Ministère de l Agriculture et de la Pêche Direction Générale de l Alimentation Sous Direction de la Qualité et de la Protection des Végétaux LNPV

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1 Ministère de l Agriculture et de la Pêche Direction Générale de l Alimentation Sous Direction de la Qualité et de la Protection des Végétaux LNPV Végétal : pin (Pinus spp.), Laboratoire National de la Protection des Végétaux détection de Mycosphaerella dearnessii ou M. pini sur aiguilles par mise en chambre humide et observation microscopique de l'anamorphe (Lecanosticta acicola ou Dothistroma septospora) Réf.: Méthode MF./97/06 version b Laboratoire de Référence : LNPV Unité de Mycologie Agricole et Forestière Domaine de Pixérécourt BP MALZEVILLE Novembre 2004 MF./97/06 version b 1/10

2 VEGETAL : PIN (PINUS SPP.) DETECTION DE Mycosphaerella dearnessii OU M. pini SUR AIGUILLES PAR MISE EN CHAMBRE HUMIDE ET OBSERVATION MICROSCOPIQUE DE L ANAMORPHE SOMMAIRE Avertissement et précautions de sécurité Introduction Objet Domaine d application Définitions Principe Réactifs et produits Matériel et appareillage Echantillonnage et échantillons Echantillonnage et arrivée au laboratoire Conservation de l échantillon pour analyse Mode opératoire Prise d analyse Mise en chambre humide Observation de l échantillon Observation microscopique et identification Expression des résultats Références bibliographiques Annexes... 7 MF./97/06 version b 2/10

3 VEGETAL : PIN (PINUS SPP.) DETECTION DE Mycosphaerella dearnessii OU M. pini SUR AIGUILLES PAR MISE EN CHAMBRE HUMIDE ET OBSERVATION MICROSCOPIQUE DE L ANAMORPHE Avertissements et précautions de sécurité Décontamination de tout le matériel jetable utilisé ainsi que des restes de l échantillon après analyse, par stérilisation en chaleur humide pendant 20 minutes à une température minimale de 122 C ou au moyen de tout matériel permettant d obtenir le même résultat. Désinfection du matériel recyclable (notamment verrerie) soit par stérilisation dans les conditions précédentes (si le matériel le supporte) soit par trempage pendant au moins 1 heure dans une solution d hypochlorite de sodium (NaOCl) ou d eau de Javel, diluée et titrée à au moins 2 Cl. 0. Introduction Mycosphaerella dearnessii M.E. Barr (synonyme Scirrhia acicola (Dearness) Siggers) et Mycosphaerella pini E. Rostrup (synonyme Scirrhia pini Funk & Parker) sont deux agents de maladies foliaires sur pins : Mycosphaerella dearnessii est la forme sexuée de Lecanosticata acicola (Thüm) H. Sydow, agent de la maladie des taches brunes des aiguilles de pins. Mycosphaerella pini est la forme sexuée de Dothistroma septospora (Dorog.) Morelet, agent de la maladie des bandes rouges des aiguilles de pins. Les dommages (symptômes) se traduisent souvent par un dessèchement de la base de l arbre et les dégâts sont surtout importants dans les pépinières et les jeunes plantations. Des attaques importantes et répétées peuvent aboutir à la mort des arbres. 1. Objet Ces deux champignons sont listés dans l annexe II de la Directive européenne 2000/29/CE (organismes nuisibles dont l introduction et la dissémination doivent être interdites dans tous les états membres s ils se trouvent sur certains végétaux ou produits végétaux). Mycosphaerella dearnessii, considéré comme absent de l Union Européenne est inscrit sur la liste A1 de cette même annexe (organismes nuisibles inexistants dans la Communauté et importants pour toute la Communauté) ; alors que M. pini, présent dans l Union Européenne, se trouve inscrit sur la liste IIA2 (organismes nuisibles présent dans la Communauté et importants pour toute la Communauté). Cette méthode s utilise donc pour les analyses officielles intervenant dans le cadre des contrôles phytosanitaires réglementaires réalisés pour la surveillance du territoire ou à l import. MF./97/06 version b 3/10

