Contribution de la Pharmaco-Toxicologie cellulaire dans le développement et le contrôle de la qualité des médicaments
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- Delphine Vinet
- il y a 8 ans
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1 Contribution de la Pharmaco-Toxicologie cellulaire dans le développement et le contrôle de la qualité des médicaments DR Henni CHADER PR Mohamed Ben Slimane MANSOURI
2 Champs d application de la Pharmaco-Toxicologie Développement des médicaments et cosmétiques. Contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques (médicaments, dispositifs médicaux) et cosmétiques.
3 Développement d un nouveau médicament Screening pharmacologique : mise en évidence de l activité pharmacodynamique. Screening toxicologique : évaluation de la sécurité.
4 Screening pharmacologique Étude qualitative (loi de tout ou rien). Étude quantitative (relation doseeffet).
5 Screening toxicologique Essais pré-requis: Essai de la toxicité aigue. Essai de la toxicité subaiguë. Essai de la mutagenèse. Essais post-requis: Essai de la toxicité chronique. Essai sur la cancérogenèse. Essais sur la reproduction.
6 Screening toxicologique (Essai pré-requis) Essai de la toxicité aigue : Profil toxicologique après ingestion massive. Planification des études toxicologiques ultérieures.
7 Screening toxicologique (Essai pré-requis) Essai de la toxicité subaiguë : Profil toxicologique après administration réitérée à moyen terme. Planification des études toxicologiques ultérieures.
8 Screening toxicologique (Essai pré-requis) Essai de la mutagenèse : Recherche d un éventuel pouvoir mutagène.
9 Screening toxicologique (Essai post-requis) Essai de la toxicité chronique : Profil toxicologique après administration réitérée à long terme.
10 Screening toxicologique (Essai post-requis) Essai sur la cancérogenèse : Recherche d un éventuel pouvoir néoplasique.
11 Screening toxicologique (Essais post-requis) Essais sur la reproduction : Évaluation de la toxicité congénitale : Impact sur la gamétogenèse. Impact sur l embryogenèse et la foetogenèse. Impact sur la parturition et l allaitement.
12 Contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques Titrages biologiques : essais pharmacodynamiques (hormones). Évaluation de la sécurité : Essai de la toxicité anormale. Essai des pyrogènes. LAL tes (recherche des endotoxines bactériennes).
13 Développement toxicologique des produits cosmétiques et ingrédients Toxicité aigue, toxicité chronique Irritation cutanée, irritation cutanée photo-induite Irritation oculaire Irritation des muqueuses
14 Développement toxicologique des produits cosmétiques et ingrédients Mutagenèse, photomutagenèse Cancérogenèse Toxicocinétique: absorption cutanée, métabolisme
15 Contrôle de la qualité des produits cosmétiques Évaluation de la sécurité: Essai d irritation cutanée Essai d irritation oculaire Essai de phototoxicité (Irritation cutanée photo-induite)
16 Supports utilisés pour la réalisation des essais pharmaco-toxicologiques Animaux de laboratoire (rat, souris, cobaye, lapin, chien.). Lysat de cellules circulantes d un crabe (Limulus polyphemus) Bactéries, levures et cellules.
17 Remise en cause de l expérimentation animale Limites de la transposition à l homme des résultats expérimentaux obtenus chez l animal. Nombre élevé d animaux sacrifiés pour un faible taux de retombées scientifiques (screening) Contraintes techniques et économiuques. Souffrance infligée aux animaux lors de l expérimentation.
18 Quelle alternative à l expérimentation animale en pharmaco-toxicologie? Méthodes in vitro Méthodes in sillico (Modélisation informatique et mathématique)
19 Bases de fondement des méthodes alternatives à l expérimentation animale La règle des 3 R selon Russel et Burch (1959) : Remplacement Réduction Raffinement
20 Les méthodes in vitro Méthodes biochimiques et polymères (système EYTEX: toxicité oculaire). Méthodes physico-chimiques (contrôle de la qualité: titrage des hormones) Méthodes utilisant des organes isolés ou parties d organes. Méthodes in ovo (HET-CAM) Culture cellulaire.
