocytose de l EGFR Figure 9: Schéma représentant les résidus phosphotyrosines spécifiques et la liaison des protéines de la signalisation aux récepteurs ErbB Figure 10: Les voies de signalisation des MAP kinases Figure 11: Le cycle des GTPases Figure 12: Structure des isoformes de Ras : HRas, NRas, KRas4A et KRas4B Figure 13: Modifications et localisation des protéines Ras Figure 14: Effecteurs de Ras et leurs réponses biologiques correspondantes Figure 15: Structure des trois isoformes de Raf. Figure 16: Schéma récapitulatif de l activation de la voie des MAPK Figure 17: Les substrats des MK Figure 18: Activation de la voie des MAPK dans des compartiments cellulaires variés. Figure 19: Les protéines scaffold impliquées dans la voie des MAPK Figure 20: Liste des protéines scaffold (à gauche) et des régulateurs négatifs et positifs (à droite) de la voie des MAPK Figure 21: Structure schématique des protéines Gab1, Gab2 et Gab3 humaines et des résidus tyrosine impliqués dans une interaction protéique Figure 22: Représentation schématique de la protéine phosphatase SHP2 Figure 23: Les différentes classes de PI3K Figure 24: Les voies de synthèse des PI Figure 25: Les différents effecteurs des PI3K de classe I Figure 26: Structure des trois isoformes humaines de Akt/PKB Figure 27: Représentation schématique du mode d'activation de Akt et de certaines voies de signalisation activées par Akt Figure 28: Modèle de la régulation de l activation de PI3K par la protéine phosphatase SHP2 Figure 29: Schéma de l activation des voies Ras/MAPK et PI3K en réponse à l EGF et de l interconnection entre ces deux voies Figure 30: Mécanismes selon lesquels l EGFR devient oncogénique Figure 31: Classification des différents anticorps monoclonaux (murin, chimérique, humanisé et humain) Figure 32: Schéma illustrant le rôle conditionnel de la PI3K dans l activation de la voie Ras/MAPK en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2 8

15 Liste des figures et tableaux Tableaux : Tableau 1 : Les récepteurs ErbB et leurs ligands connus Tableau 2 : Conséquences biologiques de l invalidation des gènes codant pour les récepteurs ErbB ou pour leurs ligands dans des organes Tableau 3 : Liste des antagonistes de l EGFR Tableau 4: Protéines tyrosine phosphatases régulant l EGFR Tableau 5: Conséquences biologiques de l invalidation des gènes codant pour les protéines Ras Tableau 6: Conséquences biologiques de l invalidation des gènes codant pour les sous-unités des PI3K Tableau 7: Liste des protéines régulant l activité de la sérine/thréonine kinase Akt/PKB Tableau 8: Conséquences biologiques de l invalidation des gènes codant pour les protéines PTEN et SHP1 et 2 Tableau 9: Dérégulations des récepteurs de la famille ErbB retrouvées dans les cancers Tableau 10: Mutations de l EGFR Tableau 11: Liste d anticorps monoclonaux anti-erbb utilisés en thérapie anti-cancéreuse Tableau 12: Liste d inhibiteurs de l activité kinase des récepteurs ErbB utilisés en thérapie anticancéreuse 9

