Approches harmonisées pour la validation des méthodes de détection des OGMs par le LNR selon les dernières lignes directrices

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1 Approches harmonisées pour la validation des méthodes de détection des OGMs par le LNR selon les dernières lignes directrices de l UE N. Papazova (nina.papazova@wiv-isp.be), N. Roosens Plateforme Biotechnologie et Biologie Moléculaire Institut Scientifique de santé Publique, rue J. Wytsman14, 1050 Bruxelles, Belgique I. Taverniers, M. De Loose Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO), Eenheid Technologie & Voeding (T&V), Burg. Van Gansberghelaan 115, 9820 Merelbeke, Belgique Implémentation des méthodes validées par EU-RL GMFF dans un laboratoire de routine travaillant sous accréditation ISO17025: le contexte UE La législation UE concernant les OGMs dans l alimentation humaine et animale exige que les méthodes spécifiques à l évènement de transformation (event-specific) pour la détection des OGMs soient utilisées (1). Actuellement la PCR en temps réel ou qpcr est la technique la plus utilisée pour la détection des OGMs en raison de sa grande sensibilité et de la possibilité de quantifier la cible. Les méthodes de PCR en temps réel event specific pour la quantification des OGMs sont développées par les compagnies biotech qui soumettent ces méthodes en demandant l autorisation pour un nouvel OGM. Les méthodes sont, en premier, évaluées et ensuite validées par un test inter-laboratoire organisé par le Laboratoire Européen de Référence pour les OGMs dans l alimentation humaine et animale (EURL-GMFF). Suite à cette validation, les méthodes deviennent des méthodes officielles pour les laboratoires nationaux de contrôle. Ces méthodes sont inclues dans le Compendium des méthodes de références pour les analyses OGM (2) et sont disponibles sur le site web EU-RL ( StatusOfDossiers.aspx). Les méthodes EU-RL sont des méthodes pour la quantification des évènements de transformation OGM. Cependant, les analyses OGM comprennent plusieurs étapes : le criblage utilisant des méthodes spécifiques d éléments (par ex. p35s, tnos, CP4-EPSPS, etc.), l identification de l évènement de transformation en utilisant les méthodes «event-specific» et la quantification utilisant également les méthodes «event-specific». Lors de l étape d identification, la méthode event-specific est utilisée comme une méthode qualitative donnant comme résultat la présence ou l absence de l évènement de transformation et, dans le cas de sa présence, s il est quantifiable ou pas. Actuellement, 51 méthodes aussi bien pour les OGMs autorisés en UE que pour les évènements de transformation en demande d autorisation sont publiées ( Les Laboratoires Nationaux de Référence de chaque état membre de l UE doivent implémenter les méthodes officielles pour les OGMs autorisés sous la réglementation de la Commission No. 1829/2003 (1) et la réglementation de la Commission No. 619/2011 (Low Level Presence ou LLP), récemment adoptée (3). Vingt-neuf évènements simples de transformation sont actuellement autorisés pour l alimentation humaine et animale ou la culture; 18 évène- 13

2 ments de transformation sont inclus dans la liste des LLPs. Cependant, ces chiffres changent rapidement et ont augmenté significativement ces deux dernières années. En , le nombre de nouvelles méthodes à implémenter s est accru rapidement. Depuis 2011, les laboratoires ont eu besoin d implémenter 4-5 méthodes par an, alors que pour 2011 et 2012, après l implémentation de la réglementation LLP, ce chiffre s est élevé à 13. Les LNR sont face à un réel challenge pour implémenter le nombre croissant de méthodes officielles au niveau des laboratoires d une façon harmonisée. Les questions Comment implémenter une méthode event-specific dans le laboratoire à des fins d identification (qualitative) et de quantification (quantitative)?, Quels critères d acceptation sont à tester?, Quels échantillons et combien de tests?, Comment organiser le set-up expérimental dans le but d obtenir des résultats représentatifs? forment de réels challenges pour les laboratoires analytiques de contrôle comme le Laboratoire National belge de Référence (LNR). Aucune ligne directrice spécifique pour la vérification des méthodes de détection des OGMs pour les laboratoires n existait avant Comme conséquence, chaque laboratoire ENGL (the European Network of GMO Laboratories) utilisait ses propres approches basées sur des documents normatifs existants ou des pratiques «maison». La plupart du temps, le document Method Performance Requirements (4) était utilisé comme base pour la validation des méthodes pour le laboratoire. Plusieurs articles sur ce sujet ont été publiés également (5, 6, 7), mais aucune ligne directrice harmonisée au niveau UE n était disponible. Les lignes directrices harmonisées de l ENGL pour la vérification des méthodes En 2009, l ENGL a mis en place un groupe de travail chargé d étudier la vérification des méthodes. Ceci a aboutit à la publication d un document concernant l implémentation dans un laboratoire / la vérification des méthodes «event-specific» validées par un test inter-laboratoire. Le document Vérification des méthodes analytiques pour les tests OGM lors de l implémentation de méthodes validées par un test interlaboratoire (8) harmonise des termes et définitions et, plus important, fourni des conseils sur la manière de vérifier une méthode validée dans un laboratoire de routine. Le document de l ENGL «Method Verification» (8) harmonise plusieurs items: La terminologie : Les définitions harmonisées sont fournies pour l échantillon de laboratoire, l échantillon analytique, la portion test, les réplicats ADN, les réplicats PCR. Celles-ci peuvent être trouvées dans le glossaire. Les définitions et paramètres d acceptation sont également fournis. La liste complète des définitions peut être trouvée dans le document «Method verification»(8). La procédure de vérification des paramètres : Le document décrit des procédures générales pour estimer les différents paramètres d acceptation, fournissant le nombre minimum d analyses qui doivent être inclues (par ex. : nombre minimum de valeurs pour les courbes de calibration, pour déterminer le R 2, l efficacité de la PCR, la gamme dynamique, le nombre minimum de résultats PCR pour déterminer l exactitude et la précision). Dans cette partie, on peut également retrouver une information importante : la procédure pour déterminer la LOD (limite de détection) et la LOQ (limite de quantification) absolues, celles-ci étant souvent utilisées comme valeurs seuils dans l étape d identification des analyses de routine OGM. Avant la publication de ce document de guidance, il n y avait pas de façon uniforme pour déterminer ces paramètres. Il apporte une information détaillée sur l estimation de la qualité et de la pureté de l ADN. 14

