Production d effecteurs immuns. Veronique DECOT, MCU-PH UTCT (Unité de Thérapie Cellulaire et Tissus) CHU de Nancy

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1 Production d effecteurs immuns Veronique DECOT, MCU-PH UTCT (Unité de Thérapie Cellulaire et Tissus) CHU de Nancy

2 Conditionnement Receveur Allogreffe de CSH Non prise et rejet de la greffe Donneur Immunosuppression (IS) Reconstitution immunitaire à partir des cellules souches du greffon Effet Graft vs. Leukemia (GvL) Effet Graft vs. Host (GvH) Lenteur de la RI Immunodéficience Complications (Infections virales)

3 RI et complications post-greffe J720 Cellules B matures Neutrophile Cellules T matures Neutropénie J30 J360 T naïfs Thymus receveur CS donneur Génération de novo des cellules T naïves à partir de CS du greffon Conditionnement Infections bactériennes Infections virales et Receveur fongiques J0 Greffe de CSH IS NK J60 J100 Cellules B immatures J90 GvH Immunodéficience Expansion des cellules T du greffon (CD4/CD8)

4 Virus d Epstein Barr Protéines d enveloppe (gb, gn) Tégument ADN viral Nucléocapside Nicolas et Meyohas, 2003 Enveloppe lipidique Agent de la mononucléose infectieuse 95% de la population mondiale infectée Infecte préférentiellement les LB Pathologies post-greffe : Syndrome de lymphoprolifération Souvent apporté par le greffon Traitement : rituximab

5 Cytomégalovirus Reste quiescent dans les Monocytes (50% Ad CMV+) On distingue : CMV infection : isolement CMV, Ag ou ADN dans un prélèvement CMV Maladie : association à des signes cliniques : Pneumopathie CMV, maladie CMV gastro-intestinale, Hépatite, rétinite r ou encéphalite (rare). Incidence infection : 60 à 70% chez les R CMV+ Traitements médicamenteux m d autant d plus efficaces qu ils sont mis en œuvre de façon Pré-emptive : Gancyclovir

6 Adénovirus Jones et al., 2007 ; Walsh et al., 2009 L Adénovirus : 54 sérotypes s répartis r en 7 espèces (A à G) ADV maladie : Ag ou ADN viral + signes cliniques Signes cliniques : atteinte digestive (diarrhée) atteinte pulmonaire (pneumonie), cystite hémorragiqueh atteinte rénale ou systémique Incidence : 5 à 21% chez les adultes et jusqu à 80% chez les enfants. Traitements médicamenteux m : Cidofovir

7 Mesures mises en oeuvre - Isolement en secteur stérile - Prophylaxies anti-infectieuses infectieuses : Antibiotiques Anti-fongiques Pas de prophylaxie anti-virale hormis pour Herpès-zona. - Mesures préventives pour le CMV : Receveur CMV- : Receveur CMV+ : Choix d un d donneur CMV, si possible Produits sanguins déleucocytd leucocytés s ou CMV- Choix d un d donneur CMV +, si possible Mesures parfois insuffisantes. - Monitoring régulierr de la charge virale (EBV, ADV, CMV) chez le patient afin d instaurer un traitement pré-emptif - Monitoring régulierr de la reconstitution cellulaire spécifique

8 ALTERNATIVES THERAPEUTIQUES ANTI-VIRALES AU TRAITEMENT MEDICAMENTEUX

9 Sur quoi repose l immunité anti-virale? La reconstitution immunitaire anti-virale specifique Utilisation possible des cellules immunitaires du donneur pour restaurer cette immunité Immunotherapie adoptive

10 Donneur Kennedy-Nasser et al., 2007 Approches possibles DLI X X X Receveur X Virus CPA Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) anti-virus Cellules T anti-leucémie Kennedy-Nasser Cellules T alloréactives et al, BMT 2007

11 ADV

12 Donneur Kennedy-Nasser et al., 2007 Immunothérapie cellulaire DLI X X X Allo-déplétion X X Receveur Virus CPA Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) anti-virus X Cellules T anti-leucémie Cellules T alloréactives

