PLURABBIT Transcriptome analysis and functional characterization of rabbit pluripotent stem cells for the production of novel animal models

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1 PLURABBIT Transcriptome analysis and functional characterization of rabbit pluripotent stem cells for the production of novel animal models Colloque Génomique animale et microbienne - 20 et 21 mars 2012 à la Rochelle

2 The naïve and primed states of pluripotency in the mouse Blastocyst early epiblast implantation 6.5 day egg-cylinder late epiblast ES Naïve state - LIF dependent - BMP4 dependent - X a X a in female lines - resistant to single cell disscociation - make chimaeras Experimentally induced Oct4 Nanog Sox2 EpiSC Primed state - FGF2 dependent - TGFß-dependent - X a X i in female lines - intolerance to single cell disscociation - DO NOT MAKE CHIMAERAS Stella, Blimp1, Klf4 Fgf5, T/Bra

3 The naïve and primed states of pluripotency in the mouse Somatic cell reprogramming ips Naïve state - LIF dependent - BMP4 dependent - X a X a in female lines - resistant to single cell disscociation - make chimaeras Oct4 Nanog, Sox2 Rex1, Blimp1, KlF4

4 The primed state of pluripotency in primates Blastocyst early epiblast «ES» Primed state - FGF2 dependent - TGFß-dependent - X a X i in female lines - intolerance to single cell disscociation - CHIMAERAS??? Oct4 Nanog Sox2 Fgf5 T/Bra

5 The primed state of pluripotency in primates Somatic cell reprogramming ips Primed state - FGF2 dependent - TGFß-dependent - X a X i in female lines - intolerance to single cell disscociation - CHIMAERAS??? Oct4 Nanog Sox2 Fgf5 T/Bra

6 «PLURABBIT» QUESTIONS 1.Est-ce que la pluripotence naïve existe spontanément dans les cellules ES et ips de lapin? 2.Quelles sont les bases moléculaires de la pluripotence naïve chez le lapin? 3. Les cellules pluripotente (naïves?) de lapin peuvent-elles être utilisées pour créer des animaux chimères (colonisation embryonnaire), et des animaux clonés (transfert nucléaire)? CONSORTIUM Pierre Savatier U846, Institut Cellule Souche et Cerveau Bron, France Véronique Duranthon UMR 1198, Biologie du Développement et de la Reproduction Jouy-en-Josas, France Andras Dinnyes Szent Istvan University Gödöllö, Hungary Zsuzsanna Bösze Agricultural Biotechnology Center Gödöllö, Hungary

7 Generation of ES and ips cells in rabbit ES cells ips cells X Wild type New Zealand Rabbit Heterozygous GFP Transgenic Rabbit Wild type New Zealand Rabbit Embryos Ear skin fibroblasts Reprogramming Oct4 Sox2 Klf4 c-myc 4 x bfgf-dependent ESC lines 3 x bfgf-dependent ipsc lines Colloque Génomique animale et microbienne - 20 et 21 mars 2012 à la Rochelle

8 Characterization of rabbit ES and ips cells ES cells ips cells ES 4 P13 ES8 P17 ES18 P15 ES19 P21 LIF 1 P24 LIF 2 P B19 P37 B24 P33 B29 P31 Oct4 Nanog Oct4 Nanog Teratoma formation Oil Red O Desmin Oil Red O Desmin GFAP HPS GFAP Glucagon

9 Contrasting features of rabbit ES and ips cells Murine versus primate Naïve versus primed Distal enhancer of Oct4 (activity) Somatic versus pluripotent Rabbit ipsc cells self-renew in a state closer to naive pluripotency than ES cells (Osteil et al., submitted)

10 «PLURABBIT» QUESTIONS 1.Est-ce que la pluripotence naïve existe spontanément dans les cellules ES et ips de lapin? 2.Quelles sont les bases moléculaires de la pluripotence naïve chez le lapin? 3. Les cellules pluripotente (naïves?) de lapin peuvent-elles être utilisées pour créer des animaux chimères (colonisation embryonnaire), et des animaux clonés (transfert nucléaire)? CONSORTIUM Pierre Savatier U846, Institut Cellule Souche et Cerveau Bron, France Véronique Duranthon UMR 1198, Biologie du Développement et de la Reproduction Jouy-en-Josas, France Andras Dinnyes Szent Istvan University Gödöllö, Hungary Zsuzsanna Bösze Agricultural Biotechnology Center Gödöllö, Hungary

