Le FRET en microscopie de fluorescence pour l étude des interactions de macromolécules en cellules avril 2007

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1 Formation continue Institut national de la santé et de la recherche médicale Coordination scientifique : Frédéric BRAU, Tristan PIOLOT, Marc TRAMIER, Daniel STOCKHOLM Responsable Formation : Madeleine MONGE Le FRET en microscopie de fluorescence pour l étude des interactions de macromolécules en cellules avril 2007 Institut Jacques Monod - PARIS INTERVENANTS : Frédéric BRAU Marc TRAMIER Daniel STOCKHOLM Tristan PIOLOT Aude JOBART-MALFAIT Marc BARTOLI Nicolas AUDUGE Christophe CHAMOT

2 Frédéric BRAU Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire UMR CNRS , Route des Lucioles Sophia Antipolis VALBONE Tel : 33 (0) Fax : 33 (0) brau@ipmc.cnrs.fr Tristan PIOLOT. Aude JOBART-MALFAIT. Christophe CHAMOT Plateforme d Imagerie Dynamique IFR 117 "Imagerie des processus dynamiques en Biologie Cellulaire et Biologie du Développement" Institut Jacques Monod, CNRS, Université Paris 6 et 7 2, place Jussieu Tour PARIS cedex 05 Tel : piolot@ijm.jussieu.fr jobart@ilm.jussieu.fr chamot@ijm.jussieu.fr Marc TRAMIER Laboratoire complexes macromoléculaires en cellules vivantes Institut Jacques Monod CNRS, Universités Paris 6 et 7 Tour 43, couloir 43-53, 4 ème étage 4, Place Jussieu PARIS CEDEX 05 Tel : +33 (0) Fax : +33 (0) tramier@ijm.jussieu.fr Daniel STOCKHOLM Laboratoire d'imagerie Généthon 1 Bis, Rue de l'internationale BP EVRY Tel : stockho@genethon.fr

3 Le FRET en microscopie de fluorescence pour l'étude des interactions de macromolécules en cellules : du 25 au 27 avril 2007 Mercredi 25 avril h : accueil et présentation du cours 9h30-11h : Rappels sur la fluorescence (Frédéric Brau et Marc Tramier) 11h-12h30 : TP mise en évidence du FRET (Daniel Stockholm) 13h30-14h15 théorie du FRET (Marc Tramier) 14h15-15h : mesure du FRET par intensité (Daniel Stockholm) 15h-15h45 : : mesure du FRET par déclin de fluorescence (Aude Jobart-Malfait) 16h- 16h45 : mesure du FRET par photoblanchiement (Frédéric Brau) 16h45-17h30 : mesure du FRET par polarisation (Marc Tramier) jeudi 26 avril h-10h : Rappels sur la microscopie (Frédéric Brau) 10h-13h : TP par groupe - Intensité (vidéomicroscopie) Tristan Piolot ; Daniel Stockholm -photoblanchiement (confocal) Fredéric Brau ; Aude Jobart -Flim (Trimscope) Marc Tramier ; Christophe Chamot 14h-15h : couples donneurs accepteurs (Aude Jobart-Malfait) 15h-18h : TP par groupe (Intensité-photoblanchiement-Flim ) vendredi 27 avril h-9h30 : séminaire de Marc Bartoli 9h30-10h : séminaire de Nicolas Audugé 10h-13h : TP par groupe (Intensité-photoblanchiement-Flim) 14h-17h : Analyses des données : conclusion des TP 17h : évaluation pot de fin de stage

4 Formation INSERM FRET avril 2007 La durée de vie de fluorescence Marc Tramier Institut Jacques Monod, Paris 1. Diagramme de Perrin-Jablonski Les molécules présentant des propriétés de fluorescence possèdent au moins un électron délocalisé. Lorsque la molécule absorbe un photon, elle change de niveau d énergie électronique passant de l état fondamental à un état énergétique supérieur. Le phénomène de fluorescence se caractérise par l émission d un photon lorsque la molécule revient à son état fondamental. Il est dit radiatif. Perrin a été le premier à caractériser les relations entre niveau d énergie et fluorescence. Ultérieurement, Jablonski a proposé une représentation des différents niveaux d énergie et des sauts entre ces niveaux associés au phénomène de fluorescence [Jablonski, 1935]. Le diagramme de Perrin-Jablonski est présenté en figure II. 1. Les différents sauts sont quantiques, mais entre chaque état singulet, S 0, S 1 et S 2, il existe différents niveaux vibrationnels et rotationnels. L absorption s effectue du niveau fondamental vers les différents niveaux vibrationnels de chaque état singulet. Après relaxation vibrationnelle et/ou conversion interne, phénomènes très rapides, de l ordre de à s -1, lorsque la désexcitation s arrête au plus faible niveau vibrationnel de l état S 1, il y a alors la possibilité d une activité photoinduite telle que la fluorescence ou la phosphorescence. La fluorescence correspond au saut énergétique entre le niveau S 1 et les différents niveaux vibrationnels de l état fondamental simultanément à l émission d un photon. La phosphorescence provient du passage de l état singulet S 1 vers l état triplet T 1. Cet état étant plus stable, le phénomène de désexcitation par émission d un photon est plus lent.

5 S 2 S 1 T 1 hν A hν F hν P Absorption Phosphorescence S 0 Fluorescence Figure II. 1 : Diagramme de Perrin-Jablonski. Les niveaux S 0, S 1 et S 2 correspondent aux états singulets de la molécule, le niveau T 1 est l état triplet. 2. Spectre d absorption, d émission et déplacement de Stokes A chaque saut quantique, faisant passer la molécule de son état fondamental S 0 aux différents niveaux vibrationnels des états singulet S 1 et S 2, correspond une longueur d onde de la lumière d excitation. L efficacité d absorption des photons dépend de leur énergie. Ainsi, le coefficient d extinction molaire, ε, varie en fonction de la longueur d onde d excitation. Il en résulte la notion de spectre d absorption qui rend compte de la variation spectrale de l efficacité d absorption. Deux mesures spectroscopiques permettent d accéder à cette variation: (i) - la mesure de l absorbance qui obéit à la loi de Beer-Lambert, Log I 0 (λ) / I(λ) = ε(λ) C l (II. 1. 1) où I 0 est l intensité de la lumière incidente, I l intensité de la lumière transmise, C la concentration de l espèce absorbante et l le chemin optique de la lumière. (ii) - la mesure du spectre d excitation pour les espèces fluorescentes en mesurant les variations de l intensité de fluorescence en fonction de la longueur d onde d excitation, sachant que pour une population homogène de molécules fluorescentes (fluorophores), l intensité de fluorescence dépend du nombre de molécules excitées. Le spectre

6 d excitation et le spectre d absorption sont généralement superposables. Le spectre d excitation de la GFP est présenté figure II x10 3 Counts (a. u.) Wavelenght Figure II. 2 : Spectres d excitation et d émission de la GFP (S65T). Les spectres ont été effectués au laboratoire puis normalisés. La courbe pointillée correspond au spectre d excitation (λ em = 505 nm), la courbe continue au spectre d émission (λ exc = 480 nm). Les photons émis n ont pas tous la même énergie. Elle dépend du niveau vibrationnel de l état fondamental dans lequel se trouve le fluorophore après sa désexcitation : le spectre d émission rend compte des propriétés spectrales de la lumière émise. Le spectre d émission de la GFP est présenté figure II. 2. Le spectre d émission ne varie généralement pas en fonction de la longueur d onde d excitation. On observe un léger décalage vers le rouge du spectre lorsque l on excite à l extrême bordure rouge du spectre d absorption. Cet effet rend compte des propriétés particulières d interaction du fluorophore à l état excité avec le solvant [Lakowicz, 1983]. Le spectre d émission semble être l image du spectre d absorption à travers un miroir (Fig. II. 2). Le déplacement vers le rouge du spectre d émission par rapport au spectre d absorption correspond à la perte d énergie entre photon absorbé et photon émis. Cet effet est connu sous le nom de déplacement de Stokes. Il s explique par les relaxations vibrationnelles qui s opèrent au sein du fluorophore durant le phénomène de fluorescence. 3. Rendement quantique Le rendement quantique de fluorescence correspond au rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés par un fluorophore. En effet, lorsqu un

7 photon est absorbé, la molécule excitée peut revenir à son état fondamental par différents procédés non radiatifs comme la conversion interne ou l extinction de fluorescence (voir Ch. 4). Le rendement quantique rend compte de la compétition entre le phénomène de désexcitation radiatif et les différents phénomènes de désexcitation non radiatifs. En considérant un diagramme de Perrin-Jablonski simplifié (Fig. II. 3), on peut associer deux vitesses de désexcitation, une radiative, k r, et une non radiative, k nr. S 1 k nr k r Absorption Emission S 0 Figure II. 3 : Diagramme de désexcitation simplifié. k r et k nr correspondent à la vitesse de désexcitation radiative et non radiative, respectivement. Ces constantes de vitesse dépeuplent toutes deux l état excité. Le rendement quantique, Q, peut se caractériser par : Q = k r / (k r + k nr ) (II. 1. 2) L intensité de fluorescence d une solution est ainsi proportionnelle à l intensité d excitation, à la concentration du fluorophore, à son coefficient d extinction molaire, qui est une propriété intrinsèque de la molécule, et à son rendement quantique, qui, lui, varie en fonction du microenvironnement du fluorophore. 4. Extinction de fluorescence L extinction de fluorescence comprend au sens large tout phénomène diminuant l intensité de fluorescence. En mettant à part les effets de propriétés optiques (réabsorption, turbidité de la solution...) qui ne sont pas des phénomènes à l échelle moléculaire, cette diminution de l intensité de fluorescence peut avoir diverses origines : (i) - extinction par réaction chimique à l état excité. Dans ce cas, la diminution de l intensité correspond à la diminution de molécules fluorescentes, le rendement quantique reste constant.