21 Culture cellulaire C estlemaintienhors de l organisme, de cellules capables in vitro de se multiplier et d exprimer métabolismes et fonctions spécifiques
22 Rappel historique sur la culture cellulaire La culture cellulaire est née en 1952 de l expérience de MOSCONA En 1956 EAGLE et FOLEY: premiers travaux de pharmacologie cellulaire (évaluation de l effet antimitotique de médicaments sur des cellules cancéreuses en culture)
23 Les différents types de cultures cellulaires Cultures de cellules en suspension. Cultures de cellules stationnaires: Monocouche. Tridimensionnelle : Liquide/Support - Cellules - Air
24 Exigences de la culture cellulaire Milieux de culture (selon le type cellulaire) Stérilité Température Conservation des cellules Congélation Décongélation
25 Différentes utilisations de la culture cellulaire en pharmacologie et en toxicologie Pharmacologie : Développement/Recherche (D&R) Contrôle de la qualité (médicaments issus de la biotechnologie) Toxicologie : Développement/Recherche(D&R) Contrôle de la qualité (cosmétiques)
26 Utilisations de la culture cellulaire en pharmacologie (D&R) Étude de la perméabilité intestinale (caco2) et transcutanée (peau reconstruite in vitro) Étude du métabolisme (hépatocytes) Élaboration de la cartographie des récepteurs auxquels la molécule se fixe (étude de binding) Compréhension du mécanisme d action des médicaments à l échelle cellulaire et moléculaire
27 En ce qui concerne la cartographie des récepteurs Avec les connaissances en pharmacochimie (structure-activité) : Prédire les effets pharmacologiques Prédire les effets indésirables prévisibles procéder directement au screening orienté sans passer par le screening général: Épargner les animaux d une souffrance inutile. Gain de temps. Gain économique.
28 Utilisations de la culture cellulaire en toxicologie (D&R) Évaluation du pouvoir mutagène Évaluation de la toxicité organospécifique
29 Évaluation de la toxicité organospécifique Principe : évaluation de la cytotoxicité du produit testé. Les critères d évaluation : morphologiques Biochimiques métaboliques pro-inflammatoires
30 Critères d évaluation de la cytotoxicité Paramètres morphologiques : Forme cellulaire Rétractions cytoplasmiques et nucléaires Accumulation des vacuoles Attachement et détachement des cellules
31 Critères d évaluation de la cytotoxicité Paramètres biochimiques: Intégrité membranaire: Fuite enzymatique (LDH) Relargage de rouge neutre Sortie d ions (K +, Ca 2+ )
32 Critères d évaluation de la cytotoxicité Paramètres métaboliques: Taux d ATP, protéines totales, ADN Test au MTT (réduction d un sel de formazan par les déshydrogénases mitochondriales)
33 Critères d évaluation de la cytotoxicité Paramètres pro-inflammatoires : Dosages des interleukines.
34 Domaines d application de la culture cellulaire dans le contrôle de la qualité La tolérance locale (oculaire et cutanée) pour les produits cosmétiques (et ingrédients) La phototoxicité pour les produits cosmétiques (et ingrédients) appliqués sur la peau. La biocompatibilité pour les dispositifs médicaux
35 Les méthodes in vitro officielles utilisées dans le contrôle des produits cosmétiques (et ingrédients) Évaluation du potentiel irritant oculaire : Test de diffusion sur gel d agarose: culture en monocouche de fibroblastes de souris (lignée L929) Test de relargage du rouge neutre: culture en monocouche de cellules cornéennes de lapin (lignée SIRC) Test au MTT sur cornée reconstituée :culture tridimensionnelle de kératinocytes humains transformés (lignée TR146).
36 Les méthodes alternatives officielles utilisées dans le contrôle des produits cosmétiques (et ingrédients) appliqués sur la peau Évaluation du potentiel irritant cutané: Test au MTT sur épiderme reconstitué: culture tridimensionnelle de kératinocytes de prépuce d enfants.
37 Les méthodes alternatives officielles utilisées dans le contrôle des produits cosmétiques et ingrédients appliqués sur la peau Évaluation de la phototoxicité: Test de relargage du rouge neutre : culture en monocouche de fibroblastes de souris (lignée 3T3).
38 Les raisons du développement de l unité de culture cellulaire au niveau du LNCPP: Innocuité des matières premières (principes actifs) multi sources. Perméabilité cellulaire des matières premières (principes actifs).
39 Conclusion Ratio avantages/inconvénients : positif. Passage de l in vivo à l in vitro : Connaissance parfaite de la mécanistique du phénomène étudié. Démontrer la corrélation in vitro-in vivo du phénomène étudié. Prévalidation (optimisation de la méthode):études intra laboratoire. Validation: études inter laboratoires (multicentriques).
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