16 Introduction générale Introduction générale Les récepteurs à activité tyrosine kinase intrinsèque (RTK) constituent une grande famille de récepteurs. Ces récepteurs sont généralement activés par dimérisation après fixation du ligand, entraînant alors un changement conformationnel permettant ainsi une augmentation de leur activité tyrosine kinase. Une fois activés, les RTK vont être capables d initier diverses voies de signalisation, leur permettant d induire de nombreux effets biologiques tels que la prolifération et la différenciation, ou encore la migration cellulaire. Les RTK, notamment un des plus étudiés actuellement, le récepteur de l EGF (epidermal growth factor) qui fait partie de la famille des récepteurs ErbB, induisent de nombreuses voies de signalisation mitogènes et en particulier, les voies Ras/MAPK (mitogen-activated protein kinase) et PI3K (phosphoinositide-3 kinase). Ces deux voies jouent un rôle dans de nombreuses fonctions cellulaires comme la prolifération, la survie ou la différenciation. Sur le plan physiopathologique, une hyperactivation ou diverses altérations de l EGFR ou d acteurs de ces deux voies sont associées à de nombreuses pathologies, notamment les cancers. Ainsi, ces différentes observations font de ces récepteurs ou des acteurs de ces voies de signalisation des cibles privilégiées en thérapie anti-cancéreuse. Ce manuscrit portera plus particulièrement sur l étude des 2 voies de signalisation majeures, les voies Ras/MAPK et PI3K, induites par le récepteur de l EGF. D ailleurs, ces deux voies sont étroitement liées. Il semble de plus que deux acteurs majeurs communs à ces 2 voies, interviennent dans les interconnections entre ces deux voies : la protéine adaptatrice Gab1 et la protéine phosphatase SHP2. Ainsi, comme nous le verrons dans ce manuscrit, les voies Ras/MAPK et PI3K présentent de nombreuses connexions entre elles et peuvent agir l une sur l autre par un réseau complexe de rétrocontrôles positifs ou négatifs, démontrant ainsi que la signalisation induite par les RTK est loin d être linéaire. De ce fait, si on agit sur une seule de ces 2 voies, il peut y avoir des conséquences majeures sur la deuxième, soulignant donc l importance de leur régulation et du maintien de leur intégrité. Dans un premier chapitre de l introduction bibliographique, nous nous intéresserons tout d abord aux récepteurs à activité tyrosine kinase et plus particulièrement aux récepteurs ErbB. Nous décrirons leur structure, leur mode de fonctionnement. Nous nous intéresserons également aux voies de signalisation induites par les récepteurs ErbB. Ensuite dans un deuxième chapitre, nous traiterons en détail de deux voies qui sont induites par l EGFR : la voie Ras/MAPK (Mitogen- Activated Protein Kinase) et la voie PI3K (phosphoinositides-3-kinase). Nous nous intéresserons également dans ce chapitre à la protéine adaptatrice Gab1 et à la protéine phosphatase SHP2 et nous aborderons l importance de ces deux protéines dans l activation de ces deux voies. Nous 10

17 Introduction générale terminerons ce chapitre par les interconnections entre les voies Ras/MAPK et PI3K. Le troisième chapitre sera consacré à l implication physiopathologique des récepteurs ErbB notamment dans les pathologies cancéreuses. Nous traiterons des dérégulations de ces récepteurs, des différents composés utilisés pour inhiber les récepteurs ErbB et enfin nous nous intéresserons aux résistances aux inhibiteurs anti-erbb développées par les cellules. D après la littérature, il existe des interconnections entre la voie Ras/MAPK et la voie PI3K. Dans certains modèles cellulaires, sous certaines conditions, il a été admis que l activation de la voie Ras/MAPK pouvait être dépendante de la voie PI3K en réponse à l EGF. Pourtant, cette observation n a pas été retrouvée dans certains types cellulaires. Au vu de ces contradictions, il semblerait que l activation de la voie Ras/MAPK par la voie PI3K dépende de la force du signal ou du type cellulaire considéré. De plus, le mécanisme moléculaire mis en jeu lors de cette dépendance n a pas été identifié. Le but de ce travail de thèse a donc consisté à identifier le mécanisme moléculaire qui permet à la PI3K de participer à l activation de la voie Ras/MAPK selon la force du signal de stimulation. Nous avons donc réussi à démontrer que la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de PI3K est conditionnée par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2. En effet, nous avons montré que lors de stimulation de forte intensité, le module Gab1/SHP2 est recruté par l intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2, ce qui rend alors l activation de la voie Ras/MAPK indépendante de PI3K. Au contraire, lors de stimulation de forte intensité, le module Gab1/SHP2 est recruté par l interaction du domaine PH de Gab1 avec les produits de PI3K, ce qui rend alors l activation de la voie ras/mapk dépendante de PI3K. De plus, nos résultats suggèrent que cette activation des MAPK dépendante de la PI3K par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2 pourrait être impliquée dans la résistance à un inhibiteur de l EGFR observée dans des lignées de glioblastomes. Les résultats obtenus ont donc permis de démontrer que la protéine adaptatrice Gab1 et la phosphatase SHP2 jouent un rôle important dans l activation des voies Ras/MAPK et PI3K. De plus, les protéines Gab1 et SHP2 interviennent lors des processus cancéreux, donc elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques de choix. Ainsi, en ciblant le recrutement du module Gab1/SHP2 à la membrane, l activation de Ras/MAPK serait inhibée, ce qui devrait entraîner une diminution de la prolifération cellulaire. 11