13 Déplétion Alloréactive : - Principe : Eliminer spécifiquement les cellules T du donneur présentant une alloréactivit activité vis-à-vis du receveur. irradiation + Culture 48 à 72 h PBMC Donneur - Marqueurs d activation d : CD 25, CD 69, etc.. - Déplétion des cellules exprimant le marqueur : Billes immunomagnétiques Immunotoxine PBMC Receveur = marqueur d activation

14 Déplétion Alloréactive : - Résultats : Essai clinique Necker (Andre schmutz Andre schmutz et al,, The Lancet 2002) :

15 - Résultats : Déplétion Alloréactive : Essai clinique Necker (Andre schmutz - Limites : (Andre schmutz et al,, The Lancet 2002) : Essai phase I/II d escalade d de doses (1 à CD3/kg) sur 15 enfants (DI et Hémopathies H malignes). Allogreffe Haploidentique ou NA 4 agvhd < II; 1 cgvhd (peau) : qualité de l allodl allodéplétion? RI rapide; Résolution R d infections d CMV et EBV : 2 patients Leucémies : 3 rechutes/5 Test de cytotoxicité à partir du sang d un d patient, 33 jours après injection des T allodépl plétés Essai clinique Malcom Brenner (Amrolia (Amrolia et al,, 2006) : 16 enfants et Haploidentique Ad (Hémopathies malignes). Allogreffe RI rapide anti-virale Rechute de Leucémies : 7 rechutes/16

16 Donneur Kennedy-Nasser et al., 2007 Immunothérapie cellulaire DLI X X X X X Allo-déplétion Receveur Virus CPA X X PBMC + CTL anti-virus Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) anti-virus X Cellules T anti-leucémie Cellules T alloréactives

17 Comment fonctionne un LTC

18 PRODUCTION DE LTC (CTL) Pré-requis requis pour satisfaire aux exigences réglementaires : Choix de l antigl antigènene Milieux de culture l AFSSaPS présents sur la liste des PTA de Pool de SAB en condition de grade clinique dédid dié au protocole Système de sélection s de grade clinique avec marquage CE S affranchir d une d étape de culture cellules pour amplifier les

19 MODES DE SELECTION DES CTL ANTI-VIRUS CTL spécifiques Culture cellulaire Donneur PBMC Receveur Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) anti-virus Cellules T alloréactives

20 Expansion in vitro de CTL anti-infectieuses infectieuses Exemple de l EBVl - Principe irradiation Donneur

21 Autre exemple de production des CTL EBV

22 CTL EBV: 3 origines possibles CTL du donneur Survie après administration: >8 ans Expansion 2 à 4 log apres administration Reduction de la charge virale chez 20% des patients Pas de developpement de SLPG après administration CTL autologues Interessant dans le contexte de la greffe d organes Injection sans complications observées Persistence moindre car forte immunosuppression CTL 3e partie Constitution de banques

23 Expansion in vitro de CTL anti-infectieuses infectieuses Temps de culture et d expansion d très s long Deux mois environ sont nécessaires n pour produire ces CTL Nécessité de les produire pour tous les patients Difficulté d obtenir des cellules du donneur (surtout à partir d un d donneur fichier) Essai français ais s est s arrêté avec avènement du Rituximab Coût t de production (à( comparer au coût t du Rituximab)

24 - Développement de banques de CTL anti-ebv HLA partiellement compatibles - Haque et al,, 2002; Haque et al,, Choix des CTL anti-ebv les plus compatibles avec le receveur : (forte cytotoxicité contre EBV blastes PHA receveur) contre EBV-LCL donneur et faible contre - 33 patients EBV-SLP traités - Aucune GVHD n est n survenue. - Réponse (complète ou partielle) : 64% à 5 semaines et 52 % à 6 mois - Techniques restreintes à quelques centres Complexes Nécessité de locaux appropriés (culture cellulaire en circuit ouvert)

25 MODES DE SELECTION DES CTL ANTI-VIRUS PBMC Isolement CTL spécifiques Culture cellulaire Donneur Receveur Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) anti-virus Cellules T alloréactives Tétramères

