HERVE.KLEIN.MICROSCOPIE EPI FLUORESCENCE

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1 HERVE.KLEIN.MICROSCOPIE EPI FLUORESCENCE Principe Certaines molécules (fluorochrome) ont la propriété quand elles sont excitées à certaines longueurs d'onde, d' émettre de la lumière à une longueur d'onde supérieure : c'est la fluorescence. On peut distinguer : Les fluorochromes naturels comme la cellulose Les fluorochromes de synthèse comme le DAPI Les immuno fluorochrome : le fluorochrome est couplé à une immuno globuline. Schéma d'un dispositif d 'épi fluorescence Schéma d'un dispositif d'épifluorescence

2 La Source Lumineuse Généralement on utilise une lampe à arc : vapeur de mercure parfois une lampe xénon L'avantage de la lampe vapeur de mercure est d'avoir un spectre large commençant dans les UV, par contre le spectre n'est pas d'intensité constante L 'arc électrique est intense, concentré entre les deux électrodes mais les pointes des électrodes s'érodent dans le temps rendant l'arc instable et moins puissant. La durée de vie d'une lampe HBO 100 W est de 200 à 300 heures (moitié moins pour une 50W). Il faut aussi laisser l'arc se stabiliser un dizaine de minutes au démarrage et laisser la lampe se refroidir une demi heure avant un ré amorçage. Autre inconvénient est que l'intensité de la lampe est non modulable sauf utilisation de filtres neutres dans le trajet optique. La lampe xénon n'est utilisée que pour des utilisations dans la lumière visible Les lampes vapeur de mercure peuvent être remplacées par des lampes métal halide, plus puissante, avec un spectre plus lissé, plus facile d'utilisation (lampe pré centrée) et de durée vie plus longue 2000 heures. Généralement le boîtier est équipé d'un diaphragme permettant de faire varier l'intensité lumineuse.

3 Une nouvelle technologie apparaît : les LED s. Les LED s sont maintenant suffisamment puissante pour être utilisée pour des applications en fluorescence. Il existe des Leds permettant de couvrir le spectre UV-Visible. Avantage : leur durée de vie, une intensité modulable, pas de temps de stabilisation, par contre il faut une LED par type de fluorescence (UV.Bleu.Orange...) et le double marquage est quasiment impossible. Pour certaines applications dans le visible avec une fluorescence importante un simple lampe halogène 100W suffit Diaphragme de champ et d'ouverture Les systèmes d épi fluorescence sont équipés (pas toujours) d'un diaphragme de champs et d'ouverture. Diaphragme de champs : son rôle est de circonscrire le faisceau lumineux au champ observé pour éviter des fluorescences parasites hors champ. Diaphragme d'ouverture : même rôle que en fond clair, améliorer le contraste, évite que la fluorescence «bave»

4 Objectifs Sur des préparations épaisses, l'utilisation d'un objectif à diaphragme iris permet en modifiant l'ouverture numérique de l'objectif de modifier la profondeur de champ, et d'augmenter la netteté sur toute la profondeur de la préparation. Les objectifs classiques ont une mauvaise transmission dans les UV, les constructeurs ont des gammes d'objectif dit «fluo» pour des excitations dans les UV. De plus ses objectifs ayant une ouverture numérique plus élevée que des objectifs plan achromatique classique, ils sont plus lumineux et ont une résolution supérieure.en fluorescence l'objectif est aussi un condenseur. Cube fluorescence Le cube de fluorescence est composé de trois éléments : Un filtre d'excitation Un miroir dichroïque Un filtre d'émission 1/Principe La lumière de la lampe est filtrée par le filtre d'excitation Puis réfléchie vers l'objectif par le miroir dichroïque La lumière émise par le fluorochrome traverse le miroir dichroïque et est filtrée par le filtre d'émission.

5 2/Les filtres On utilise trois types de filtres. Les filtres short pass ou passe bas qui laissent passer la lumière jusqu'à une certaine longueur d'onde Les filtres long pass ou passe haut qui laissent passer la lumière à partir d'une certaine longueur d'onde Les filtres band pass qui laissent passer la lumière entre deux longueurs d'onde.

6 5/Choix d'une cube La choix dépend bien sur du fluorochrome utilisée. La littérature donne généralement le pic d'excitation et le pic d'émission des différents fluorochromes Les constructeur ont aussi des tableaux donnant les bonnes combinaisons pour chaque fluorochrome. Quelques remarques 1/ Spectre d'excitation Les spectres d excitation et d'émission des fluorochromes sont large et le pic d'excitation du cube peut être décaler par rapport au pic d'excitation du fluorochrome. Exemple le DAPI avec un pic d'excitation à 358 nm mais dont le spectre d'excitation s étend de 300 à 400 nm 2/Fluorescence parasite ou crossing. Si vous avez plusieurs fluorochromes dans votre préparation, vous pouvez avoir une fluorescence parasite d'un fluorochrome qui est légèrement excité en même temps qu'un autre. Dans ce cas, plusieurs solutions : Utiliser un cube avec une spectre d'excitation étroit (narrow band) Utiliser un cube avec un spectre d'émission étroit du type band pass au lieu de long pass. Décaler la longueur d'excitation pour ne plus exciter le deuxième fluorochrome.

7 3/Double ou triple marquage Il existe des cube dit double ou triple bandes permettant d exciter plusieurs fluorochromes en même temps. La difficulté est qu'une fluorescence intense peut masquer un deuxième fluorescence plus faible. Cube double marquage : Triple marquage d'un noyau HERVE KLEIN MICROSCOPIE 38 rue du 8 mai EYSINES

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