18 Introduction bibliographique 12

19 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase I. Généralités sur les récepteurs à activité tyrosine kinase. 1. Introduction Les récepteurs à activité tyrosine kinase intrinsèque (RTK) également appelés récepteurs des facteurs de croissance, sont des glycoprotéines transmembranaires composées d un domaine extracellulaire très variable capable de fixer le ligand, d un domaine transmembranaire permettant l ancrage dans la membrane cellulaire et d un domaine intracellulaire (cytoplasmique) qui renferme l activité tyrosine kinase et permet la transduction du signal au sein de la cellule. L activité enzymatique des RTK est localisée dans le cytoplasme et permet le transfert du phosphate γ de l ATP vers l hydroxyle des tyrosines des protéines cibles et/ou du récepteur lui-même, c est ce qu on appelle l autophosphorylation. Les RTK sont d importants régulateurs de la communication intercellulaire, ils jouent en effet un rôle important dans le contrôle de nombreux processus biologiques, tels que le cycle cellulaire, la migration cellulaire, le métabolisme, la croissance, la prolifération et la différenciation cellulaire (Ullrich and Schlessinger, 1990; Zwick et al., 2002). Ces récepteurs membranaires sont des composants essentiels des voies de signalisation cellulaires qui sont actives durant le développement embryonnaire et l homéostasie cellulaire chez l adulte. Les RTK sont une famille de 58 récepteurs de surface cellulaire de type I comportant des caractéristiques structurales et fonctionnelles similaires (Schlessinger, 2000). Selon leur organisation structurale, ces récepteurs se regroupent en plusieurs familles. Vingt familles de RTK ont été décrites jusqu à présent (figure 1). Parmi ces différentes familles, on distingue les récepteurs à l insuline (IR), les récepteurs aux facteurs de croissance de l épiderme (EGFR), les récepteurs aux facteurs de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR), les récepteurs aux facteurs de croissance de l endothélium vasculaire (VEGFR) et les récepteurs aux facteurs de croissance des fibroblastes (FGFR). 13

20 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase Figure 1: Classification des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), représentés suivant leurs caractéristiques structurales. Abréviations: AB: boîte acide, CadhD: domaine de type cadhérine, CRD : domaine riche en cystéine, DiscD: domaine de type discoidine, EGFD : domaine de type EGF (facteur de croissance épidermique), FNIII: domaine de type fibronectine type III, IgD: domaine de type immunoglobuline, KrinD : domaine de type kringle, LRD: domaine riche en leucine. D après (Blume-Jensen and Hunter, 2001). 2. Structure des récepteurs RTK Les RTK sont composés de trois domaines distincts : le domaine extracellulaire, le domaine transmembranaire et le domaine intracellulaire Le domaine extracellulaire Le domaine extracellulaire des RTK, qui permet la fixation de ligands est très diversifié et très glycosylé. Ce domaine extracellulaire présente une variété d éléments conservés tels que les domaines de type immunoglobuline (IgD), de type fibronectine III (FNIII), de type facteur de croissance épidermique (EGFD), riche en cystéine et riche en leucine. Ces différents domaines déterminent la spécificité de la liaison au ligand. En effet, la liaison du ligand au domaine extracellulaire provoque des changements conformationnels qui induisent et stabilisent la dimérisation du récepteur (Heldin, 1995). 14