8 (ii) - extinction par collision ("quenching" dynamique). Le contact d un fluorophore à l état excité avec une molécule dite extinctrice (la plus connue est l oxygène) désexcite le fluorophore sans émission de photons. Dans ce cas c est k nr qui augmente. La diminution est fonction de la probabilité de collision entre l extincteur et le fluorophore qui dépend soit de la diffusion moléculaire de l extincteur dans la solution, et donc de la viscosité du milieu, soit de la concentration de l extincteur. (iii) - extinction par formation d un complexe non fluorescent ("quenching" statique). Dans ce cas, comme pour (i), la diminution de l intensité correspond à la diminution de la concentration de molécules fluorescentes. (iv) - extinction par transfert d énergie. Ce phénomène sera détaillé plus loin. Brièvement, le transfert d énergie diminue le rendement quantique par l augmentation de la constante de vitesse non radiative k nr. (v) - extinction par la formation d agrégats. Dans ce cas, cette agrégation met en jeu les atomes impliqués dans le phénomène de fluorescence (chromophore) donnant naissance à une autre espèce fluorescente dont le rendement quantique diminue sensiblement soit par la diminution de k r, soit par l augmentation de k nr. 5. Durée de vie de fluorescence La durée de vie de fluorescence se définit comme le temps moyen pendant lequel une molécule fluorescente demeure excitée. Dans le cas d une population de molécules, la durée de vie de fluorescence correspond au temps moyen de décroissance de la population de molécules excitées simultanément: <t> = t N (t) dt / N (t) dt (II. 1. 3) où N(t) est le nombre de molécules encore excitées au temps t. Il faut souligner que cette notion de durée de vie est autant associée à la population qu à un fluorophore isolé. Autrement dit, regarder le comportement d une molécule unique ou d une population de molécule, en moyenne, est identique. Dans le cas d une seule espèce moléculaire i.e. ayant les mêmes propriétés spectroscopiques, considérons une population initiale N 0 de ce fluorophore dans l état excité, la vitesse de dépopulation de l état excité répond à l équation dn(t) = - (k r + k nr ) N(t) dt (II. 1. 4) où k r et k nr sont les constantes de vitesse radiative et non radiative définies plus haut pour ce fluorophore. L équation II s intègre sous la forme N(t) = N 0 exp (- (k r + k nr ) t) (II. 1. 5) Dans ce cas, l équation II peut s écrire sous la forme

9 <t> = 0 t exp (- (k r + k nr ) t) dt / 0 exp (- (k r + k nr ) t) dt (II. 1. 6) En intégrant par partie, <t> = (k r + k nr ) -1 = τ (II. 1. 7) où τ représente la durée de vie de fluorescence du fluorophore ayant un déclin monoexponentiel. On peut noter que τ ne correspond pas au temps où la moitié des molécules se sont désexcitées. Ce n est pas le temps de demi-vie. En fait, N(τ) = N 0 / e. Au temps τ, 67 % des molécules se seront désexcitées quand 33 % des molécules se désexciterons à t > τ. Il n est pas possible de mesurer directement le nombre de molécules à l état excité. Par contre, il est possible de mesurer le déclin de fluorescence après une brève excitation laser. Le rendement quantique, Q, correspond au rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons absorbés (voir Ch. 3). Pour un intervalle de temps dt, le rendement quantique peut s écrire sous la forme Q = i(t) dt / (-dn(t)) (II. 1. 8) où i(t) correspond au déclin de fluorescence (déclins d intensité). Dans le cas d une population unique (Eq. II. 1. 4), en dérivant N(t), on obtient i(t) = Q τ 1 N 0 exp (-t / τ) (II. 1. 9) En transformant l équation II. 1. 2, on a Q τ 1 = k r, et pour finir i(t) = k r N 0 exp (-t / τ) = I 0 exp (-t / τ) (II ) où I 0 est l intensité mesurée au temps 0. La forme du déclin de fluorescence est exponentiel (Fig. II. 4), le mesurer permet de calculer la durée de vie de fluorescence comme l inverse de la vitesse du déclin monoexponentiel. Intensitˇ de fluorescence Log (intensitˇ) k = 1 / τ Temps Temps Figure II. 4 : Déclin de fluorescence. Le même déclin est respectivement représenté selon un échelle linéaire ou logarithmique. La pente du déclin mono-exponentiel à l échelle logarithmique correspond à la somme de toutes les vitesses de désexcitation ou encore à l inverse de la durée de vie.

10 Rappels de fluorescence Frédéric Brau

11 Introduction à la fluorescence Interactions lumière-matière Elastiques La lumière est diffusée sans échange d énergie avec les états énergétiques des molécules. Il y a conservation du rendement de l émission et de la longueur d onde. Les phénomènes impliqués sont : la réflexion, la diffusion élastique : diffusion Rayleigh (changement de direction du photon sans perte d énergie), la diffraction. Inélastiques La lumière incidente est modulée par interaction avec la structure énergétique interne des molécules. Les phénomènes impliqués sont : l absorption, la fluorescence et la phosphorescence, la diffusion Raman, la diffusion Brillouin. Luminescence Une molécule ou un atome peut absorber, de façon quantifiée, de l énergie à partir de sources diverses : rayonnement électromagnétique, réarrangements électroniques, réaction chimique exothermique Elle est alors dans un état excité instable, et son retour à l état fondamental peut se produire de façons différentes, résumées sur le schéma ci-dessous (d après Campbell, A.K., 1988) : AB + M * BA Quenching collisionnel AB * Isomérisation Transfert d énergie intramoléculaire Energie AB AB* AB + hν Luminescence A + B Dissociation AZ + B Substitution AB + CD* Transfert d énergie intermoléculaire Fig. 1 : Sept modes de perte d énergie d une molécule AB* à l état électronique excité La luminescence résulte du retour, d une molécule ou d un atome excité, à un état énergétique stable s accompagnant de l émission d un photon (dans l UV, le visible, ou l IR). Il existe de nombreux types de luminescences qui se distinguent par la source d activation de la molécule ou de l atome considéré (thermo, électro, sono, tribo, photo, chimi, bioluminescence). La fluorescence et la phosphorescence sont des cas particuliers de photoluminescence (cas où l énergie d activation de la molécule est apportée par un rayonnement électromagnétique), qui se distinguent par la nature des états excités de la molécule considérée.

12 Absorption de la lumière UV-visible Energie interne des molécules et absorption Elle est composée de l énergie de translation, de l énergie électronique E e responsable des liaisons entre atomes et des énergies de vibration E v et rotation E r dues aux mouvements internes de la molécule. Ces énergies sont quantifiées et telles que E e > E v >E r. Chaque niveau électronique contient une série de niveaux d énergie de rotation et de vibration quantifiés. Lorsqu un molécule absorbe de la lumière ayant une longueur d onde comprise entre 300 nm et 700nm, l énergie apportée par cette radiation va principalement affecter les états électroniques, en provoquant une transition d un électron d une orbitale moléculaire à l état fondamental, sur une orbitale vide ayant un niveau d énergie supérieur. Pour qu il y ait absorption, il faut que l énergie associée à la radiation soit égale l écart d énergie entre les deux états électroniques de la molécule. Orbitales moléculaires Chez les molécules organiques et biomolécules les orbitales moléculaires impliquées dans les liaisons sont de type : σ, π (orbitales liantes), et n (orbitale non liante). Les orbitales π sont caractéristiques des doubles liaisons de type C=C, C=O, C=N. Les orbitales n se trouvent sur l O, S, N et les halogènes (hétéroatomes possédant un doublet isolé). Les états excités correspondent à des orbitales moléculaires antiliantes σ* et π*. Les niveaux d énergie des orbitales, et les énergies nécessaires aux transitions vers les états excités sont classés suivant le diagramme d énergie ci-dessous : E σ* π* n π σ Orbitales antiliantes Orbitales liantes Etat fondamental σ σ* > n σ* > π π* > n π* Fig. 2 : Niveaux d énergie des orbitales moléculaires du formaldéhyde (H 2C=O) et transitions électroniques possibles. Dans les systèmes non saturés et plus particulièrement dans les systèmes conjugués (contenant des électrons délocalisés dû au recouvrement des orbitales π : effet résonant), les transitions π π* ou n π* ont une énergie suffisamment faible (longueur d onde grande : E=hc/λ) pour produire des bandes d absorption dans l UV et le visible. Dans le cas d une transition π π* le déplacement de la bande d absorption sera de l UV vers le visible sera d autant plus important que le nombre de doubles liaison conjuguées augmentera ( E π π* sera plus faible). Exemple : cas des polyènes conjugués : H(HC=CH) n H n=1 λ max absorption = 163 nm