3 Pour chaque paramètre les critères d acceptations qui sont en accord avec le document «Method Performance Requirements» sont fournis également. Des exemples de «set-ups» expérimentaux sont donnés afin d évaluer les paramètres. Les exemples fournissent plusieurs alternatives de configuration permettant de varier les courbes de calibration, le nombre de points de chacune, le nombre de réplicats PCR, d échantillons tests, de niveaux de concentration en OGM, etc. De cette façon, le laboratoire peut créer son propre set-up qui correspond aux exigences minimales définies par la procédure pour déterminer un paramètre spécifique. La figure 1 présente un exemple de setting expérimental pour la vérification d une méthode quantitative. Fig. 1. Exemple de workflow pour la vérification d une méthode de quantification d OGM. Au minimum, deux niveaux d OGM sont analysés un à 0.1% et un autre autour de la limite d étiquetage de 0.9%. Un troisième niveau d OGM autour de la limite supérieure de la gamme dynamique est optionnel. A partir de chaque OGM de niveau 2, des réplicats d extraction d ADN sont préparés. A partir de chaque réplicat d ADN, deux réplicats PCR sont réalisés. Pour estimer le R 2, l efficacité PCR, la gamme dynamique, quatre courbes de calibration sont préparées. Chacune d elle contient au minimum 5 points de calibration minimum. Chaque point de calibration est réalisé en duplicat. Pour estimer l exactitude et la précision, 4 réactions PCR indépendantes sont réalisées. Ceci produit 32 résultats PCR au total. Les critères d acceptation pour la vérification d une méthode mentionnés dans le document «Vérification de Méthodes (8)» sont consignés dans le document «Exigences pour les Performances de Méthodes (4)». 15