21 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase 2.2. Le domaine transmembranaire Le domaine transmembranaire est constitué d un seul segment de 22 à 26 acides aminés, organisé en une seule hélice. Le domaine transmembranaire est caractérisé par une séquence hydrophobe dont la fonction est l'ancrage du récepteur à la membrane. Des mutations ont été identifiées dans les domaines transmembranaires d au moins deux familles de RTK, fibroblast growth factor receptor (FGFR) et epidermal growth factor receptor (EGFR) aboutissant à une activation constitutive du récepteur par une dimérisation indépendante du ligand (Sternberg and Gullick, 1989; Webster and Donoghue, 1996). Même si ce domaine ne joue pas un rôle dans l activation du récepteur, il pourrait jouer un rôle au niveau de sa conformation et de la stabilisation des récepteurs dimériques Le domaine intracellulaire et l activité tyrosine kinase Le domaine intracellulaire se compose d une région juxta-membranaire suivie par le domaine catalytique tyrosine kinase et terminé par la région carboxy-terminale. Ces régions contiennent des sous-domaines régulateurs influençant négativement ou positivement la liaison du substrat et la phosphorylation, ainsi que les sous-domaines impliqués dans la dimérisation et/ou dans les changements structuraux pendant l activation de la kinase après la liaison du ligand. La longueur et la séquence des domaines juxta-membranaire et carboxy-terminal varient suivant les RTK et contiennent des sites de phosphorylation tyrosine et sérine/thréonine. Ces sites peuvent être phosphorylés par le récepteur lui-même (autophosphorylation) ou par des protéines kinases (Hubbard, 2002). Il a été établi que le domaine tyrosine kinase comporte onze sous-domaines majeurs (I à XI). Les domaines I à V forment le domaine de liaison à l ATP, complexé aux ions Mn2+ ou Mg2+. Les domaines VI et VII sont dotés de l activité phospho-transférase. Les kinases possèdent une boucle d activation comprenant les sous-domaines VII et VIII comportant entre une et trois tyrosines. L activité kinase est cruciale pour l'activation des voies de transduction aboutissant à l'induction des réponses cellulaires comme la survie, la prolifération et la différenciation (Hubbard and Till, 2000). Un domaine tyrosine kinase intact est absolument nécessaire dans la signalisation du récepteur. En effet, des mutations d un seul résidu dans ce domaine peuvent entraîner la perte de la fonction du récepteur. 15

22 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase 3. Activation des RTK 3.1. Dimérisation des récepteurs L élément déclencheur de l activation des RTK est la fixation du ligand, qui conduit à la dimérisation non covalente des récepteurs. Les RTK sont présents à la surface cellulaire sous forme d une seule chaîne polypeptidique et monomérique en l absence de ligand. L exception à cette règle est la famille HGFR et la famille des récepteurs à l insuline. Ainsi, le récepteur aux facteurs de croissance des hépatocytes (famille HGFR), possède une chaîne α liée par un pont disulfure à une chaîne β dans le domaine extracellulaire donc ce récepteur se trouve déjà sous forme de dimère. Les récepteurs à l insuline et IGF-1 possèdent deux chaînes α extracellulaires, chacune d entre elles étant liée à une chaîne β par un pont disulfure, pour former un hétéro-tétramère α2β2 (Schlessinger, 2000). L interaction du ligand avec le domaine extracellulaire conduit donc à la dimérisation du récepteur et à la formation d un complexe protéique généralement constitué de deux chaînes de récepteurs et de deux molécules de ligands. Ainsi, les complexes EGF-EGFR et FGF-FGFR montrent une stoechiométrie 2 :2 (ligand-récepteur) (Lemmon et al., 1997; Plotnikov et al., 1999). Dans le cas du complexe FGF-FGFR, les interactions FGF-FGFR ne sont pas suffisantes pour stabiliser le dimère FGFR, qui nécessite des molécules d héparine qui sont essentielles à la stabilité du complexe (Spivale-Kroizman et al 1994). Par contre, des études menées sur le ligand GH et son récepteur GHR ont montré que GH se fixe sur son récepteur avec une stoechiométrie 1 :2 (ligand-récepteur). Le ligand se fixe simultanément sur deux récepteurs (Kossiakoff and De Vos, 1998). La liaison du ligand va stabiliser le dimère actif stimulant ainsi l activité tyrosine kinase. Il a été proposé que des dimères actifs existent même en l absence de liaison du ligand puisque l autophosphorylation des RTK peut être augmentée par des inhibiteurs des protéines tyrosines phosphatases ou par une surexpression du récepteur même en absence de liaison du ligand (Schlessinger, 2000). L existence de différents états d équilibre entre dimères actifs et inactifs est représentée dans la figure 2. 16

