Introduction. Biologie cellulaire: cycle cellulaire, synthèse protéique Biologie moléculaire: expression des gènes, régulation

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Anne-Sophie Leroux
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1 LA CULTURE CELLULAIRE

2 Introduction Technique indispensable Progrès énormes depuis 50 ans Recherche Biologie cellulaire: cycle cellulaire, synthèse protéique Biologie moléculaire: expression des gènes, régulation Production Anticorps monoclonaux, protéines recombinantes

3 Le sérum Essentiellement sérum de veau fœtal (SVF) Propriétés Produit biologique fragile Variétés dans ses propriétés et performances Origines diverses Méthodes d élaboration variées

4 Le sérum Origine «Mondialisation»: règles agricoles du pays d importation Indication de l origine sur le certificat d analyse «Audit trail»

5 Le sérum Collection du matériel brut Ponction cardiaque en conditions aseptiques Coagulation et séparation du sérum Rassemblement en lots et congélation Traitement du produit fini Filtration stérilisante Atmosphère contrôlée

6 Le sérum Contrôles en fonction de l utilisation Variabilité des performances en culture Utilisations complexes et variables selon les lignées Tests adaptés à l utilisation: Abaissement du taux d IgG Recherche d anticorps antiviraux (BVD)

7 Le sérum Contrôles physico-chimiques Osmolarité Abaissement du point de congélation ph Profil électrophorétique Concentrations relatives en albumine et globulines: intégrité du sérum

8 Le sérum Contrôles physico-chimiques Teneur en hémoglobine Spectrophotométrie Teneur en oxyhémoglobine Indicateur de qualité Teneur en IgG ELISA

9 Le sérum Contrôles physico-chimiques Protides totaux Augmente avec l âge des animaux Taux d endotoxines LAL cinétique

10 Le sérum Contrôles microbiologiques Nombre statistique de prélèvements sur chaque lot Pré-incubation de 24 h à température ambiante et 37 C Sous-culture en milieu liquide pendant 14 jours Mycoplasmes Méthode des grands volumes Endotoxines

11 Le sérum Contamination virale Absence de virus hémadsorbants et cytopathogènes Rhino trachéite bovine infectieuse: IBR Virus para grippal P13 Virus de la diarrhée bovine: BVD Virus IBR Lyse des cellules et ajout à des cellules WI-38

12 Le sérum Contamination virale Virus P13 Hémadsorption d hématies de cobaye sur cellules de testicules embryonnaires bovines Virus BVD Immunofluorescence indirecte

13 Le sérum Tests de croissance Fibroblastes diploïdes Cellules de poumon embryonnaire humain BCL- D1 ou WI-38 Deux repiquages consécutifs avec 5% de sérum Myélomes Test colorimétrique au MTT

14 Le sérum Tests de croissance! Test de clonage Par rapport à un sérum témoin! Capacité à former des clones: Nombre de puits + Nombre total de puits incubés " 1OO Efficacité de clonage relative RCE Capacité à former des clones dans le sérum à tester Capacité à former des clones dans le sérum de référence

15 Le sérum Tests de croissance! Test d inoculation Capacité d un lot à favoriser la croissance de cellules BHK-21 à faible densité de départ Capacité d étalement PE: Nombre de colonies comptées Nombre de cellules inoculées " 100 Capacité d étalement relative RPE: PE du sérum à tester PE du sérum contrôle

16 Le sérum Avantages et inconvénients Additif complexe L addition de sérum est nécessaire et suffisante à la croissance des cellules in vitro Nature biologique Inconvénient dans certaines applications: Ig, protéines Substituts du sérum

17 Les milieux de culture synthétiques Formulation Composants conservés et pesés en atmosphère contrôlée Protocoles de production informatisés: Numéro de lot et code-barre des composants Quantité de chaque composant Ordre de préparation

18 Les milieux de culture synthétiques Purification de l eau Principal constituant: qualité primordiale Filtration Désionisation Distillation Stockage A 80 C dans des récipients en inox Refroidissement à 20 C au moment de l utilisation

19 Les milieux de culture synthétiques Mélange des constituants Dissous séparément et mélangés dans l ordre spécifié Conformité aux normes du ph et de l osmolarité Taille des lots Varie de 3 à 2000 L Filtration stérilisante et mise en bouteille Filtres de 0,15 µm, sous hottes à flux laminaire

20 Les milieux de culture synthétiques Les milieux en poudre Secteur de production où humidité et température sont contrôlés Granulométrie très fine Passage du broyeur au conditionnement définitif Hygroscopiques: conservation à 4 C avec dessiccateur

21 Les milieux de culture synthétiques Contrôle de qualité Prélèvements statistiques au long de la chaîne Analyses physico-chimiques Osmolarité et ph Tests microbiologiques En milieux liquides pendant 2 semaines Tests de cytotoxicité et de croissance Cellules adhérentes et en suspension

22 Les milieux de culture synthétiques Contrôle de qualité Endotoxines Test chromogénique Composition en aminoacides Par HPLC Additifs Milieux en poudre sans bicarbonate de sodium Glutamine incorporée si la formule l exige

23 Les solutions salines équilibrées PBS, HEPES, solutions d enzymes Fabrication Mêmes techniques et contrôles que les milieux Solutions Enzymes Trypsine: décollement des cellules adhérentes Capacité à détacher les cellules Aminoacides et vitamines Essentiels et non-essentiels