26 Cobbold et al., 2005 TECHNIQUE TETRAMERES - Traitement de 9 patients ayant réactivr activé le CMV x10 3 /kg CTL CD8+ anti-peptide CMV - 10J post-injection: Détection D des CTL CD8+ anti-cmv 9/9: CV CMV s est s négativn gativée 2/9: aggravation GvH de grade I II Limites : - Pas de multimères aux normes GMP - Inadapté pour des fréquences de cellules T actives faibles (ADV)

27 MODES DE SELECTION DES CTL ANTI-VIRUS PBMC Isolement CTL spécifiques Culture cellulaire Donneur Technique immunomagnétique Receveur Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) anti-virus Cellules T alloréactives Tétramères

28 Ex de selection des CTL par technique immunomagnétique: CTL anti-adv

29 Sur quoi repose la selection immunomagnétique? IFN G PBMC Ag viral IFN G

30 Choix de l antigl antigènene Deux antigènes présentent un intérêt: Protéine Hexon de l ADV 2 (Sérion Virion) (Feuchtinger et al) : Historique des cellules Hep 2 (Master cell Bank) Caractérisation risation virologique Adjuvants utilisés Process de purification complet PepTivator-ADV 5 Hexon (Miltenyi Biotec) : Pool de peptides 15mères couvrant la totalité de la Proteine Hexon de l ADV l 5 15 aa 11 aa certification GMP : MACS GMP PepTivator-ADV 5 Hexon

31 CTL ADV : etude clinique Feuchtinger et al, 2006 Selection des CTL IFNg + polyclonales Ag de stimulation: proteine hexon Patients traités: 9 avec infection systémique Resultat: Pas d effets secondaires Pas de GvH de novo 5/9: dimunition charge virale et amelioration clinique 4/9: 3 deces (ADV), 1 deces (lymphome)

32 Technique de production des CTL mis en place au CHU de Nancy

33 Incubation 6h Injection Ag ADV Marquage Receveur ADV+ Donneur de CSH Contrôles qualité : - Cytométrie en flux - Fonctionnels - Bactériologie

34 RESULTATS J. Immunother May; 33 (4) :

35 Résultats Before isolation TNC (10 6 ) CD4 + CD8 CD4 (% ) # + IFN-g + (%) + CD8 + IFN-g + (%) # (%) * * Mean SD Range [52 857] [ ] [ ] [ ] [ ] * PBMC from leukapheresis collections. # Percentage of CD4+ and CD8+ cells refers to the total number of cells (ungated population). Percentage of CD4+IFN-γ+ + and CD8+IFN-γ+ + cells refers to the total number of CD4+ and CD8+ cells, respectively.

36 Après sélection N CNT (10 6 ) Pureté CD4-IFNg+ (%) Rendement CD4-IFNg+ (%) Pureté CD8-IFNg+ (%) Rendement CD8-IFNg+ (%) Viabilité (%) Moyenne CD4 SD Range 0.84 [ ] 20.8 [ ] 32.4 [ ] [ ] [ ] [ ] Feuchtinge r, 2007 * (n = 12) Moyenne Range [ ] 46.2 [15 74] 13.3 [0-37] CD3-IFNg [26 94] 40 [10 70]

37 Après sélection N CNT (10 6 ) Pureté CD4-IFNg+ (%) Rendement CD4-IFNg+ (%) Pureté CD8-IFNg+ (%) Rendement CD8-IFNg+ (%) Viabilité (%) Moyenne CD8 SD Range [ ] [ ] [ ] 27 [ ] 39.3 [ ] 13.1 [ ] Feuchtinger, 2007 * (n = 12) Moyenne Range [ ] 46.2 [15 74] 13.3 [0-37] CD3-IFNg [26 94] 40 [10 70]

38 CONTROLES QUALITE FONCTIONNELS

39 Expansion des CTL anti-adv in vitro - 2 semaines de culture : 100 U/ml IL-2 cellules nourricières res autologues irradiées Cell number (x10 6 ) ,1 0,01 Pre Post CTL 1 CTL 2 CTL 3 CTL 4 CTL 5 CTL 6 CTL 7 Expansion moyenne : 1.7 Log (jusqu à CNT après s 2 semaines)