23 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase Figure 2 : La liaison du ligand stabilise la formation de dimères activés. Les récepteurs monomériques (vert) sont en équilibre avec les récepteurs dimériques inactifs (vert) ou actifs (bleu). Les récepteurs dimériques actifs existent dans une conformation compatible avec la transautophosphorylation et la stimulation de l activité protéine tyrosine kinase. La fixation de ligand stabilise la formation de dimère actif. D après (Schlessinger, 2000). La dimérisation non covalente des RTK, induite ou stabilisée par la fixation de ligand, est le mécanisme déclencheur de l autophosphorylation des tyrosines (Heldin, 1995; Ullrich and Schlessinger, 1990). La fixation de ligand au domaine extracellulaire peut induire un réarrangement structural des récepteurs hétérotétramèriques (exemple du récepteur à l insuline), facilitant l autophosphorylation des tyrosines dans le domaine cytoplasmique. Dans certains cas, la dimérisation est certes nécessaire pour l activation tyrosine kinase mais n est pas suffisante (Bennasroune et al., 2004). Par exemple, dans le cas du récepteur tyrosine kinase Eph, la dimérisation est suffisante pour l autophosphorylation des récepteurs, à la condition d une organisation des récepteurs en tétramère pour susciter toutes les réponses biologiques dans la cellule (Stein et al., 1998). De plus, dans le cas du FGFR, l activation du récepteur nécessite aussi la coopération avec certains protéoglycanes de la matrice extracellulaire pour stabiliser le complexe. Dans la plupart des cas, la dimérisation des RTK est probablement suffisante pour la transduction du signal. De plus, une boucle activatrice est présente dans les domaines tyrosine kinase cytoplasmiques. En conformation dite fermée, la boucle masque le site de liaison à l ATP, réduisant ainsi l activité catalytique de la protéine. Lorsque les résidus tyrosines appartenant à la boucle sont phosphorylés par un récepteur voisin (trans-autophosphorylation), elle se stabilise dans une conformation dite ouverte permettant alors la fixation de l ATP et la phosphorylation. 17

24 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase 3.2. Autophosphorylation des tyrosines L augmentation de l activité catalytique intrinsèque du récepteur et la création de sites de fixation dans le domaine intracellulaire, afin de recruter les protéines de signalisation, sont les deux étapes clés de l activation des récepteurs. Pour la plupart des RTK, la réalisation de ces deux étapes nécessite l autophosphorylation des résidus tyrosines du domaine intracellulaire, permise par l oligomérisation des récepteurs déclenchée par la fixation du ligand. L autophosphorylation des résidus tyrosines de la boucle activatrice du domaine tyrosine kinase génère des sites de fixation pour les protéines de signalisation pouvant reconnaître les séquences contenant des phosphotyrosines. L autophosphorylation des tyrosines peut être cis, dans ce cas la phosphorylation est effectuée par le récepteur lui-même ou trans où la phosphorylation s effectue entre les récepteurs. La cis-autophosphorylation est probablement due à un changement conformationnel provoqué par la fixation de ligand sur le récepteur. La transautophosphorylation ne nécessite aucun changement conformationnel: le simple effet de proximité engendré par la dimérisation suffit à déclencher la phosphorylation des tyrosines (Hubbard and Till, 2000). A partir de ces structures, Hubbard et al. ont établi un modèle de stimulation de l activité tyrosine kinase par dimérisation des récepteurs (figure 3) (Hubbard et al., 1998). Figure 3: Modèle de stimulation des tyrosines kinases par dimérisation des récepteurs. La boucle activatrice des RTK est relativement mobile et adopte de nombreuses conformations. La conformation majoritaire (rouge) interfère avec la fixation de substrat et donc empêche la fixation d ATP. En vert, la conformation de la boucle activatrice est compatible avec la fixation d ATP. En l absence de ligand, la probabilité de trans-autophosphorylation est faible. La fixation de ligand au domaine extracellulaire augmente la concentration de récepteur et permet ainsi la trans autophosphorylation de la boucle activatrice et déplace l équilibre vers une conformation active permettant la fixation de substrat et d ATP. D après (Hubbard et al., 1998) 18

