ANALYSE DE LIPIDES. Assistants: T. Hannich S. Epstein I. Riezman

Transcription

1 ANALYSE DE LIPIDES Assistants: T. Hannich S. Epstein I. Riezman - 1 -

2 1. Introduction Dans cette expérience, nous allons nous intéresser aux lipides et plus principalement à leurs voies de synthèse dans les levures saccaromyces cerevisiae. Les lipides, de manière générale, sont des molécules à la fois hydrophobe et hydrophile, il en existe plusieurs variétés qui divergent selon leurs rôles biologiques. Les phospholipides constituent les membranes, les triglycérides sont stockés comme réserves d énergie, les stérols sont responsables de la fluidité des membranes chez les eucaryotes [1], enfin les sphingolipides transmettent des signaux cellulaires [2]. L objectif de notre expérience a été de comparer une souche mutée à une souche sauvage afin de visualiser les éventuelles mutations des gênes responsables de la synthèse lipidique. Après extractions des lipides, ces derniers ont été mis en évidence par des TLC (chromatographie sur couche mince), chaque sorte de lipide présent a pu être identifié selon son affinité aux substances révélatrices décrites ci-dessous. Selon nos analyses, nous pouvons avancer que nos mutants ne synthétisent pas les triacylglycérides, de plus, nous avons pu observer parallèlement par des analyses spectrométriques de masse, une augmentation des diacylglycérides et des stérols ester. 2. Méthodes Nous avons suivie les procédures énoncées dans le protocole de biochimie concernant l extraction des lipides. 2.1 Techniques Chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC) [3] Cette méthode est souvent utilisée pour séparer des composants par migration. Pour ce faire, la solution à étudier est déposée à un point précis sur une fine plaque de silice (phase stationnaire), ensuite la plaque est positionnée à la verticale dans un fond d éluant (phase liquide), qui va selon l affinité de l éluant avec nos composés faire migrer ces derniers et les séparer par diffusion. Afin d observer quelles sortes de lipides nous avions, nous avons utilisés les substances révélatrices suivantes: - Les vapeurs d iode pour tous les lipides et plus principalement les lipides insaturés - Un bain d acide sulfurique composé de méthanol et MnCl2 pour obtenir des couleurs différentes pour chaque lipide - Une pulvérisation de ninhydrine spécifique aux groupes d acide aminés. Spectrométrie de masse (GC/MS et LC/MS) [3] La spectrométrie de masse est une méthode d identification sensible permettant de connaître la masse d un composé ainsi que ses caractéristiques structurales par analyse du rapport m/z (masse/charge). Couramment utilisée en parallèle avec les techniques de séparations suivantes : chromatographies sur phase gazeuse ou en phase liquide. GC/MS : La chromatographie en phase gazeuse couplée au spectromètre de masse est utilisée lorsque l échantillon à analyser est susceptible d être vaporisé par chauffage sans se décomposer. Les diverses molécules vont sortir séparément et pourront alors être identifier par le détecteur du spectromètre de masse. Dans notre cas, nous avons utilisé cette méthode pour détecter et quantifier des molécules nonpolaires telles que les stérols et les triglycérides

3 LC/MS : La chromatographie en phase liquide couplée au spectromètre de masse est utilisée pour séparer des ions chargés, le composé va être vaporisé par ionisation jusqu'à l obtention de gouttelettes contenant un seul ion, qui pourra être détecté par un voltage spécifique à chaque ion. Nous avons eu recours à cette méthode pour quantifier les masses des phospholipides ainsi que celles des sphingolipides présents. 3. Résultats 3.1 Chromatographie en deux dimensions des glycerophospholipides Cette chromatographie permettra d identifier les glycerophospholipides d après un schéma théorique donné dans le polycopié du TP. [3] Cette TLC est en deux dimensions, elle se déroule comme une migration normale puis la plaque est tournée à 90 et une deuxième migration est effectuée. Le premier mélange de solvant est constitué de chloroforme, méthanol et ammoniac à 25% (65 :35 :5). Puis le second mélange sera chloroforme, acétone, méthanol, acide acétique et eau (50 :20 :10 :10 :5). Image N 1 : TLC à deux dimensions pour la souche wt - 3 -

4 Image N 2 : TLC à deux dimensions pour la souche mutante Il est difficile d analyser correctement les résultats au vue de la réussite médiocre de cette TLC. Cependant en comparant la souche wt avec la souche mutante, on remarque la disparition dans la deuxième des phosphatidylinositol et des phosphatidylserine. Par contre il y aurait apparition des caridiolipins. Les lipides naturels sont présents dans les deux cas. Mais il est difficile de tenir compte de ces résultats en vue de leur faible fiabilité

5 3.2 Chromatographie à une dimension des stérols et des lipides naturels Une chromatographie sur couche mince est effectuée, elle se déroule en deux étapes. Une première étape consiste à faire migrer les échantillons jusqu à 3 cm dans un mélange d éther de pétrole et de diéthyl éther (1 :1). La seconde étape devra migrer jusqu à 6 cm dans un mélange d éther de pétrole et de diéthyl éther (49 :1). Image N 3 : TLC à une dimension des stérols et des lipides naturels Nous remarquons que le wt et le mutant possède un spot au même niveau que le standard d ergostérol (cercles noirs). Par contre le mutant ne contient pas de triglycéride. Le wt par contre en contient un peu (cercle rouge)