4 La détention et la manipulation de Mycosphaerella dearnessii ou de M. pini lors de ces analyses, sont effectuées dans des conditions de précautions appropriées conformément à la directive 95/44/CE (annexe I). 2. Domaine d application Le développement de Mycosphaerella dearnessii et M. pini étant strictement inféodé aux aiguilles de Pinus spp., leur détection s effectuera uniquement sur ces organes. 3. Définitions Anamorphe Acervule : forme imparfaite (asexuée) d un champignon présentant une forme sexuée (en général un Ascomycète). : type de fructification incluse dans le substrat, où se forment des conidies sous une couche de tissus de l hôte. Conidies : spores asexuées des champignons imparfaits. 4. Principe Détection et identification de M. dearnessii ou de M. pini par observation microscopique des conidies de l anamorphe, respectivement Lecanosticta acicola et Dothistroma septospora, après passage en chambre humide pour favoriser la sporulation. 5. Réactifs et produits 5.1. Eau distillée ou osmosée Éthanol 70 [Produit inflammable] Eau de Javel [Irritant pour les yeux et la peau] ou solution d'hypochlorite de sodium (NaOCl), diluée et titrée à au moins 2 Cl [Corrosif Au contact d un acide dégage un gaz toxique provoque des brûlures] Acide lactique [Irritant pour la peau - Risques de lésions oculaires graves] ou solution de bleu de méthyle diluée à 0,5% dans de l acide lactique. 6. Matériel et appareillage 6.1. Réfrigérateur ou chambre froide permettant de garantir une conservation des échantillons en froid positif (T = 5 C ± 3 C) Loupe binoculaire à différents grossissements (minimum 10 X) Microscope photonique à différents grossissements (de 40 à environ 800 X) et équipé d un micromètre oculaire ou de tout autre matériel permettant la réalisation de mesures (exemple : système vidéo d acquisition et de traitement d image) Boîtes de Petri en verre ou en plastique selon la taille de l échantillon Papier filtre ou papier absorbant Pulvérisateur manuel (eau distillée ou osmosée). MF./97/06 version b 4/10

5 6.7. Aiguilles montées, pinces, brûleur à alcool Lames et lamelles Enceinte thermostatique pourvue d un éclairage de type lumière blanche, pouvant assurer une température de 22 C ± 3 C (photopériode de 12 heures facultative) Appareil pour la stérilisation en pression de vapeur (autoclave permettant d'obtenir une température minimale de 122 C pendant 20 minutes). Tout autre matériel permettant d'obtenir les mêmes résultats est admis. 7. Échantillonnage et échantillons 7.1. Échantillonnage et arrivée au laboratoire Seules les aiguilles étant atteintes, les prélèvements seront constitués d aiguilles ou de rameaux avec les pousses de l année et les aiguilles de l année précédente. Les aiguilles atteintes présentent souvent un apex desséché, une partie médiane avec des taches ou des nécroses et une base restant verte. M. dearnessii Les taches brunes présentes sur les aiguilles, sont souvent délimitées par une bordure plus foncée et un halo jaunâtre. Au niveau ou à proximité de ces taches, des fructifications se développent (cf. annexe 1). M. pini Les bandes rougeâtres se développent au niveau des zones desséchées ou brunes de l aiguille. Les fructifications apparaissent au niveau de ces zones brunes et rougeâtres (cf. annexe 2). N.B. : les bandes rougeâtres ne sont pas toujours visibles et les aiguilles peuvent présenter, à la place, un brunissement généralisé pouvant être confondu avec des symptômes causés par M. dearnessii ou d autres agents pathogènes des aiguilles. Dans la mesure du possible, les prélèvements seront constitués d aiguilles avec des symptômes caractéristiques (dessèchement apical et présence de taches, fructifications apparentes, ) Dans les deux cas, des aiguilles avec des symptômes douteux pourront également faire l objet d un prélèvement Conservation de l échantillon pour analyse Si l échantillon ne peut pas être traité dès son arrivée au laboratoire, l analyse peut être reportée. Pour cela, l échantillon doit être placé au réfrigérateur ou en chambre froide (cf. 6.1) pendant une durée ne dépassant pas 7 jours. 8. Mode opératoire 8.1. Prise d analyse L analyse s effectuera sur tout ou partie des aiguilles ou rameaux reçus. MF./97/06 version b 5/10

6 8.2. Mise en chambre humide Placées dans un environnement humide, les fructifications asexuées (acervules) matures produisent des masses de spores mucilagineuses : olivâtres pour Mycosphaerella dearnessii, incolores ou de couleur pâle pour Mycosphaerella pini. La sporulation peut ainsi être favorisée en plaçant des aiguilles avec des acervules matures en chambre humide. Pour cela, sélectionner tout ou partie des rameaux ou aiguilles reçus en choisissant, si possible, celles présentant des symptômes caractéristiques (cf. annexes 1 et 2). Les disposer sur du papier filtre ou papier absorbant dans une boîte de Petri en verre ou dans une boîte en plastique, selon la taille de l échantillon. Après humidification avec de l eau distillée ou osmosée, disposer cette chambre humide dans une enceinte thermostatique pouvant assurer une température de 22 C ± 3 C et pourvue d un éclairage de type lumière blanche avec, éventuellement, une photopériode de 12 heures Observation de l échantillon (loupe binoculaire) a) Après environ 1-3 jours d incubation, observer les échantillons en chambre humide à la loupe binoculaire. b) Rechercher la présence de fructifications noires, sous-épidermiques, +/- groupées (surtout pour M. dearnessii), au niveau ou à proximité des taches brunes pour M. dearnessii (cf. annexe 1), au sein des bandes rougeâtres se trouvant au niveau des zones brunes et desséchées de l aiguille pour M. pini (cf. annexe 2). c) Prélever ces fructifications en vue d une observation microscopique ( 8.4.). Pour cela, utiliser une aiguille montée, préalablement flambée. d) Stériliser l outil de prélèvement après chaque utilisation en passant la pointe à la flamme. e) Faire le montage entre lame et lamelle dans de l acide lactique (éventuellement additionné de bleu de méthyle pour un meilleur contraste). Par prudence, des fructifications «suspectes» ou peu caractéristiques sont tout de même systématiquement prélevées et observées au microscope. f) Si aucune fructification ou sporée ne s est développée, replacer la chambre humide dans les conditions d incubation et faire de nouvelles observations régulièrement. Passé un délai d une quinzaine de jours, si aucune évolution n est constatée, arrêter l analyse et détruire le matériel végétal par autoclavage Observation microscopique et identification (cf. annexe 3) L identification de Mycosphaerella dearnessii ou de M. pini est basée sur l observation microscopique des conidies de l anamorphe correspondant et dont les caractères doivent correspondre à ceux décrits dans l annexe 3. Les lames préparées précédemment ( 8.3.) sont ainsi observées au microscope photonique. Faire des observations globales à différents grossissements puis une dizaine de mesures à un grossissement minimal de 400 X. MF./97/06 version b 6/10

7 Pour Mycosphaerella dearnessii, noter la présence de conidies légèrement brunes, filiformes et souvent arquées, échinulées, pluricellulaires (1-5 cloisons), de taille variable : 19,7-43,1 x 2,6-4,4 µm en moyenne. Pour Mycosphaerella pini, noter la présence de conidies hyalines, le plus souvent filiformes, pluricellulaires (en général 3 cloisons), de taille variable : x 1,8-3 µm en moyenne. 9. Expression des résultats Exprimer le résultat dans un tableau ou par une phrase du type : lorsque le résultat de l'analyse est négatif : - "Absence de Mycosphaerella dearnessii dans l'échantillon analysé par mise en chambre humide." - "Absence de Mycosphaerella pini dans l'échantillon analysé par mise en chambre humide." lorsque le résultat de l'analyse est positif : - " Mycosphaerella dearnessii détecté dans l'échantillon analysé par mise en chambre humide." - " Mycosphaerella pini détecté dans l'échantillon analysé par mise en chambre humide." Le résultat, de même que tout cas douteux, peut être confirmé par l envoi, au laboratoire de Référence, de l échantillon concerné éventuellement accompagné de lames fixées et d'une fiche de renseignements dont l'imprimé est à demander au laboratoire. 10. Références bibliographiques H.C. EVANS, The Genus Mycosphaerella and its Anamorphs Cercoseptoria, Dothistroma and Lecanosticta on Pines. Mycological Papers N 153, CAB. OEPP-CABI, Mycosphaerella dearnessii et Mycosphaerella pini in Organismes de Quarantaine pour l Europe.Tome 1, pp CAB International. 11. Annexes ANNEXE 1 : «Symptômes et critères de détection de Mycosphaerella dearnessii M.E. Barr» ANNEXE 2 : «Symptômes et critères de détection de Mycosphaerella pini E. Rostrup» ANNEXE 3 : «Identification de Mycosphaerella dearnessii et Mycosphaerella pini» MF./97/06 version b 7/10