25 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase II- Les récepteurs de la famille ErbB 1. Introduction Les récepteurs ErbB appartiennent à la famille des RTK de classe I. Les récepteurs ErbB sont exprimés dans la quasi-totalité des tissus non hématopoïétiques. Ils sont impliqués dans différents processus biologiques tels que la prolifération, la différenciation, le contrôle du métabolisme cellulaire, la migration et la survie cellulaire. Des altérations des récepteurs ErbB telles que des mutations oncogéniques ou des surexpressions sont retrouvées dans de nombreux cancers, en particulier des tumeurs solides (cancer du sein, du poumon, etc ). Ces récepteurs suscitent donc un grand intérêt en tant que cibles dans les thérapies anti-cancéreuses (Blume-Jensen and Hunter, 2001; Schlessinger, 2000). Chez le nématode C. elegans, un seul orthologue de l EGFR a été identifié, Let23, comptant un seul ligand (Lin-3). Chez la drosophile un seul orthologue de l EGFR a également été identifié, DER, et celui-ci est activé par quatre ligands différents (Vein, Spitz, Gurken et Argos) (Leahy, 2004). Chez les mammifères, cette famille comprend quatre récepteurs qui sont : ErbB1/HER1 ou EGFR, ErbB2/HER2 (Neu chez le rat), ErbB3/HER3 et ErbB4/HER4. L EGFR a été le premier récepteur de cette famille à avoir été identifié et cloné par Carpenter en 1978, et il est codé par le proto-oncogène ErbB1 (Carpenter et al., 1978). L EGFR est une glycoprotéine de 170 kda composée d une seule chaîne polypeptidique de 1186 acides aminés. L EGFR a été détecté dans le noyau de nombreuses lignées cellulaires où il peut fonctionner comme un facteur de transcription pour l activation de gènes impliqués dans le processus de prolifération. Lin et al. (2001) ont montré qu après la stimulation par l EGF à la surface cellulaire, l EGFR migre dans le noyau où il peut lier une séquence consensus riche en AT et augmenter ainsi la transcription de gènes par une région riche en proline. En utilisant la technique d immunoprécipitation de la chromatine, ils ont montré que l EGFR est associé à la région promotrice du gène codant pour la cycline D1 in vivo, une protéine qui peut jouer un rôle clef dans la mitogenèse (Fickova, 2002; Lin et al., 2001;Wong and Chang, 2001). 2. Structure des récepteurs ErbB Les récepteurs ErbB sont composés de trois domaines (figure 4): - Un domaine extracellulaire de 621 acides aminés contenant le site de liaison pour le ligand. Ce domaine comprend quatre régions (Warren and Landgraf, 2006): 19

26 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase 1. la région I (L1) est importante dans la dimérisation induite par le ligand (Fernandes et al., 2001) 2. les régions II (S1 ou CR1) et IV (S2 ou CR2) sont riches en cystéines (Abe et al., 1998) et sont liés par un pont disulfide intra-chaîne, contenant 22 et 20 résidus cystéine. 3. la région III (L2) Les régions I et III sont impliquées dans la fixation des ligands et les régions II et IV sont impliqués dans la dimérisation induite par la fixation de ligand. Le domaine extracellulaire de ces récepteurs est peu conservé dans cette famille suggérant que ces récepteurs membranaires ont des spécificités différentes dans la liaison du ligand (Olayioye et al., 2000; Yarden and Sliwkowski, 2001). - Un domaine intracellulaire (ou cytoplasmique) de 542 aa contenant un domaine catalytique tyrosine kinase, un domaine juxta-membranaire et une longue queue C-terminale. Le domaine juxtamembranaire est une région régulatrice importante. Cette région est sujette à des phosphorylations par des protéines kinases comme la protéine kinase C (PKC) permettant d atténuer ou de moduler la signalisation par les récepteurs ErbB. La queue C terminale contient d une part cinq sites d autophosphorylation (Tyr 992, Tyr 1068, Tyr 1086, Tyr 1168 et Tyr 1173) qui lient spécifiquement les protéines contenant les domaines SH2 ou PTB, d autre part au moins trois motifs d internalisation, et également des sites pour la transphosphorylation, l activation protéolytique et la dégradation (Fernandes et al., 2001). Le domaine intracellulaire est fortement conservé bien que celui-ci contienne des substitutions d acides aminés inactivant l activité tyrosine kinase. L activité catalytique des récepteurs ErbB réside dans le domaine tyrosine kinase. En effet, l inhibition de celui-ci élimine l activité biologique des récepteurs ErbB. Il existe un motif dans le domaine juxtamembranaire qui peut lier les protéines G hétérodimériques (Wells, 1999). - Un domaine transmembranaire hydrophobe de 24 aa qui connecte les deux autres domaines. 20