6 3.3 Chromatographie à une dimension des glycerophospholopides Nous avons effectué une chromatographie sur couche mince (TLC), dans un mélange de solvant chloroforme/méthanol/ammoniac (50 :25 :6). Cette TLC permet de détecter les glycerophospholipides, la détection se fera suivant deux types : avec la vapeur d iode et la ninhydrine. Image N 4 : TLC à une dimension des glycerophospholipides avec détection à la vapeur d iode Nous remarquons que le type sauvage (wt) et le mutant sont identiques en ce qui concerne les glycerophospholipides, en comparant avec les standards on remarque qu ils contiennent les 3 types (PE, PC et PS). Image N 5 : TLC à une dimension des glycerophospholipides avec détection à la nihnydrine Nous pouvons effectuer les mêmes constatations que précédemment. Seule la technique de détection change. La ninhydrine est plus sensible et précise que les vapeurs d iodes. La ninhydrine permet de détecter les acides aminés

7 3.4 Spectrométrie de masse Deux types de spectrométries sont utilisées dans ce TP. La spectrométrie en phase gazeuse (GC-MS) et la spectrométrie en phase liquide (LC-MS). La première permet d analyser les molécules à caractère non polaire. [3] Une fois de plus, nos deux souches (wt et mutant) pourront être comparées. Image N 6 : Spectrométrie de masse en phase gazeuse Le graphique du haut (en rouge) correspond à notre souche sauvage et la graphique du bas (en vert) correspond à la souche mutante

8 Graphique N 1 : Histogramme des résultats obtenu par GS-MS Histogramme GC-MS 1.20E E+04 IPC-C Quantité 8.00E E E+03 Quantité wt Quantité mutant 2.00E E Lipides Image N 7 : Spectrométrie de masse en phase liquide Le lipide IPC-C est nettement plus présent dans la souche mutante. Les 4 premiers graphiques correspondent à la souche sauvage et les 4 derniers à la souche mutante

9 4. Discussion et Conclusion Les résultats sont difficiles à analyser pour la chromatographie 2D. En effet, nous lors d une des dimensions pour le mutant, la ligne de base n était pas totalement linéaire : il y avait comme une vague à environ 2 cm du bord droit. Les lipides sont alors un peu déplacés par rapport à ce que nous aurions pu attendre. Lors de la TLC, nous pouvons remarquer qu il manque que la tache correspondant aux triglycérides. La tache correspondant à l ergostérol n est pas de la même couleur. Il n y a pas de triglycérides ou elles ne sont pas identiques à celles du type sauvage. L analyse par LC-MS nous permet de déterminer la quantité des différentes PL dans nos échantillons. Notre analyse nous indique que la quantité de PC, PE et PS sont à peu près identiques entre le type sauvage et le mutant. Il semblerait que nous n ayons pas une mutation qui affecterait la quantité de phospholipides ce qui confirme nos résultats sur plaques TLC. L analyse par GC-MS permet de détecter la quantité de lipides de types non polaires. Notre analyse nous donne des résultats plus précis et plus intéressants par rapport à notre mutation. En effet, les pics correspondant aux triglycérides et aux esters de cholestérol diffèrent, les autres pics sont à peu près identiques à celui de notre mutant. Nous pouvons remarquer que la quantité de diacylglycérides est différente. Elle est plus importante chez le mutant. De plus, la quantité de stérols a augmenté parallèlement à la quantité de diacylglycérides. Il y a environ 10 fois plus d esters stérols dans notre mutant. Nous pensons que c est une conséquence de la mutation qui a affecté la synthèse de plus d acides gras, qui ont été ensuite synthétisés en cholestérol. En observant le schéma (figure 3A du cours), nous concluons que notre mutant a subi une mutation sur les gènes suivants : DRGA1, LRO1. Ces gènes codent normalement l enzyme qui permet la synthèse des triglycérides (voir figure 1). Figure 1 : Voies biosynthétiques des phosphoglycerides [3] La classe de lipide affectée par notre mutation s est révélée être la classe des triglycérides, produits par les diacylglycérides par le biais des gènes DGA1 et LR01. Les triglycérides sont les constituants premiers des huiles végétales et des graisses animales, comme on peut le voir sur le schéma ci-dessous, les triglycérides sont facilement identifiables car le glycérol est estérifié par trois acides gras

10 Figure 2 : Triacylglycérides [ 4 ] Les triglycérides possèdent un haut potentiel énergétique, lorsque le corps est au repos, ce sont les triglycérides, hydrolysés en acide gras qui sont la source d énergie principale. La synthèse des triglycérides est complexe et se déroule en trois étapes : - formation de l acide phosphatidique, - déphosphorylation de l acide en diglycéride - estérification de la dernière fonction alcool du glycérol. 5. Sources bibliographiques [1] (consulté le ) [2] (consulté le ) [3] TRAVAUX PRATIQUE DE BIOCHMIE,, T.Soldati, 2010 [4] (consulté le ) "J'atteste que dans ce texte toute affirmation qui n'est pas le fruit de ma réflexion personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d'une autre source est en outre placé entre guillemets" Michèle Forestier Coralie Fournier Christophe Freyre