8 ANNEXE 1 Symptômes et critères d identification de Mycosphaerella dearnessii M.E. Barr (= Scirrhia acicola (Dearness) Siggers) (Photos LNPV-UMAF) Taches brunes - Apparition sur aiguilles âgées de nombreuses petites taches jaunâtres devenant brunes et souvent délimitées par une bordure plus foncée. Un halo jaune est également souvent visible autour de la tache. Les aiguilles affectées présentent souvent 3 zones distinctes caractéristiques : une base restant verte, une partie médiane ponctuée de taches pouvant devenir coalescentes et une extrémité desséchée. A terme, les aiguilles sèchent et tombent à l automne. Seules les aiguilles de l année restent saines Les fructifications asexuées (acervules) se développent au sein ou à proximité des taches sous la forme de petits points noirs. A maturité, de couleur noire, sous-épidermiques, +/- groupés et disposés le long de l axe de l aiguille, elles déchirent l épiderme et deviennent proéminentes avec souvent un fragment d épiderme restant adhérant. En été, les conidies produites sont expulsées sous forme de masse sombre (brun-vert) MF./97/06 version b 8/10

9 ANNEXE 2 Symptômes et critères de détection de Mycosphaerella pini E. Rostrup (=Scirrhia pini Funk & A.K. Parker) (Photos LNPV-UMAF) Taches rougeâtres- Au printemps, les taches se développent en encerclant l aiguille pour former des bandes brun-rougeâtre caractéristiques. Ces dernières sont essentiellement localisées au niveau de l apex et de la partie médiane de l aiguille. Dessèchement apical - Un autre symptôme caractéristique correspond au dessèchement de la zone apicale des aiguilles tandis que la base reste verte. Les bandes rougeâtres ne sont pas toujours bien visibles et les aiguilles peuvent présenter un brunissement général. Ces symptômes peuvent être confondus avec ceux causés par Mycosphaerella dearnessii ou d autres agents pathogènes des aiguilles de pins. La coloration rouge des bandes reste visible après le dessèchement de l aiguille Les fructifications asexuées (acervules) se développent, de façon +/- dispersée, au sein des bandes rougeâtres, ou des zones nécrosées si les bandes sont moins visibles. A maturité, ces acervules sous-épidermiques et noirs, déchirent l épiderme et deviennent proéminents avec souvent un fragment d épiderme restant adhérant. Souvent, ce dernier se déchire d un seul côté de la fructification. Les conidies produites sont libérées sous la forme d une masse mucilagineuse claire. MF./97/06 version b 9/10

10 ANNEXE 3 Identification de Mycosphaerella dearnessii et M. pini (Photos LNPV-UMAF) Forme sexuée Mycosphaerella dearnessii Mycosphaerella pini Forme asexuée Lecanosticta acicola Dothistroma septospora Fructifications Sporée Conidies Souvent disposées en deux files parallèles. Recouvertes au centre par de l épiderme Masse olivâtre à vert-brun foncé à reflets luisants Solitaires ou en petits groupes, (aspect de griffures noires) L épiderme s ouvre sur un seul côté Translucide ou de couleur pâle (crème à roseorangée) Couleur et aspect Forme Sub-hyalines à brunes, leur paroi apparaît épaisse, échinulée à verruqueuse ou tuberculeuse Droite à courbe, fusiforme à cylindrique La base est tronquée tandis que l apex est arrondi Hyalines, avec une paroi fine et lisse Courte et claviforme ou longue et filiforme Base et apex sont arrondis Taille : * ** * - L (µm) (10) (55) (11) - 19,7-43,1 - (64) (8) (40) - l (µm) 2-4,5 (1) - 2,6-4,4 - (6) 1,8 3 Nombre de cloisons * H.C. EVANS (cf. 10. Références bibliographiques) ** LNPV-UMAF : Mesures sur 81 échantillons français (50 mesures par individu). MF./97/06 version b 10/10