27 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase Figure 4: Structure schématique des récepteurs ErbB. Le domaine extracellulaire est composé de quatre régions, homologues deux à deux, appelées L1 et L2 (région I et III) et S1 et S2 (région II et IV) riche en cystéine. S ensuivent le domaine transmembranaire, le domaine juxtamembranaire, le domaine tyrosine kinase et un domaine C-terminal qui porte les sites majeurs de phosphorylation sur tyrosine D après (Burgess et al., 2003). 3. Les ligands des récepteurs ErbB Les récepteurs ErbB sont activés par la liaison d une famille de ligands contenant un domaine EGF-like (Holbro and Hynes, 2004). Douze ligands sont actuellement connus pour ces quatre récepteurs offrant un grand nombre de combinaisons possibles aboutissant ainsi à une grande diversité des voies de signalisation (Gullick, 2001). Les ligands des récepteurs ErbB peuvent être divisés en trois groupes (tableau 1). Le premier groupe comporte 3 ligands spécifiques de l EGFR qui sont l epidermal growth factor (EGF), le transforming growth factor α (TGF-α) et l amphiréguline (AR). Le second groupe comporte la betacelluline (BTC), l heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF) et l épiréguline (EPR), qui montrent une spécificité double en liant l EGFR et ErbB-4. Le troisième groupe est composé des neurégulines (NRGs) et peut être sub-divisé en trois sous-groupes basés sur leur capacité à lier ErbB-3 et ErbB-4 (NRG-1 et NRG-2) ou seulement ErbB-4 (NRG-3 et NRG-4) (Carraway et al., 1997; Harari et al., 1999; Normanno et al., 2006; Zhang et al., 1997). On ne connaît pas de ligand se fixant au domaine extracellulaire du récepteur ErbB2 (Citri et al., 2003). L EGF est parmi les premiers facteurs de croissance à avoir été découvert. L EGF a été initialement isolé des glandes sous-maxillaires des souris (Cohen, 1962). 21

28 Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase EGFR (ErbB1) Erb2 Erb3 ErbB4 EGF NRG1 NRG1 TGFα NRG2 NRG2 AR HB-EGF BTC EPR NRG3 NRG4 HB-EGF BTC EPR Tableau 1. Les récepteurs ErbB et leurs ligands connus. Abréviations : EGF : Epidermal Growth Factor ; HB-EGF : Heparin Binding EGF-like factor; TGF-α : transforming growth factor α; AR: amphiréguline; EPR : épiréguline ; NRG : neurégulines ; BTC : beta-celluline. Tous ces ligands sont de petites protéines solubles (d environ 55 aa) qui dérivent par protéolyse de précurseurs membranaires (Massague and Pandiella, 1993). Le clivage de ces précurseurs membranaires est dû à l intervention de métalloprotéases appartenant aux familles ADAM, en réponse à divers stimuli en particulier à l activation des récepteurs couplés aux protéines G. La structure tridimentionnelle des ligands est caractérisée par l existence d un domaine EGF-like et de trois ponts disulfures intramoléculaires. Le domaine de liaison au récepteur contient d autres motifs structuraux comme des domaines Ig-like, des sites de liaison à l héparine et des sites de glycosylation (Yarden and Sliwkowski, 2001). 4. Dimérisation des récepteurs ErbB Les récepteurs de la famille ErbB sont activés après la fixation de ligand entraînant l homo ou l hétérodimérisation. Il existe des interactions directes entre les récepteurs dimérisés mise en avant par la boucle de dimérisation formée dans le domaine II. La structure de l EGFR, de ErbB3 et de ErbB4 inactifs est caractérisée par les interactions intramoléculaires entre les domaines II et IV qui maintiennent les domaines de fixation du ligand en conformation fermée (ou auto-inhibée). Cependant, dans le cas du récepteur ErbB2 la même caractéristique n est pas observée. En effet, le domaine extracellulaire de ErbB2 adopte une conformation ouverte similaire à celle des autres récepteurs ErbB activés par la fixation du ligand. Dans cette conformation ouverte, les interactions fortes entre les domaines I et III ne permettent aucune liaison du ligand, ce qui peut expliquer l absence d affinité de ErbB2 pour un ligand. ErbB2 se trouve donc dans une conformation 22