24 Les solutions salines équilibrées Solutions Tampons Fluctuations du ph dues au métabolisme HEPES le plus utilisé

25 Les solutions antibiotiques et antimycosiques Importance Facilité de contamination Rattrapage délicat des cultures contaminées Solutions concentrées Problème des mycoplasmes

26 Facteurs de croissance et d attachement Peuvent être nécessaires pour certaines lignées Exemples Hormones, éléments-traces, vitamines Insuline, transferrine, sélénium: réduction de la concentration en SVF Cytokines, lymphokines Fibronectine, vitronectine Réactifs pour hybridomes HAT

27 Les différentes causes d erreur Technique bien rodée mais complexe Grand nombre de facteurs en jeu Personnel compétent Fragilité de certaines lignées cellulaires Un constituant peut être primordial Environnement idéal pour les contaminants Milieux très riches

28 Certificat d'origine Signé par un vétérinaire agréé Description du produit Numéro de lot de la matière première du fournisseur Numéro de certificat "maison" Certificat vétérinaire Authentifie les certificats d'origine Banque de données des matières premières Numéro de lot du fournisseur Numéro de lot du producteur Taille des lots Enregistrement de la fabrication du lot Numéro du certificat d'origine Numéros de lots de matière première du fournisseur Produit fini Certificat d'analyse Pays d'origine de la matière première Produit fini Résultats des tests de contrôle qualité Attestation du producteur Assure la conformité et l'historique «AUDIT TRAIL» POUR LE SÉRUM

29 Vapeur propre Salle blanche Sérum brut Filtre final Pré filtres Pool stérile Hotte classe 100 STÉRILISATION DU SÉRUM ANIMAL

30 Composants clés Pouvoir tampon Avantages Propriétés nutritives Pouvoir détoxifiant Facteurs de croissance Facteurs d attachement Protéines de transport Rôle protecteur (produits et cellules) Hormones Inconvénients Variabilité de lot à lot Composition non définie Tests d évaluation obligatoires Environnement non défini Origine biologique Contamination possible par virus, mycoplasmes, endotoxines Teneur élevée en protéines Interférence avec la purification UTILISATION DU SÉRUM ANIMAL

31 Antibiotiques Concentration recommandée Spectre Stabilité à 37 C Tylosine µg/ml Mycoplasmes et bactéries gram+ 3 jours Amphotéricine B Fungizone 0,25-2,5 µg/ml Levures et champignons 3 jours Gentamycine sulfate 5-50 µg/ml Bactéries gram+ et gram-, mycoplasmes 5 jours Kanamycine sulfate 100 µg/ml Bactéries gram+ et gram-, mycoplasmes 5 jours Néomycine sulfate 50 µg/ml Bactéries gram+ et gram-, mycoplasmes 5 jours Nystatine 100 U/ml Levures et champignons 3 jours Pénicilline G U/ml Bactéries gram+ 3 jours Polymyxine B sulfate 100 U/ml Bactéries gram+ 5 jours Streptomycine sulfate µg/ml Bactéries gram+ et gram- 3 jours SOLUTIONS ANTIBIOTIQUES

32 Facteurs de croissance Acide ascorbique Hydrocortisone Insuline Poly-D-Lysine Progestérone Putrescine T-3 (L-triiodothyronine) Transferrine Eléments-traces Types cellulaires Tous Cellules épithéliales, gliales, hépatocytes Tous Fibroblastes, cellules amniotiques Cellules épithéliales Neuroblastomes, cellules épithéliales Fibroblastes, cellules épithéliales Tous Tous Concentrations suggérées µg/ml 1-10 nm 1-10 µg/ml «Coater» avec 0,1 mg/ml 1-10 nm 0,1-1 µg/ml nm 1-20 µg/ml Variables COMPLÉMENTS

33 Problème Virage rapide du ph Présence de précipités Les cellules n adhèrent pas Croissance plus lente Mort de la culture Agrégation des cellules en suspension Culture primaire contaminée Origine possible Atmosphère en CO 2 incorrecte Capacité tampon du bicarbonate insuffisante Contamination Résidus du détergent Milieu congelé Cellules trop trypsinisées Mycoplasmes Absence de facteurs d attachement Changement de milieu ou de sérum Diminution de facteurs essentiels Début de contamination Mauvais stockage des réactifs Inoculum trop faible Vieillissement de la culture Manque de CO 2 Fluctuations de la température Cellules abîmées lors de la congélation ou décongélation Métabolites toxiques Présence de calcium et magnésium Mycoplasmes Tissu primaire contaminé Suggestions Vérifier les bouchons Vérifier l incubateur Ajouter de l HEPES Décontamination Ne laver la vaisselle qu à l eau distillée Chauffer le milieu à 37 C Trypsiniser moins longtemps Jeter la culture Utiliser le bon milieu Tester en parallèle Ajouter de la glutamine Décontamination Sérum: -20 C, milieux: 4-8 C Augmenter l inoculum Décongeler un autre lot Contrôler l incubateur Utiliser un autre lot Changer le milieu Laver avec une solution sans calcium ni magnésium, remettre en suspension Jeter la culture Lavage du tissu avec une solution saline enrichie en antibiotiques

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