40 Contrôle de la sécrs crétion d IFNd IFNγ Dosage des cytokines intra-cellulaires cellulaires: - Après s 2 semaines de culture : Stimulation des CTL anti-adv avec le PepTivator (16h) Pureté moyenne CD4-IFN IFNγ : /- 23.5% CD8-IFN IFNγ : /- 23.8%

41 Contrôle de la prolifération ration Test de prolifération ration des CTL anti-adv en présence du PepTivator-ADV5 Hexon Before selection After selection Median Range Median Range Peptivator-ADV5 Hexon (cpm) 766 [ ] [ ] PHA (cpm) [ ] 3860 [ ] cpm: counts per minute Prolifération ration accrue des CTL vis à vis du PepTivator-ADV5 Hexon comparée e aux PBMC avant sélections

42 Test de Cytotoxicité Cytotoxicité vis-à-vis des Cellules dendritiques (DC) autologues: - CTL anti-adv contre DC marquées au 51 Cr (rapport 10:1) 40 Cytotoxicité Lyse (%) Specific lysis (%) Non loaded ADV2 ADV5 Peptivator-ADV5 NI ADV2 ADV3 ADV5 ADV10 ADV25 Lysat ADV Hexon (3,4,6,7) PepT CMV (pp65) Une cytotoxicité moyenne de : - 20% vis-à-vis des DC* infectées es avec le lysat viral d ADV2, d % vis-à-vis des DC* infectées es avec le lysat viral d ADV5d - 34% vis-à-vis des DC* chargées avec le PepTivator-ADV5 Hexon - 2% vis-à-vis des DC* non infectées es

43 Etude de l Allorl Alloréactivité Culture mixte des CTL anti-adv avec des PBMC de 3 donneurs différents (6 jours) étude de la prolifération ration par incorporation de le la TH Proliferation (cpm) Before selection ADV-specific T cells Diminution de 1.27 Log de l allorl alloréactivité résiduelle des CTL anti- ADV en comparaison de l allorl alloréactivité observée e avec les PBMC avant sélections

44 Production de CTL anti-adv Isolement de CTL anti-adv ADV: Technique rapide, GMP: Ag de stimulation : PepTivator-ADV 5 Hexon (Miltenyi Biotec) CliniMACS (Miltenyi Biotec) Système clos CTL anti-adv : Potentiel d expansion d in vitro élevé : 1.7 Log Après s restimulation : sécrétion d IFNd IFNγ prolifération ration exclusivement vis-à-vis de l antigl antigène ne de stimulation. Fonctionnalité Cytotoxicité groupes) avec réactivité croisée Réduction de l allorl alloréactivité : 1.27 Log (ADV2, ADV5 et autres

45 CONCLUSIONS et PERSPECTIVES :

46 CONCLUSION & PERSPECTIVES Avantages Techniques (décrits précédemment) Efficacité clinique : inconstante Facteurs influençants : Dose? Moment de l injection l (+/- précoce)? Apport de la PCR ADV dans les selles? Présence d une d GVHD? Administration d un d traitement immunosuppresseur? Protocole clinique multicentrique 11 centres participants.

47 Injection de CTL Complément ment indispensable du traitement anti-infectieux infectieux qui peut se révéler r inefficace en l absence l de reconstitution T Traitement de la cause de ces infections : absence de lymphocytes T spécifiques Orientations Techniques rapides, reproductibles d un d centre à l autre Banques de CTL HLA partiellement compatibles Production de CTL multivirus Difficulté Production de CTL à partir d un d donneur sérons ronégatif (UCB) Utilisation de DC comme APC, chargées avec un antigène ne CMV et culture de plusieurs semaines en présence d IL7 d et d IL12 Autre domaine d applicationd Greffe d organed CONCLUSIONS

48 EQUIPES IMPLIQUEES UTCT Pr STOLTZ Dr D. BENSOUSSAN Dr V. DECOT Lamia AISSI, étudiante en thèse Secteur de Transplantation médullaire m Pr BORDIGONI Dr A. SALMON Dr L. CLEMENT Laboratoire de Virologie Dr V. VENARD Dr H. JEULIN Laboratoire d Immunologie d Pr FAURE Collaboration avec Miltenyi Biotec (G. Rauser et C. Cambouris)

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