11 Generation of a dedicated microarray to analyse pluripotency in the rabbit Customized Agilent s array 27,761 : Agilent s probes displaying a single match on the rabbit genome (according to SIGENAE analysis) x2 : Expressed Sequence Tags from the early rabbit embryo *Oocyte *Embryonic Genome Activation *Blastocyst *Embryonic disk at gastrulation 400 x2 : Candidate genes 1319 negative control probes Gonad differentiation Embryo metabolism X-chromosome inactivation Pluripotence Epigénétique 7,648 additionnal repetitions of EST and candidate genes probes to complete the microarray 62,976 probes corresponding to 13,000 genes

12 Mature and putative pre-mirna structure of rabbit mir-290 and mir-302 clusters CHR-UN0226 (REVERSE STRAND) 294-3P P 290-5P 520e I-5P 512-3P 512-II-5-P 512-3P CHR-15 (POSITIVE STRAND) 302B 302C 302A 302D 367 % identity to mouse mirna: % % identity to mouse mirna: % % identitity to human mirna: % Ocu-

13 «PLURABBIT» QUESTIONS 1.Est-ce que la pluripotence naïve existe spontanément dans les cellules ES et ips de lapin? 2.Quelles sont les bases moléculaires de la pluripotence naïve chez le lapin? 3. Les cellules pluripotente (naïves?) de lapin peuvent-elles être utilisées pour créer des animaux chimères (colonisation embryonnaire), et des animaux clonés (transfert nucléaire)? CONSORTIUM Pierre Savatier U846, Institut Cellule Souche et Cerveau Bron, France Véronique Duranthon UMR 1198, Biologie du Développement et de la Reproduction Jouy-en-Josas, France Andras Dinnyes Szent Istvan University Gödöllö, Hungary Zsuzsanna Bösze Agricultural Biotechnology Center Gödöllö, Hungary

14 Production of chimaeric and cloned pre-implantation embryo with rabbit ips cells GFP lentivector 8-cell stage SSEA-1 ipsc SSEA1 GFP GFP SSEA-1 overlay In vitro development Blastocyst Ocu- Embryos injected : 65 Blastocysts with GFP + cells : 2

15 Production of chimaeric and cloned pre-implantation embryo with rabbit ips cells GFP lentivector SSEA-1 ipsc SSEA1 GFP In vitro development Nbr of SCNT: 138 Nbr of cleaved embryos: 65 Nbr of blastocysts : 5 Blastocyst Ocu-

16 PERSPECTIVES Identifier les marqueurs de la pluripotence naïve grâce aux analyses de transcriptome et de mirnome. 2.Identifier des voies de signalisation suceptibles de contrôler l autorenouvellement des cellules souches pluripotentes de lapin. 3. Produire des chimères germinales à partir de cellules ips 4. Produire des animaux clonés à partir de cellules ips Colloque Génomique animale et microbienne - 20 et 21 mars 2012 à la Rochelle

17 Pierre Savatier U846, Institut Cellule Souche et Cerveau Bron, France Véronique Duranthon UMR 1198, Biologie du Développement et de la Reproduction Jouy-en-Josas, France Andras Dinnyes Szent Istvan University Gödöllö, Hungary Zsuzsanna Bösze Agricultural Biotechnology Center Gödöllö, Hungary Marielle Afanassieff Murielle Godet Yann Tapponnier Pierre Osteil Suzy Markossian Thierry Joly Nathalie Daniel Barbara Panneau Alice Jouneau Luc Jouneau Catherine Archilla Juliana Kobolak Istvan Bock Zsuzsanna Tancos Elen Gocza Szilard Bodo Pouneh Maraghehechi Colloque Génomique animale et microbienne - 20 et 21 mars 2012 à la Rochelle