4 Implémentation des lignes directrices de l ENGL par le LNR belge de détection des OGMs L implémentation des lignes directrices des vérifications de méthodes dans les laboratoires de contrôle est complexe car les laboratoires doivent adapter leurs procédures de validation. De plus, les exigences pour les OGM autorisés et ceux tombant sous la législation LLP diffèrent. Pour les premiers, un étiquetage à la valeur seuil de 0.9% est appliqué, alors que pour les seconds un MRPL («Minimum Required Performance Limit») de 0.1% est appliqué. Ceci exige que le laboratoire soit apte à quantifier cet évènement de transformation à 0.1%. C est pourquoi les configurations expérimentales qui conviennent doivent être appliquées en vue de valider toutes les méthodes avec un seul set-up expérimental suivant les lignes directrices. Le 4 octobre 2012, le LNR-OGM belge a organisé, en collaboration avec l AFSCA, un workshop intitulé Method validation and MU calculation for GMO quantification. Celui-ci avait pour but de présenter l implémentation des nouvelles lignes directrices par le LNR et les problèmes rencontrés par les laboratoires lors de l expérimentation de ce processus. Les conclusions du workshop furent que le LNR est très avancé dans l implémentation des lignes directrices de l ENGL pour la vérification des méthodes. Tous les paramètres obligatoires sont testés comme recommandé par le document Method Verification et les critères pour chaque paramètre sont adoptés. La détermination de la LOD abs et LOQ abs est réalisée d une façon similaire. La vérification des méthodes pour la quantification suit différentes configurations tout en restant dans le cadre des lignes directrices recommandées. Les configurations permettent la génération d un nombre suffisant de résultats PCR pour, à la fois, les courbes de calibration et les échantillons à tester afin de calculer les paramètres obligatoires R 2, l efficacité PCR, l exactitude et la précision. Prospection L harmonisation dans la vérification des méthodes, à réaliser en fonction de l implémentation des méthodes officielles «event specific» de l EU-RL GMFF pour tous les évènements de transformation autorisés en UE et les LLPs sur base routinière dans les laboratoires de contrôle, assure que des critères uniformes sont utilisés au niveau de l UE dans les laboratoires. Cependant, durant la vérification des méthodes, les laboratoires peuvent rencontrer des problèmes spécifiques ou des questions. Par exemple : quels échantillons tests utiliser, que conclure au sujet des méthodes qui ne rencontrent pas les critères d acceptation, quels critères adopter pour la LOD et la LOQ absolues, quand et comment tester la robustesse (par exemple un changement dans le volume de réaction, utilisation d appareils PCR différents,...). De plus, le document Method Performance Requirements est actuellement en cours de révision et une nouvelle version plus élaborée sera bientôt publiée. Les lignes directrices de l ENGL seront encore améliorées en vue de répondre à des questions spécifiques. L adoption de lignes directrices harmonisées par le LNR-OGM assure l utilisation de méthodes fiables permettant une grande qualité des résultats analytiques. Le LNR-OGM améliore continuellement les procédures de vérifications des méthodes au niveau du laboratoire et participera activement à l amélioration des lignes directrices de l ENGL. Cependant, le challenge d implémenter toutes les méthodes officielles d une façon efficace en temps, coût et travail demeure. 16

5 Références: 1. Regulation (EC) No 1829/2003 of the European Parliament and the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed. Official Journal of the European Union, L 268, pp European Union reference laboratory for GM food and feed (EURL-GMFF), European Network of GMO Laboratories (ENGL), Compendium of Reference Methods for GMO analysis, JRC reference reports, EUR-Scientifical and Technical Research series, EUR EN, 2010, Available at jrc_reference_report_2010_11_gmo_analysis_compendium.pdf 3. Commission Regulation (EU) No 619/2011 of 24 June 2011 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of feed as regards presence of genetically modified material for which an authorisation procedure is pending or the authorisation of which has expired 4. European Network of GMO Laboratories (ENGL), Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical methods of GMO Testing, 2008, 5. Žel J., Mazzara M., Savini C., Cordeil S., Camloh M., Štebih D., Cankar K., Gruden K., Morisset D.and Van den Eede G.. Method Validation and Quality Management in the Flexible Scope of Accreditation: An Example of Laboratories Testing for Genetically Modified Organisms, Food Anal. Methods, 1 (2): 61-72, Scholtens I.M.J., Kok E.J., Hougs L., Molenaar B., Thissen J.T.N.M., van der Voet H. Increased Efficacy for Inhouse Validation of Real-time PCR GMO Detection Methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry 396 (6): , Ciabatti I., Froiio A., Gatto F., Amaddeo D., Marchesi U. In-house validation and quality control of real-time PCR methods for GMO detection: a practical approach. Dev. Biol. 126: 79-86; discussion 324, Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. EUR EN Glossaire: Vérification d une méthode La vérification est la confirmation, au travers de l accumulation de preuves objectives, que les exigences spécifiques ont bien été satisfaites (ISO 9000:2000 section 3.8.4). La vérification qu un laboratoire puisse faire fonctionner de façon adéquate une méthode standardisée exige que ce laboratoire fournisse des preuves objectives que les paramètres de performance spécifiés dans les méthodes testées ont bien été rencontrés pour les matrices sur lesquelles la méthode a été utilisée. Le plus souvent, les exigences les plus critiques sont l exactitude (généralement exprimée en termes de biais) et la précision (généralement acceptée comme répétabilité et reproductibilité) qui sont le reflet de l incertitude de mesure. Les preuves objectives sont l exactitude et la précision obtenues à partir de donnée réelles de laboratoire. Réplicat d extraction d ADN ADN extrait de différentes portions test à partir d un même échantillon. Réplicats PCR PCR réalisé sur le même réplicat d extraction d ADN analysé dans différents tubes de réaction. Résultat test Un résultat test est la valeur Ct ou le nombre de copies provenant d un réplicat PCR. Minimum Required Performance Limit (MRPL) La plus faible quantité ou concentration du composé dans un échantillon qui doit être détectée de manière fiable et confirmée par des laboratoires officiels. nina.papazova@wiv-isp.be 17

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