13 n=2 λ max absorption = 217 nm n=10 λ max absorption = 447 nm Lorsqu un des deux électrons de spin opposés est porté à un niveau d énergie supérieur, son état de spin est normalement inchangé et le nombre total de spin de la molécule reste égal à 0 (S=0 avec S= Σ s i et s i = ±½). E Etat excité singulet E S 2 π π T 2 π π S 1 n π T 1 π π Etat fondamental Etat excité triplet Fig. 3 : Description des états singulets et triplets pour le formaldéhyde (H 2C=O). Dans ce cas la multiplicité M = 2S+1 = 2.(½-½)+1 = 1 à l état fondamental et l état excité, et l on parle respectivement d états singulet S 0 et S 1. Il est toutefois possible qu un renversement de spin spontané se produise sur la molécule à l état singulet excité. Dans ce cas il y aura 2 électrons avec des spins parallèles et la multiplicité M = 2.(½+½)+1 = 3, et l on parle d état excité triplet (trois états d énergie équivalente), dont l énergie est inférieure à l état singulet excité équivalent (d après la règle de Hund effet de corrélation de spin). S 0 E Principe de Franck-Condon m Etat excité Etat fondamental Distance internucléaire Une transition électronique (durée s) se produit sans changement de position des atomes dans la molécule car les mouvements des électrons sont plus rapides que ceux des atomes, qui sont plus massifs (vibrations, durée s s). On parle dans ce cas de transition verticale. Fig. 4 : Diagramme d énergie potentielle d une molécule diatomique avec des transitions verticales. Toutefois, à l état excité la structure électronique de la molécule est modifiée, ce qui explique le décalage du minimum d énergie de la courbe par rapport à l état fondamental. Fluorescence et Phosphorescence Conversion interne (C.I) Transition non radiative entre 2 états électroniques ayant la même multiplicité de spin. En solution ce processus est suivi par un relaxation vibrationnelle jusqu au plus bas niveau d énergie vibrationnel de l état électronique final. Fluorescence

14 Emission de photons accompagnant la transition S 1 S 0. Cette transition a lieu à partir d un niveau excité à l équilibre thermiquement : le plus bas niveau d énergie vibrationnelle de S 1. Généralement l émission de fluorescence se produit à partir de S 1 et ses caractéristiques (sauf la polarisation) ne dépendent pas de la longueur d onde d excitation à condition qu il existe une seule forme de la molécule à l état fondamental. «Règle du miroir» La distribution des niveaux vibrationnels dans l état fondamental S 0 et dans l état excité S 1 est en général très semblable. L énergie perdue par conversion interne de S 1,ν S 1,0 lors de l excitation est donc à peu près la même que celle qui est perdue de S 0,ν S 0,0 à l émission (Fig. 5, flèches grisées). Il en résulte que le spectre d émission d une molécule est très souvent l image dans un miroir du spectre d excitation. Exception : si la molécule a plusieurs formes (phénol phénolate : 2 états d ionisation différents), si le temps de vie de S 1 est augmenté. E Absorption Fluorescence Phosphorescence S 2,0 C I hc λ S 1,ν S 1,0 S 0,ν C I S hc λ' T 2 T 1 hc λ" S 0,0 Fig. 5 : Diagramme de Perrin-Jablonski et spectres correspondants aux différentes transitions I S 0 S 2 S 0,0 S 1,ν S 1,ν S 0,0 T 1,ν T 0,0 S 0,0 S 1,1 S 1,1 S 0,0 S 1,0 S 0,0 Déplacement de Stokes λ Règle de Kasha Quelque soit la longueur d onde d excitation la forme du spectre d émission est invariante car le rendement quantique est indépendant de la longueur d onde d excitation. Déplacement de Stokes

15 La fluorescence se produit à une longueur d onde λ supérieure à celle de l absorption λ car entre ces deux phénomènes la molécule perd de l énergie par vibrations. L écart de longueur d onde entre les 2 maxima s appelle le déplacement de Stokes. Remarque : Généralement les spectres d absorption recouvrent partiellement les spectres d émission, ce qui sous-entendrait qu une fraction de la lumière émise aurait une longueur d onde inférieure à celle de l absorption, ce qui en contradiction avec le principe de conservation de l énergie. Ceci s explique par le fait qu une petite proportion des molécules est dans un état vibrationnel supérieur au niveau S 0,0 et S 1,0 respectivement à l état fondamental et excité (distribution des molécules suivant la loi de Boltzmann, dépendante de la température). Couplage inter-système (C.I.S) Transition non radiative entre 2 niveaux d énergie vibrationnelle de même énergie mais de multiplicités différentes : S 1,0 T 1. Ce type de couplage est favorisé par la présence de transitions n π* et des atomes lourds (S, Pb, Br). Phosphorescence Emission de photons accompagnant la transition T 1 S 0. En solution, à température ambiante, la transition T 1 S 0 est majoritairement non radiative car interdite. La constante de vitesse du phénomène d émission étant faible, cela laisse le temps à la molécule de dissiper son énergie de façon non radiative lors des collisions avec les molécules du solvant. Les basses températures, les milieux rigides et les atomes lourds favorisent l émission radiative. Remarque : les phénomènes de désexcitation non radiative se traduisent par une dissipation d énergie thermique. Durée des différents phénomènes Absorption Relaxation vibrationnelle Temps de vie de l état excité S 1 Conversion interne Couplage inter système Temps de vie de l état excité T s s à s s à 10-7 s à s 10-9 s s s 10-6 s à 1 s Phénomènes parasites en fluorimétrie «Quenching»: désexcitation des fluorochromes par transfert d énergie à d autres molécules. Il existe deux types de «quenching» :collisionnel et statique, qui se distinguent par leur influence sur le temps de vie de fluorescence du fluorochrome. Réabsorption des photons de fluorescence par des molécules du milieu. Phénomènes de diffusion - Diffusion Rayleigh correspondant à la longueur d onde d excitation. - Diffusion Raman (1/1000 de la diffusion Rayleigh) correspondant à l interaction des photons avec les molécules de solvant. Ce signal parasite est de moindre intensité par rapport à l émission de fluorescence.

16 Diffusion Raman Stokes : se produit lorsque l électron excité retombe dans un niveau d énergie vibrationnel supérieur à l état fondamental (il émet alors une longueur d onde plus grande que la longueur d onde incidente). Diffusion Raman Anti-Stokes : se produit avec un électron initialement à l état excité se désexcitant à l état fondamental (l émission se produit à une longueur d onde plus courte que la radiation incidente). Rendement quantique de la fluorescence La fluorescence est en compétition avec les phénomènes de désexcitation non radiatifs, de transfert d énergie, de «quenching» par collisions, interactions moléculaires Le rendement quantique Φ caractérise l efficacité du processus de fluorescence (Φ toujours <1), et donc la fraction de molécules excitées qui retournent à l état S 0 en émettant un photon : Φ Quantité de photons émis Quantité de photons absorbés Intensité de fluorescence à l équilibre = Mesure à l aide d un spectro-fluorimètre = k Radiatif k Radiatif + k Non Radiatif Source lumineuse Sélecteur de longueur d onde λ Echantillon λ' Sélecteur de longueur d onde I 0 l I T I F Photo-détecteur Fig. 6 : Schéma de principe d un spectrofluorimètre La source lumineuse est un lampe émettant un flux constant de photons N 0, capable d exciter un fluorophore à la concentration [A]. Les mécanismes d excitation et d émission peuvent être décrits suivant le schéma réactionnel :

17 A + hν k a A* k r Si l on considère que la concentration de molécules à l état excité reste constante au cours du temps (pseudo-équilibre), on peut écrire : k nr A + hν' A I d[a*] dt 0 = k α (kr knr )[A*] a N + soit = 0 = kr[a ] soit F r a 0 F * I = k k k r a α N + k nr 0 = Φk αn [A*] k a 0 = k r α N + k nr avec k a αn 0 : quantité de photons absorbés/unité volume/unité de temps I A ε[ A] l Or I = I I = I (1 10 ) A 0 T 0 car I T I = ε [ A ] l Loi de Beer-Lambert log 0 ε : coefficient d absorption molaire (mol -1.l.cm -1 ) I F = ΦI ( ) = 2,3ΦI (1 e ε[ A] l ε[ A] l 0 ) En considérant que la molécule fluorescente en solution est très diluée on peut assimiler e -e[a]l à 1-ε[A]l, donc I F 2,3ΦI 0ε[ A] l On obtient donc une relation linéaire entre l intensité de fluorescence et la concentration du fluorophore. Influence de la structure moléculaire sur la fluorescence Toute augmentation de la délocalisation des électrons sur les orbitales π crée un décalage des spectres d absorption et d émission vers les hautes longueurs d ondes et augmente le rendement de fluorescence. Exemple : cycles aromatiques conjugués : naphtalène : émission UV ; anthracène : émission bleue Effets des groupements substituants sur composés aromatiques Atomes lourds : Br, I sont des «quenchers» car ils augmentent le couplage intersystème. Donneurs d électrons : -OH, -OR, -NH 2, NHR, NR 2 augmentent le coefficient d absorption molaire, le décalage bathochrome (vers les longueurs d onde plus grandes) des spectres qui sont moins structurés que ceux des composés aromatiques purs.

18 Influence des facteurs environnementaux sur la fluorescence Polarité Un fluorochrome est généralement plus polaire à l état excité qu à l état fondamental et sera donc d autant plus stable que l environnement est polaire. Ceci va se traduire par un décalage de l émission vers les grandes longueurs d ondes. Exemple : le Nile Red émet dans le jaune inséré dans les membranes amphiphiles et dans le rouge en présence de triglycérides neutres. ph, ions Modification des spectres d excitation et d émission, du rendement quantique. I F normalisée 100 SNARF-1 ph 9 ph I F normalisée Indo-1 0 [Ca 2+ ] [Ca 2+ ] élevé λ (nm) Fig. 7 : exemple de sondes sensibles au ph et aux ions λ (nm) Température Une augmentation de température s accompagne généralement d une baisse du rendement de fluorescence. Types de flurophores Fluorophores intrinsèques : acides aminés aromatiques (Trp, Tyr, Phe), bases puriques et pyrimidiques, groupements prosthétiques des coenzymes FAD, FMN, NADP, NAD, Hèmes Fluorophores extrinsèques : greffés par liaison covalentes (isothiocyanate de fluorescéine : FITC), intercalants des acides nucléiques: (Hoechst, Bromure d éthidium, DAPI), protéines de fusion Qualités requises : - Limite de détection basse : ε et Φ élevés - émission spécifique : sélectivité en longueur d onde (déplacement de Stokes important) et/ou sélectivité en temps. - Stabilité chimique et photochimique - Rendement de marquage élevé - Hydrophilie

19 Formation INSERM FRET avril 2007 La théorie de FRET 1. Processus de désexcitation par FRET Marc Tramier Institut Jacques Monod, Paris Le FRET participe à la dépopulation de l état excité du donneur au même titre que les processus radiatifs et non radiatifs caractérisés précédemment. La durée de vie du donneur est directement liée au FRET Vitesse de transfert La figure II. 5 représente le diagramme des niveaux d énergie associés au donneur et à l accepteur lorsqu il y a FRET. Quantitativement, le processus de transfert entre le donneur et l accepteur peut se présenter sous la forme d une vitesse de transfert, k T. FRET S D2 S D1 S A1 hν }Facultatif, A Fluorescence dépend hν AD hν D de l accepteur de la nature Absorption Fluorescence de l accepteur du donneur du donneur S D0 DONNEUR ACCEPTEUR S A0 Figure II. 5 : Diagramme des niveaux d énergie du donneur et de l accepteur dans un mécanisme de FRET. En même temps que le donneur transfère son énergie à l accepteur, il retourne à son état fondamental S 0 sans émission de photon.

20 C est la caractéristique fondamentale décrivant le transfert d énergie. On peut aussi représenter le FRET comme une réaction chimique entre donneur excité / accepteur à l état fondamental et donneur à l état fondamental / accepteur excité, k T représentant la constante de vitesse de la réaction (Fig. II. 6). 10 A < d < 100 A FRET D*...A k T D...A* Figure II. 6 : Le FRET vu comme réaction chimique. C est la réaction transformant les espèces donneur excité (D*) et accepteur (A) vers les espèces donneur (D) et accepteur excité (A*) qui caractérise le transfert d énergie. A cette réaction correspond la constante cinétique k T, vitesse de transfert. La vitesse de désexcitation du donneur dépend donc de sa constante radiative intrinsèque, k r, de sa constante non radiative en absence d accepteur, k nr, et de k T.. Le diagramme de Perrin-Jablonski simplifié est présenté figure II. 7. On peut écrire : τ DA = (k r + k nr + k T ) -1 (II. 2. 1) et sans transfert d energie (en absence d accepteur) τ D = (k r + k nr ) -1 (II. 2. 2) où τ DA et τ D représentent les durées de vie du donneur en présence et en absence d accepteur, respectivement. k T S D1 S A1 Absorption k nr k r Emission S D0 Donneur Accepteur S A0 Figure II. 7 : Diagramme simplifié du phénomène de FRET. Sur ce diagramme sont représentées toutes les vitesse de désexcitation du donneur Efficacité de transfert

21 L efficacité de transfert se définit comme le rendement quantique du phénomène de transfert d énergie. Par analogie avec le rendement quantique de fluorescence (nombre de photons émis sur nombre de photons absorbés), le rendement quantique de transfert correspond au nombre de molécules qui se désexcite par transfert sur le nombre total de molécules excitées. Ainsi, Q T = k T / (k r + k nr + k T ) E (II. 2. 3) où Q T est le rendement quantique de FRET et E l efficacité de FRET. 2. Théorie de Förster Förster [Förster, 1948] a proposé un traitement quantique au phénomène d interaction longue portée entre le dipôle de transition électronique d émission du donneur et le dipôle de transition électronique d absorption de l accepteur. Le transfert d énergie a lieu lorsque les deux dipôles rentrent en résonance, se trouvant mutuellement perturbés. L énergie d interaction dipôle-dipôle décroît en fonction du cube de la distance entre les dipôles et dépend de leurs orientations relatives. La probabilité de transfert est proportionnelle au carré de l énergie d interaction. Ainsi, k T décroît en 1/R 6, R étant la distance entre le donneur et l accepteur, et répond à l équation suivante : k T = (9 (ln 10) κ 2 Q D J) / (128 π 5 N n 4 τ D R 6 ) (II. 2. 4) où Q D et τ D sont le rendement quantique et la durée de vie de fluorescence du donneur; N représente le nombre d'avogadro; n est l'indice de réfraction du milieu; J représente quantitativement le recouvrement des spectres d'émission du donneur et d'absorption de l'accepteur (Fig. II. 8); et κ est Emission du donneur Absorption de l accepteur λ Figure II. 8 : Recouvrement des spectres d émission du donneur et d absorption de l accepteur. Ce recouvrement est essentiel à la possibilité de transfert entre le donneur et l accepteur. Sa quantification, J, intervient dans la quantification du FRET. Toutes choses égales par ailleurs, plus J est grand et plus le FRET est important, et réciproquement. le facteur d'orientation qui rend compte de l'orientation mutuelle entre les dipôles électroniques d'émission du donneur et d'absorption de l'accepteur. On a :

22 J = F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ / F D (λ) dλ (II. 2. 5) où λ représente la longueur d'onde, F D (λ) est le spectre d'émission du donneur et ε A (λ) est le coefficient d'extinction molaire de l'accepteur à la longueur d'onde λ, et κ = cos θ T - 3 cos θ A cos θ D (II. 2. 6) où θ T est l'angle entre les dipôles électroniques d'émission du donneur et d'absorption de l'accepteur, θ D et θ A les angles entre le vecteur reliant le donneur à l'accepteur et les dipôles électroniques d'émission du donneur et d'absorption de l'accepteur, respectivement (Fig. II. 9). Il est aussi présenté figure II. 9 quelques cas particuliers de la valeur de ce facteur d'orientation. > µd D θd R > θa A µα > > µd θt > µα > > > > κ = µd. µα 3 ( µd. R > ) ( µα. R > ) 0 < κ 2 < 4 κ = cos θt - 3 cos θa cos θd ou κ 2 = 4 κ 2 = 1 κ 2 = 0 Figure II. 9 : Signification géométrique de κ, le facteur d orientation. Pour simplifier, k T s'écrit sous la forme -1 k T = τ D (R 0 / R) 6 (II. 2. 7) où R 0 correspond à la distance de Förster, i. e. distance où il y a 50 % d'efficacité de transfert, soit k T = k r + k nr = 1 / τ D. On a alors : R 0 = ( J Q D n -4 κ 2 ) 1/6 (en Å) (II. 2. 8) En combinant les équations II et II. 2. 7, on peut écrire 6 6 E = R 0 / (R 0 + R 6 ) (II. 2. 9) Cette équation est caractéristique du lien entre le traitement théorique du FRET et l'expérience. La mesure expérimentale du FRET correspond à la détermination de l'efficacité de transfert. On observe que cette efficacité de transfert se modélise à partir

23 du traitement théorique de Förster qui permet de déterminer la distance entre le donneur et l'accepteur. Le traitement du phénomène de FRET par mécanique ondulatoire [Van Der Meer, 1994] donne des résultats comparables.

24 La mesure du FRET par émission de fluorescence à l état stationnaire L émission à l état stationnaire de la fluorescence du donneur ou de l accepteur correspond à la moyenne des évènements quantiques sur une période relativement longue (ordre de la seconde). Lorsque le donneur est excité qu il y a FRET, l intensité de l émission du donneur est diminué alors que celle de l accepteur est augmentée (Méthode «Sensitize emission» ou «stimulation de l accepteur»). 1 2 Absorption Fluorescence Transfert du donneur Emission Donneur Emission Accepteur

25 Spectres d excitation et d émission du donneur Spectre d excitation du donneur Spectre d émission du donneur Longueur d onde (nm)

26 Spectres d excitation et d émission de l accepteur Spectre d excitation de l accepteur Spectre d émission de l accepteur Longueur d onde (nm)

27 Recouvrement de l émission du donneur et de l excitation de l accepteur nécessaire au FRET Spectre d émission du donneur Spectre d excitation de l accepteur Longueur d onde (nm)

28 Recouvrement de l émission du donneur et de l excitation de l accepteur nécessaire au FRET Spectre d émission du donneur Spectre d excitation de l accepteur Longueur d onde (nm)

29 Exemple de spectre d émission d un donneur (CFP) et d un accepteur (YFP) SANS FRET Composante spectrale mesurée = somme pondérée des deux spectres Spectre d émission de CFP Spectre d émission de YFP Longueur d onde (nm)

30 Exemple de spectre d émission d un donneur (CFP) et d un accepteur (YFP) AVEC FRET Composante spectrale mesurée = Somme pondérée des deux spectres Spectre d émission de CFP Spectre d émission de YFP Longueur d onde (nm)

31 Exemple de spectre d émission d un donneur (CFP) et d un accepteur (YFP) Intermédiaires avec et sans FRET Sans FRET avec FRET Longueur d onde (nm)

32 Exemple d application du FRET par spectroscopie en «cuvette» : La PCR Taqman Début de la PCR Fin de la PCR Longueur d onde (nm)

33 La mesure du FRET en utilisant 3 Filtres Les techniques d imagerie permettant d effectuer des mesures d intensité de fluorescence à l état stationnaire utilisent des filtres. Nous utilisons dans ce cours la nomenclature et la méthode décrite par Brian Hermann (article de G. W. Gordon et coll. Biophysical Journal 1998) Un filtre est composé d une partie spécifique à l excitation de l échantillon et d une partie spécifique à l émission. La mesure du Fret requiert en général 3 filtres. 8. Le filtre Donneur (Ex donneur /Em donneur ) 9. Le filtre FRET (Ex donneur /Em accepteur ) 10. Le filtre Accepteur (Ex accepteur/em accepteur)

34 Le filtre Donneur (Ex donneur /Em donneur ) Spectre d excitation du donneur Spectre d émission du donneur Excitation donneur Emission Donneur Longueur d onde (nm)

35 Le filtre FRET (Ex donneur /Em accepteur ) Spectre d excitation du donneur Spectre d émission de l accepteur nm Excitation donneur Emission accepteur

36 Le filtre Accepteur (Ex accepteur /Em accepteur ) Spectre d excitation de l accepteur Spectre d émission de l accepteur nm Excitation accepteur Emission accepteur

37 La nomenclature d Herman La première lettre est toujours en Majuscule Elle désigne le Filtre utilisé : A : pour Filtre Accepteur D : pour Filtre Donneur F : pour Filtre FRET La deuxième lettre est toujours en minuscule Elle indique quelles molécules sont utilisées dans l expérience : a : seul l accepteur est présent d : seul le donneur est présent f : l accepteur et le donneur sont présents Gordon, G. W., Berry, G., Liang, X. H., Levine, B. & Herman, B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 1998, 74,

38 Exemple pour le filtre Donneur le signal Dd Dd est le signal mesuré avec le filtre Donneur quand seul le donneur est utilisé dans l expérience Excitation donneur Emission Donneur Longueur d onde (nm)

39 Exemple pour le filtre Donneur : le signal Da Da est une fuite spectrale Da est le signal mesuré avec le filtre Donneur quand seul l accepteur est utilisé dans l expérience Excitation Donneur Emission Donneur Longueur d onde (nm)

40 Il faut, dans tous les cas, acquérir 6 images «contrôles» : Dd, Fd, Ad, Da, Fa et Aa Dd Fd Ad Donneur seul Filtre Donneur Filtre FRET Filtre Accepteur Da Fa Aa Accepteur seul

41 Ensuite les acquisitions se font avec un mélange de donneur et d accepteur : Df, Ff et Af Accepteur et donneur mélangés Filtre Donneur Df Filtre FRET Ff Af Filtre Accepteur

42 La fuite spectrale et la nomenclature Les variables ayant une troisième lettre permettent de décomposer le signal Df Dfd: composante de Df provenant du donneur Dfa: composante de Df provenant de l accepteur Rappel : Le petit f signifie que l expérience est réalisée avec un mélange de donneur et d accepteur. Ff Ffd: composante de Ff provenant du donneur Ffa: composante de Ff provenant de l accepteur Af Afd: composante de Af provenant du donneur Afa: composante de Af provenant de l accepteur

43 La fuite spectrale Dfa de l accepteur dans le filtre Donneur (Ex donneur /Em donneur ) (souvent négligeable : si Da=0 alors Dfa=0) Df= Dfd + Dfa Excitation donneur Emission Donneur Longueur d onde (nm)

44 La fuite spectrale Ffd du donneur dans le filtre FRET (Ex donneur /Em accepteur ) (quasiment jamais négligeable: Ffd du même ordre que Ffa) Ff= Ffd + Ffa Excitation donneur Emission accepteur Longueur d onde (nm)

45 La fuite spectrale Afd du donneur dans le filtre Accepteur (Ex accepteur /Em accepteur ) (souvent négligeable: si Ad=0 alors Afd=0) Af= Afd + Afa Excitation accepteur Emission accepteur

46 Récapitulatif des fuites spectrales dans chacun des filtres Filtre Donneur Filtre FRET Filtre Accepteur Excitation du donneur Emission donneur Excitation du donneur Emission accepteur Excitation accepteur Emission Accepteur Df= Dfd + Ff= Ffd + Af= Afd + Dfa Ffa Afa fuites spectrales

47 Mesure et calcul de la fuite spectrale Dfa Excitation du donneur Filtre Donneur Df= Dfd + Filtre emission donneur Pour la fuite due à l accepteur dans le filtre Donneur, il faut acquérir les signaux dans le filtre Donneur et dans le filtre Accepteur en présence de l accepteur seul Da accepteur seul Aa Dfa / Afa = Da / Aa Dfa = Afa. (Da / Aa) Dfa fuites spectrales Filtre Donneur Filtre Accepteur

48 Mesure et calcul de la fuite spectrale Dfa Filtre Donneur Dfa / Afa = Da / Aa Df= Dfd + Dfa Dfa = Afa. (Da / Aa) La fuite spectrale est supposée être proportionnelle à la concentration du fluorophore et donc à Afa Da accepteur seul Aa Da 255 Filtre Donneur Filtre Accepteur Aa

49 Mesure et calcul de la fuite spectrale Ffd Excitation du donneur Filtre FRET Ff= Ffd + Filtre emission Accepteur Pour la fuite due au donneur dans le filtre FRET, Il faut acquérir les signaux dans le filtre Donneur et dans le filtre Accepteur en présence du donneur seul La fuite spectrale Ffd est supposée être proportionnelle à la concentration du fluorophore et donc à Dfd Ffa Dd donneur seul Fd 255 Fd Ffd / Dfd = Fd / Dd Ffd = Dfd. (Fd / Dd) Filtre Donneur Filtre FRET Dd

50 Mesure et calcul de la fuite spectrale Afd Filtre Accepteur Excitation accepteur Emission Accepteur Af= Afd + Afa Pour la fuite due au donneur dans le filtre Accepteur, il faut acquérir les signaux dans le filtre Donneur et dans le filtre Accepteur en présence du donneur seul. La fuite spectrale Afd est supposée être proportionnelle à la concentration du fluorophore et donc à Dfd Dd donneur seul Ad 255 Ad Afd / Dfd = Ad / Dd Afd = Dfd. (Ad / Dd) Filtre Donneur Filtre Accepteur Dd

51 Cas particulier : la fuite spectrale de l accepteur dans le filtre FRET (Ex donneur /Em accepteur ) (fréquente lorsque l excitation n est pas assez éloignée. ex: Arg 457nm) Ff= Ffd + Ffa Spectre d excitation de l accepteur Une fraction de l émission de l accepteur Ffa est due à une excitation directe (sans FRET) de l accepteur Excitation donneur Emission accepteur Longueur d onde (nm)

52 Mesure et calcul de la fuite spectrale incluse dans Ffa Excitation du donneur Filtre FRET Ff= Ffd + Filtre emission Accepteur Pour la fuite due à l accepteur dans le filtre FRET, il faut acquérir les signaux dans le filtre Accepteur et dans le filtre Fret en présence de l accepteur seul. Il faut introduire le terme Ffa_F correspondant l émission de l accepteur uniquement due au FRET : la fuite spectral est (Ffa-Ffa_F) Ffa Aa accepteur seul Fa Fa / Aa = coefficient de la fuite spectrale liée à une excitation directe de l accepteur dans le filtre FRET (Ffa Ffa_F) / Afa = Fa / Aa Ffa Ffa_F = Afa. (Fa / Aa) Filtre Accepteur Filtre FRET Ffa = Ffa_F + Afa. (Fd / Dd)

53 Récapitulatif du calcul des fuites spectrales pour chacun des filtres Df = Dfd + Dfa Df = Dfd + Afa. (Da / Aa) Equ. 1 Ff = Ffd + Ffa Ff= Dfd. (Fd / Dd) + Afa.(Fa/Aa) + Ffa_F Equ. 2 Af = Afd + Afa Af = Dfd. (Ad/Dd) + Afa Equ. 3

54 Le calcul du FRET Le FRET est défini par rapport à la perte d émission du donneur due à la «proximité» de l accepteur FRET=DfdSansFRET Dfd Def. 1 Dfd : Émission mesurée du donneur dans le filtre Donneur en présence de l accepteur DfdSansFret : Émission théorique du donneur dans le filtre Donneur en présence de l accepteur si il n y avait aucun FRET DfdSansFret est proportionnel à la concentration du donneur mais DfdSansFret n est pas directement mesurable!

55 Le calcul du FRET par la méthode «sensitize emission» FRET=DfdSansFRET Dfd Rappel Def. 1 Comment faire si DfdSansFret n est pas directement mesurable? On mesure l émission de l accepteur provenant de ce transfert (Ffa_F) Il faut cependant aussi utiliser un coefficient G qui prend en compte les différences entre une mesure de l accepteur et l émission équivalent du donneur. Ce coefficient prend donc en compte les rendements quantiques des fluorophores et les coefficients de transmission des filtres. FRET = (Ffa_F)/G Def. 2 DfdSansFRET = Dfd + (Ffa_F)/G Equ. 4 Ff= Dfd. (Fd / Dd) + Afa.(Fa/Aa) + Ffa_F Rappel Equ. 2

56 L efficacité de FRET Nomenclature classique : E=1 F DA /F D E=(F D F DA )/F D 1 E= 1+(R/Ro ) 6 F DA =Dfd : Fluorescence du donneur en présence d accepteur F D =DfdSansFret : Fluorescence du donneur en absence d accepteur E=Eff_FRET : nombre d événements de transfert normalisés par le nombre de photons absorbés par le donneur R : distance entre le donneur et l accepteur Def. 3 Ro : Distance critique de Forster Eff_FRET=(FRET)/DfdSansFRET Eff_FRET=(DfdSansFRET Dfd)/DfdSansFRET Eff_FRET = equ. 5 equ. 6 Ffa_F G.Dfd + Ffa_F

57 Le calcul du FRET Si toutes les fuites spectrales sont prises en compte, on peut à partir des 3 images Df, Ff et Af, calculer le l eeficacité de FRET à l aide d une une équation compliquée mais rigoureuse : FRET = Ff (Fd/Dd)Df [Af (Ad/Fd)Ff]/[(1 (Fa/Aa)(Ad/Fd)].[(Fa/Aa) (Fd/Dd)(Da/Aa)] G[1 (Da/Fa)(Fd/Dd)] Dfd_sansFRET = Df + FRET [1 G(Da/Aa)] [Af (Ad/Fd)Ff]/[1 (Fa/Aa)(Ad/Fd)](Da/Aa)] Eff_FRET=FRET/Dfd_sansFRET Rappel Def. 3

58 Le calcul du FRET dans un cas particulier 1 Cas simplifiant l équation du calcul de FRET : 2. Certaines fuites spectrales peuvent être quasi nulle 3. Avoir une concentration de l accepteur proportionnelle au donneur 4. Utiliser moins de filtres (nécessite 1 et/ou 2) Si les fuites Da et Ad sont nulles alors Dfd = Df et Ffa_F=Ff (Fd/Dd)Df (Fa/Aa).Af Alors d après Def.2 FRET = Ff (Fd/Dd)Df Af.(Fa/Aa) G (Equation équivalente à celle de Youvan et coll (1997)) Eff_FRET = 1 G.Df G. Df + Ff-(Fd/Dd).Df-(Fa/Aa).Af

59 Cas simplifiant l équation du calcul de FRET : Certaines fuites spectrales sont nulles Donneur seul (CFP) Ex 517, Em 528 Ex 436, Em 488 Ex 436, Em 528 Dd Fd Ad Ad=0 Filtre Donneur Filtre FRET Filtre Accepteur Accepteur seul (YFP) Ex 517, Em 528 Ex 436, Em 488 Ex 436, Em 528 Da Da=0 Fa Aa

60 Le calcul du FRET dans un cas particulier 2 Autre cas particulier où : 2. Les fuites spectrales Da, Ad et Fa sont nulles (alors Dfd = Df et Ffa_F = Ffa ) 3. La concentration de l accepteur est égale au donneur (ex: ecfp_calmoduline_yfp)) Dans ce cas il n est pas nécessaire d utiliser 3 filtres Les filtres Donneur (Df) et FRET (Ff) suffisent : On a donc Ffa_F = Ff (Fd/Dd).Df et d après equ.6 Eff_FRET=Ffa_F/(G.Df+Ffa_F) On obtient alors : Eff_FRET = Ff (Fd/Dd).Df G.Df+Ff (Fd/Dd).Df Ff/Df Fd/Dd Eff_FRET = G + Ff/Df Fd/Dd

61 Le calcul du G Dans ce dernier cas particulier (Da, Ad sont nulles et Ffa_F = Ffa) avec une concentration de l accepteur égale à celle du donneur, le coefficient G peut être calculé en mesurant pour une même cellule (concentration de la sonde constante) deux proportions de FRET différentes. Cela peut être réalisé en photo blanchissant (partiellement) l accepteur d une cellule. Avant et après, la concentration du donneur reste constante, on peut donc écrire: Dfd_sansFRET_après = Dfd_sansFRET_avant et d après équ. 4 Dfd_sansFRET_avant = Df_avant + (Ffa_avant)/G Dfd_sansFRET_après = Df_après + (Ffa_après)/G G.Df_après +Ffa_après = G.Df_avant + Ffa_avant G = Ffa_avant Ffa_après Df_après Df_avant

62 Calcul et Mesure du G <FfaAP> G = Ffa_BP Ffa_AP Df_AP Df_BP = 1.32 Stockholm D, Bartoli M, Sillon G, Bourg N, Davoust J, Richard I. Imaging calpain protease activity by multiphoton FRET in living mice. J Mol Biol Feb 11;346(1):215-22

63 Le calcul du G Le coefficient G peut aussi être calculé à partir d un échantillon standard dont l efficacité de FRET est déjà connu. Ff (Fd/Dd)Df Eff_FRET = En partant de l équation : G.Df + Ff (Fd/Dd)Df On obtient : G.Df = (Ff (Fd/Dd)Df) + Ff (Fd/Dd)Df Eff_FRET G = G = Eff_FRET.(Ff (Fd/Dd)Df) + Ff (Fd/Dd)Df Eff_FRET. Df (1 Eff_FRET).(Ff (Fd/Dd)Df) Eff_FRET. Df G = (1/Eff_FRET 1).(Ff/Df Fd/Dd)

64 Conclusion 1. La mesure du Fret par la détection d émission de fluorescence à l état stationnaire nécessite un équipement relativement classique : microscopie à épi fluorescence avec caméra CCD microscopie confocale 2. Une des difficultés est la prise en compte de toutes les fuites spectrales. 3. L autre grande difficulté de cette technique est l hétérogénéité des concentrations des fluorophores.

65 FRET par mesure de la durée de vie de fluorescence (FLIM) Aude Jobart-Malfait Plateforme de recherche «Imagerie des processus dynamiques en Biologie Cellulaire et Biologie du Développement» IFR 117 Institut Jacques Monod Tel: Durée de vie de fluorescence Excitation, désexcitation, processus radiatifs et non radiatifs hν Excitation d un fluorophore 1

66 Durée de vie de fluorescence Excitation, désexcitation, processus radiatifs et non radiatifs Passage à l état excité hν Excitation d un fluorophore Durée de vie de fluorescence Excitation, désexcitation, processus radiatifs et non radiatifs hν hν Excitation d un fluorophore Retour à l état fondamental Processus radiatifs Émission de photons 2

67 Durée de vie de fluorescence Excitation, désexcitation, processus radiatifs et non radiatifs hν hν Excitation d un fluorophore Retour à l état fondamental Processus non radiatifs (FRET, quenching, conversion etc) Pas d émission de photons Durée de vie de fluorescence Excitation, désexcitation, processus radiatifs et non radiatifs Passage à l état excité hν hν Excitation d un fluorophore Retour à l état fondamental Processus radiatifs (émission de photons) Processus non radiatifs (FRET, quenching, conversion ) La somme des processus de désexcitation définit une probabilité de retour à l état fondamental Sans évolution de l environnement, cette probabilité est constante au cours du temps 3

68 Durée de vie de fluorescence Aspect dynamique Puisqu il s agit d une probabilité, le temps de rémanence à l état excité est variable selon les molécules t 1 t2 t3 temps hν hν A chaque instant, chacune des molécules à l état excité «a le choix» entre rester à l état excité ou bien retourner à l état fondamental La durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu une molécule reste à l état excité A l échelle de cette population (n=3) la durée de vie est τ = ( t ( 1 + t 2 + t 3 )/3 Durée de vie de fluorescence A l échelle d une population Ce qui nous intéresse : t de toute les molécules passées à l état excité.. Représentation sous forme d histogramme : combien de molécule sont restées un temps t 1, t 2, t 3 etc à l état excité Nb de molécules Log (Nb de molécules) Temps ( t) k Temps ( t) τ = 1/k K=constante cinétique du processus de désexcitation τ=durée de vie de fluorescence A chaque instant, la proportion de molécule retournant à l état excité est la même, N=N o.e -kt La représentation sous forme semi log permet d obtenir k et τ = 1/k 4

69 Constante cinétique de désexcitation Processus radiatifs et non radiatifs Kr : intrinsèque au fluorophore hν Knr : fonction de l environnement FRET, quenching, conversion etc K = Kr + Knr La constante cinétique de désexcitation (K) est la somme des constantes cinétiques radiatives (Kr) et non radiatives (Knr) Pour un même fluorophore une modification de K signifie une modification de Knr Comment déterminer le nombre de molécules à l état excité? A chaque instant, la proportion de molécules retournant à l état fondamental est la même. t1 t2 temps Knr Kr Knr Kr 1/6 1/3 1/6 1/3 Le nombre de photons émis est proportionnel au nombre de molécules à l état excité K et donc τ peuvent donc être déterminés à partir du nombre de photon émis Log (Nb de molécules) τ = 1/k k Log (Nb de photons) τ = 1/k k Temps ( t) Temps ( t) 5

70 Apport de la durée de vie de fluorescence Les images réalisées sur les systèmes conventionnels sont des images d intensité t1 Knr Kr t2 Knr Kr temps 1/6 1/3 1/6 1/3 log I 0 /I I int k = 1 / τ t L aire sous la courbe correspond à l intensité stationnaire Récupération d une fenêtre figée de la dimension temporelle -> information d intensité Perte de l information temporelle, pas de possibilité de récupérer la durée de vie. Apport de la durée de vie de fluorescence Interprétation des phénomènes de variation d intensité K = K + Knr 1/6 Knr Kr 1/3 1/6 Knr Kr 1/3 Kr : intrinsèque au fluorophore Knr : fonction de l environnement Variation de l intensité de fluorescence? Variation de concentration du fluorophore 6

71 Apport de la durée de vie de fluorescence Compréhension des phénomènes de variation d intensité t1 t2 temps K = K + Knr Kr : intrinsèque au fluorophore Knr Kr Knr Kr Knr : fonction de l environnement 1/6 t1 1/3 1/6 t2 1/3 temps L augmentation de Knr entraîne une diminution du nombre de molécules à l état excité mais le nombre de molécules de fluorophore est le même! Knr Kr Knr Kr Knr dépend d environnement du fluorophore, il peut varier par : FRET, quenching, conversion 1/4 1/3 1/4 + 1/3 Lorsqu on connaît la durée de vie on s affranchit de ce type de problème. Ici : la durée de vie diminue Apport de la durée de vie de fluorescence log I 0 /I I int L aire sous la courbe correspond à l intensité stationnaire Variation de l intensité de fluorescence k t = 1 / τ K = K + Knr Kr : intrinsèque au fluorophore Knr : fonction de l environnement Variation de concentration du fluorophore Variation des propriétés du fluorophore Variation de la durée de vie de fluorescence (indépendant de la concentration) environnement de la sonde Quenching FRET Variation ph.. etc 7

72 Apport de la durée de vie de fluorescence A B * * Mesure Log(Nombre de photons) A 4 B 6 8 Delay 10 ( t) τ = 2,4 ns ns Mesure Déclin de fluorescence de l egfp en cellules vivantes Les durées de vie sont égales et l environnement du fluorophore est identique. La différence d intensité peut être interprétée comme une différence de concentration du fluorophore Apport de la durée de vie de fluorescence Log(Nombre de photons) Canaux temporels (45 ps/canal) Déclin de l éthidium en cellules vivantes Les durées de vie sont différentes, et l environnement du fluorophore est différent. La différence d intensité ne peut pas être interprétée comme une différence de concentration du fluorophore 8

73 Mesure de la durée de vie de fluorescence De quoi avons nous besoin: Récupération pour chaque photon d un t et de la position X, Y. Différentes stratégies : Dans tout les cas il faut une source lumineuse capable d envoyer des pulses beaucoup plus courts que la durée de vie (quelques picosecondes en général) Gated Camera t1 t2 temps 1/6 Knr Kr 1/3 Knr 1/6 Kr 1/3 Log(Nombre de photons) t1 t3 t2 etc temps L information temporelle est récupérée par la réalisation d une série d image ultra rapide (100 ps). Plusieurs intégrations sont nécessaires pour obtenir un échantillonnage satisfaisant On obtient la durée de vie de fluorescence en tout point de l image Streak Camera Mesure de la durée de vie de fluorescence Streak La cordonnée Y est perdue au profit de la récupération de l information temporelle L image se fait selon une seule dimension spatiale X On obtient la durée de vie de fluorescence en tout point de l axe X Système LIMO (Lifetime Imaging MOdule) Système de 4 fenêtres temporelles On obtient la durée de vie de fluorescence en tout point de l image Log ( Nb de photons) t1 t2 t3 t4 temps 9

74 Mesure de la durée de vie de fluorescence TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting) Comptage de photons uniques corrélés en temps Récupération de l information temporelle : hν hν laser temps start t 1 stop A chaque pulse laser on récupère au maximum le t d un seul photon, permettant de construire l histogramme du déclin de fluorescence La fréquence de répétition permet de récupérer jusqu à photons par seconde Mesure de la durée de vie de fluorescence TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting) Comptage de photons uniques corrélés en temps Récupération de l information X, Y : Sur un confocal : l information X, Y est donnée par la position des galvanomètres L information temporelle ( t) est donnée par une carte TCSPC Obtention de la durée de vie pour chaque pixel de l image 10

75 Mesure de la durée de vie de fluorescence TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting) Comptage de photons uniques corrélés en temps En microscopie plein champ, le détecteur utilisé doit nous permettre de récupérer l information spatiale et temporelle Laser Quadrant-anode hν MCP1 Photocathode e- PD Time Le photo-électron est amplifié en une avalanche d électrons par les deux MCPs. Q 1 MCP2 charge Q 2 Le ratio des charges obtenues sur les anodes permet d obtenir la position X, Y du photon incident Q 4 Q 3 Système Quadrant-Anode (QA) Montage session pratique Laser λ excitation 380 nm nm Photodiode Électronique QA Acquisition QA Pulse picker Doubleur de fréquence Laser Ti-Sa Microscope Laser de pompe Excitation plein champ Numbre de photons Temps (ns)

76 Durées de vie des protéines de fusion Number of photons GFP CFP YFP BFP DsRed Protein τ 1 (ns) a 1 τ 2 (ns) a Time (ns) GFP 2,6 1 CFP 3,4 0,6 1,3 0,4 YFP 3,1 1 BFP 2,7 0,15 0,4 0,85 DsRed 3,5 1 Séparation de fluorophores spectralement proches Imagerie de durée de vie de fluorescence (FLIM) 10 La contribution des durées de vie τ 1 et τ 2 en chaque pixel de l image permet de séparer l egfp et la YFP TK-GFP t 1 = 2.5 ns 10 t 2 = 2.9 ns Actin-YFP a 1 a

77 Pourquoi la durée de vie permet d effectuer des mesures de FRET? Knr FRET t1 t2 temps k FRET Kr Donneur Accepteur 1/6 Knr Kr 1/3 1/6 Knr Kr 1/3 t1 t2 temps Lorsqu il y a du FRET, le FRET s ajoute au autres processus non radiatifs Knr = Knr + KFRET La durée de vie diminue Knr Kr Knr 1/4 1/3 1/4 +.. Kr 1/3 Knr = Knr + K FRET Mesure expérimentale du FRET par durée de vie Knr kr Déclins de fluorescence du donneur Donor Fluorescence log I 0 /I = 1 / τ D k D k D = k r + k nr k DA = 1 / τ DA k DA = k r + k nr + k FRET Knr FRET Kr k FRET Donor Fluorescence Acceptor Fluorescence La comparaison du déclin de fluorescence du donneur en absence et en présence de l accepteur permet de révéler l existence de FRET 13

78 Mesure de durée de vie et concentration du donneur et de l accepteur t1 t2 temps log I 0 /I Knr 1/6 Kr 1/3 Knr 1/6 Kr 1/3 t1 t2 temps La mesure de durée de vie est indépendante de la concentration La mesure de FRET ne sera pas modifiée par la concentration du donneur et de l accepteur Knr 1/6 Kr 1/3 Knr 1/6 Kr 1/3 Mesure de FRET et proportion de molécules en interaction Cas d un donneur mono-exponentiel (GFP) Kr Kr Knr Kr Knr Knr log I 0 /I 100 % des molécules du donneur libre K DA = K D = Kr+Knr Déclin mono-exponentiel K FRET K FRET Kr Knr Kr Knr K FRET log I 0 /I 100 % des molécules du donneur en interaction K DA = Kr+Knr+K FRET Déclin mono-exponentiel Kr Knr Kr K FRET Knr Kr Kr Knr Knr log I 0 /I 1/3 des molécules du donneur en interaction K DA = Kr+Knr+K FRET 2/3 des molécules du donneur libre Déclin bi-exponentiel La contribution des exponentielles au déclin de fluorescence donne la proportion de molécule en interaction 14

79 Mesure de FRET et proportion de molécules en interaction Cas d un donneur bi-exponentiel (CFP) Kr Kr Knr Kr Knr Knr log I 0 /I 100 % des molécules du donneur libre Déclin bi-exponentiel Obtention d une durée de vie moyenne K FRET K FRET Kr Knr Kr Knr K FRET Kr Knr log I 0 /I 100 % des molécules du donneur en Déclin bi-exponentiel..?? Obtention d une durée de vie moyenne plus courte Kr K FRET Knr Kr Kr Knr Knr log I 0 /I 1/3 des molécules du donneur en interaction 2/3 des molécules du donneur libre Déclin multi-exponentiel! Tri ou quadri..?? Obtention d une durée de vie moyenne plus courte Distance entre deux chromophores mesurée par la durée de vie du donneur Pour un donneur mono-exponentiel qui transfère son énergie, il est possible de déterminer une distance d interaction Pour un couple il est possible de calculer le Ro, c à d la distance entre les fluorophores pour laquelle 50 % des molécules excitées se désexcitent par transfert d énergie (calcul du Ro : cf cours sur le choix du couple..) Efficacité transfert % E = τ DA /τ D = 1 / (1+(R/R 0 ) 6 ) R 0 = 44 Å 80 R (Angström) Å 24 A d 20 A Plus la distance sera élevée, moins grande sera l efficacité de transfert Le calcul de cette distance repose sur une orientation aléatoire des fluorophores (k 2 =2/3) 15

80 FRET entre GFP-H2B et l éthidium intercalé dans l ADN après traitement à la digitonine GFP-H2B GFP-H2B GFP-H2B Digitonin 50mg/ml EB 1mg/ml Photon number GFP-H2B Digitonin 50mg/ml EB 10mg/ml 15 GFP-H2B Digitonine 50mg/ml ns GFP-H2B Digitonine 50mg/ml EB 10mg/ml GFP-H2B t1 (ns) 2.60 ± 0.04 GFP-H2B+digit 2.64 ± 0.07 GFP-H2B+digit EB 10mg/ml GFP-H2B+digit EB 1mg/ml a1(%) t2 (ns) a2(%) t3 (ns) 1.05 ± a3(%) 2.67 ± ± <0.01 4<n<8 97 Étude dynamique par FRET de l interaction entre GFP-H2B et l ethidium intercalé dans l ADN en présence de digitonine GFP-H2B GFP-H2B FRET contributions (%) Intercalated ethidium X Time (min) 16

81 Mesure de FRET avec le couple GFP-DsRed Fluorescence intensity (%) Wavelength (nm) GFP exc GFP em DsRed exc DsRed em Laser exc Emission filter ε (10 3 M -1 cm -1 ) Wavelength (nm) Fluorescence intensity (au) R 0 = 47 Å Mesure d interaction protéine-protéine Nop52-GFP et B23-DsRed N. Angelier, M. Tramier, D. Hernandez (IJM) 17

82 Étude dynamique du FRET au cours de la mitose Angelier et al., Mol Biol Cell Jun;16(6): La mesure du FRET par la durée de vie de fluorescence Quelques avantages et inconvénients Possibilité d étude dynamique Complexité de la mise en oeuvre Selon les techniques, lenteur de l acquisition Difficultés particulières selon les fluorophores 18

83 Mesure du FRET par les techniques de photo-blanchiment Frédéric Brau

84 Introduction Il existe de nombreuses techniques pour mesurer le FRET. Il est possible de les diviser sommairement en deux catégories selon l instrumentation qu elles nécessitent : celles qui utilisent des systèmes spécialisés comme le FLIM ou les mesures d anisotropie et celles qui peuvent être mise en oeuvre sur des microscopes à épi-fluorescence conventionnels. Les méthodes de photo-blanchiment appartiennent à cette seconde catégorie, et sont cependant facilitées par l emploi de systèmes (confocaux) à balayage laser pour cibler la photo destruction. Le Photo-blanchiment «Processus lors duquel une molécule est rendue non fluorescente» (Diaspro A, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd edition). Ceci peut être causé par photolyse ou la liaison des fluorophores excités avec des molécules proches. Le processus initiateur est une photooxidation. Le Photo-blanchiment est un phénomène irréversible qui se distingue du «photocycling» (passage par un état noir) ou du «blinking» (alternance d états éteints - allumés). Remarque : il peut arriver qu une macromolécule cible soit saturée de fluorophores, et que ceux-ci s annihilent entre eux par «quenching». L illumination de ces molécules va générer du photo-blanchiment libérant cette inhibition, ce qui va avoir pour conséquence un rehaussement de la fluorescence. Description du phénomène Les fluorophores à l état excité vont interagir avec l oxygène triplet (à l état fondamental) dissout dans le milieu. Ceci d autant mieux que la molécule a l état excité S* aura un rendement élevé pour un transfert inter-système à l état Triplet T* dont la durée de vie est supérieure. T *+ 3 O S+ 1 O 2 2 Le modèle le mieux étudié en microscopie est la molécule de fluorescéine, dont le comportement au photoblanchiment ne peut se réduire à un modèle de décroissance monoexponentielle déduit de la réaction bimoléculaire du 1 er ordre ci-dessus. d[f*] = k dt d [F*][O 2 ] k d [O 2 ] si[o 2 ] = cste pendant le photoblanchiment alors [ F*](t) = [F*]e t F* est considéré dans ce cas comme T* ou S*, indifféremment. Les modèles ayant le mieux décrit le phénomène à l échelle mono-moléculaire prennent en compte toutes les étapes de transition entre les états excités depuis l absorption photonique et comprennent 4 à 5 étapes selon la bibliographie. Le nombre de photons émis avant la photo-destruction de la molécule va dépendre de deux facteurs : les propriétés intrinsèques de la molécule et l environnement, en particulier l accessibilité à l oygène. Ceci explique par exemple la relative photo-stabilité de la protéine GFP dont le chromophore est protégé de l O 2 dissout dans le milieu dans une structure en «tonneau».

85 Mesure par photo-blanchiment de l accepteur Principe à l'échelle moléculaire λ D ex λ A ex λ D ex i e = 1 i DA D i = Dpostbleach i i Dpostbleach Dprebleach = 6 R0 R + r Séquence d acquisition des 4 images : Image des Donneurs λ D ex Images des Accepteurs λ A ex Photo-blanchiment Accepteurs λ A ex Image Accepteurs λ A ex contrôle du photo-blanchiment Image Donneurs λ D ex A l'échelle microscopique : mesure du FRET apparent λ D ex Avant λ D ex Après I D I D I A I I Dpostbleach I DA Dprebleach % E = 1 = = f ( e, nfret ) I D I Dpostbleach Avec n FRET : fraction de donneurs qui interagissent avec des accepteurs pour donner du FRET. Exemple 1 : comparaison CFP-YFP avec mutant de la GFP : GFP2-YFP (Zimmermann T et al., 2002)

86 Exemple 2 : Mesures de FRET avec des fluorochromes couplés à des AcI re Image du Donneur avant photo - blanchiment de l accepteur Image Donneur après photo - blanchiment de l accepteur %Fret DR-DR DR-X DR-Y DR-Z DR seul n=9 n=9 n=13 n=4 n=21 Contrôle positif : Images de HLA-DR marqué par AcI re -FITC et AcI re -Alexa568 (excitation : 488nm, mesure de l émission : 522BP35) Contrôle négatif : séquence HLA-DR seul Remarques : - Le photo-blanchiment du Donneur doit être complet, faute de quoi, les erreurs (Berney C et al., 2003) de mesure sont importantes. - Il faut vérifier que le Donneur n est pas éteint par inadvertance à λ exa, par un contrôle avec le Donneur seul, y compris lors de la capture de son image. Ceci oblige à faire l hypothèse selon laquelle les caractéristiques de photo-blanchiment de D seul et D en presence de A sont identiques (ce n est pas forcement vrai, dans la mesure ou le FRET modifie la sensibilité au photoblanchiment). Analyse de la distribution des marqueurs Efficacité du transfert (%) Distribution Aléatoire E=f(D S A) E 0 lorsque D S A 0 Distribution en Mélange «clusters» E=f(D :A) E=f(D S A) E=f(D :A) Fluorescence de l accepteur

87 Une augmentation de la densité de surface en accepteur aura pour conséquence une diminution de la distance entre molécules adjacentes, donc une possibilité de transfert d E accrue. Le graphe reflète une distribution aléatoire des marqueurs (d après Kenworthy, A.K. et al., 2000). Modèle de dépendance du transfert d énergie en fonction de la densité locale de surface et du rapport D :A (d après Wallrabe, H. et al., 2003) : A et B : Modèle de cluster parfait : toutes les places au voisinage direct d un donneur D sont occupées (s=1), seul le rapport D :A influe sur le % de transfert. C-D : modèle à densité locale de surface fixe avec 0<s<1. Le % de transfert diminue avec : - l augmentation du rapport D :A dans le cas d un cluster - et une diminution de la densité locale de surface (s) lorsque celle-ci est 0<s<1. N : nombre d accepteurs au voisinage du donneur. S : densité de surface locale des complexes D-A (s=s A +s D ) Les deux techniques de photo- blanchiment sont complémentaires : il est possible d effectuer sur la même préparation les deux séquences : photo-blanchiment de l accepteur, puis cinétique de photo-blanchiment du donneur (cas contrôle donneur seul). Ces méthodes sont plutôt conseillées pour des échantillons fixés, ou des préparations vivantes dans lesquelles les mouvements des protéines sont lents par rapport au temps de l'acquisition. Mesure par cinétique de photo blanchiment du donneur ("pbdim" : photobleaching Digital Imaging Microscopy - Bastiaens, P.I.H. et al. 1996) Modélisation de l'émission de fluorescence en tenant compte du processus de photo blanchiment (d'après Young, R.M. et al., 1994). Le photo-blanchiment est la conversion irréversible de l'état excité du fluorophore D* en une molécule non fluorescente X : k a k D D * bl X k + k R nr

88 d[ D] = ( k + k dt R d[ D*] = k [ D] dt a I F ( t) = k R [ D*] )[ D*] k [ D] nr a ( k + k + k )[ D*] R nr bl On suppose, dans ce cas théorique : - que la réaction est pseudo-stationnaire pour D*, dans le cas d'une illumination constante et modérée. - Que toutes les molécules se comportent de la même manière. d[ D*] = 0 dt k a Ce qui permet de résoudre le système d'équations en remplaçant [ D*] = [ D] k + k + k R nr bl k k a bl t ka[ D] k + k + k On obtient I k e R nr bl F ( t) = 0 R qui est de la forme kr + knr + kbl t τ I t I e app k R + knr + kbl F ( ) = F (0) avec τ app = constante apparente de décroissance de kakbl la fluorescence lorsqu'il y a photo blanchiment. