Immunofluorescence. Méthode qui utilise un marqueur fluorescent pour mettre en évidence un complexe Ag-Ac

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1 Immunofluorescence Méthode qui utilise un marqueur fluorescent pour mettre en évidence un complexe Ag-Ac Rappels Luminescence: émission de lumière consécutive à l excitation d une molécule par une énergie autre que la chaleur: Photon: Fluorescence: transition électronique entre un état singulet excité et un état singulet fondamental. C est un phénomène rapide: 10-9 s Phosphorescence: transition entre un état triplet excité et un état singulet fondamental. Phénomène lent: 10-6 s Chimique: Chimioluminescence: transition électronique entre un état singulet excité et un état singulet fondamental.

2 Fluorochromes: Petites molécules: fluoresceïne, rhodamine Grosses molécules: phocoérythrine Lanthanides: europium État excité Absorption d un photon h incident Transfert d énergie dû à des mouvements internes de la molécule: Notion de rendement quantique (rq) État excité singulet Émission d un photon h h <h État fondamental Exemple: fluoresceïne Rq=0,65 h h

3 Microscope à épifluorescence Bandes passantes oculaire Filtre d excitation interférentiel Filtre d émission source Filtre d éxcitation Miroir dichroïque Semi réfléchissant Miroir dichroïque Semi réfléchissant objectif Lame Filtre d émission interférentiel

4 Microimmunofluorescence Principe: On fixe le fluorochrome de façon covalente sur l Ig tout en conservant: La fluorescence La spécificité de l Ac L Ag est en phase solide: particulaire ou lié à une particule Différentes méthodes sont utilisables: IF directe IF indirecte IF complément IF avidine biotine

5 Marquage des Ac: 1 Choix du fluorochrome: isothiocyanate de fluoresceïne (FITC) liaison facile à réaliser stable bon rendement quantique PM à prendre en compte selon que l Ag est en surface ou à l intérieur d une cellule 2 Ac: Il faut le purifier avant le marquage 3 conjugaison: 1 à 4 molécules de FITC par molécule d Ig ( rapport F/P) 4 élimination du fluorochrome non lié, par dialyse par exemple 5 contrôler la qualité du conjugué: F/P sensibilité mais spécificité. La constante d affinité de l Ac diminue et électronégativité augmente Réactifs commerciaux: Contrôler la présence éventuelle de fluorochrome libre qui se fixe partout Contrôler l électronégativité des Ig marquées par immunoélectrophorèse Contrôler la spécificité de l Ac avec des sérums de contrôle

6 Avantages du microscope à épifluorescence: La préparation est éclairée par-dessus: Meilleur rendement Fond noir épifluorescence diafluorescence L objectif sert de condenseur: les performances augmentent avec le grossissement de l objectif, C est l inverse en lumière transmise Inconvénient: le fluorochrome est détruit plus rapidement car la lumière est plus concentrée

7 Les techniques IF directe: Recherche d un Ag seulement F Ac-F Incubation en chambre humide pour former les complexes Lavage pour éliminer les Ac non fixés F F Spécifique mais coûteux (1 Ac-F pour 1 Ag) F IF indirecte Recherche d Ag ou d Ac Anti Ig-F -incubation en chambre humide (formation Ag-Ac) -lavage -incubation en chambre humide (formation Ag-Ac-anti-IgF) -lavage Plus longue Plus sensible mais moins spécifique Économique (1 anti-ig-f pour de nombreux Ag) Recherche d Ac possible: possibilité de titrer les Ac (suivin d une RI) possibilité de préciser la classe de l Ac (utilisation d un anti-igg, d un anti-igm ou d un anti-igaf)

8 L Ag doit être particulaire: ceci est nécessaire à la séparation des formes liées et liées Il peut être non fixé: Exemple: cellules vivantes en suspension: les Ac ne pénètrent pas : détection d Ag de membranes (CD4, CD8 ) en CMF coupe d organes congelés sur lame en MIF Il peut être fixé: l usage d un fixateur augmente l adhérence au support (lame) type solvant organique: éthanol, méthanol, acétone: précipite les protéines (pas toutes!) et percent les membranes, ce qui permet l accès aux épitopes profonds (anti-noyaux par exemple) types aldéhydes (formol, paraformaldéhyde: moins dénaturant mais imperméabilisent les membranes, ce qui nécessite d utiliser ensuite un détergent non-ionique pour accéder aux épitopes internes NB: les lavages éliminent les Ag restés solubles

9 Réactions faussement positives: auto-fluorescence affinité des Ig-F pour les charges positives (granulations acidophiles, nécrose cellulaire Fc et FcRécepteur membranaire (utiliser un F(ab) 2 Facteur rhumatoïde: faux positifs en IgM présence d autres anticorps dans le sérum à étudier Réactions faussement négatives: marquage insuffisant phénomène de zone: rare bruit de fond élevé

10 applications IF directe: Ex: recherche de tréponème, de streptocoque, d E coli entéropathogène, de chlamydia dans un prélèvement avec un Ac fluorescent spécifique. De même en virologie, en parasitologie IF indirecte: Recherche d Ac: sérologie bactérienne, virale, parasitaire Recherche d auto- anticorps dans les maladies autoimmunes: Anti-constituants cellulaires: anti noyaux, anti nucléoles, anti membrane nucléaire, anti mitochondrie, anti actine Anti-tissus: anti estomac, anti mucle lisse, anti peau Anticorps spécifiques d organe: anti thyroïde, anti-surrénale

11 Tréponéme pale IF directe sur prélèvement Ou sérodiagnostic en IFI FTA absorbé

12 Antimitochondries sur cellules Hep-2 Tubules rénaux de rein de rat: Antimitochondries Pathologies hépatiques

13 Anti MBG (membrane basale glomérulaire) Symdrome de Goodpasture

14 Critidia luciliae (antidna natif) LED

15 Anticytoplasme des polynuclaires(anca) canca (Ag: PR3) Maladie de Wegener panca (Ag: MPO) Vascularite type périartérite noueuse)

16 Peau: anti membrabe basale (pimphigoïde bulleuse) Anti substance intercellulaire (pimphigus)

17 Cytométrie en flux Définition: La CMF est définie comme l étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. C est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide utilisant un cytomètre. caractéristiques d un cytomètre: Fluidique: circulation des cellules (des particules) dans une gaine à paroi liquide (évite l adhérence des cellules) Utilisation d un faisceau laser pour l observation du passage de chaque particule (= événement) en absorption (dans l axe du faisceau optique) et en diffusion (à 90 ) à l aide de photomultiplicateurs (PMT) Marquage par immunofluorescence des cellules et mesure à 90. L utilisation de filtres interférentiels permet l utilisation simultanée de plusieurs fluorochromes. Pour un évènement, plusieurs paramètres sont recueillis simultanément et sont traités informatiquement. Plusieurs milliers d évènements sont saisis et traités statistiquement;

18 Schéma d un compte cellule electronique compteur photodiode Suspension cellulaire Pipette pasteur étirée Source lumineuse + diaphragme Problème essentiel: bouchage du tube en verre à cause des cellules adhérentes ou des amas. D où l idée d utiliser une gaine liquide

19 Cytomètre: Cellule d échantillonage échantillon Liquide de gaine Liquide de gaine Rayonnement laser 90 PMT Jet liquide PMT

20 Coupe au niveau du rayon laser Liquide de gaine Laser 488nm PMT1: taille F Interférentiel PMT2: structure Miroirs dichroïques FITC PMT3: Phycoérythrine PMT4

21 MONOCYTES GRANULOCYTES LYMPHOCYTES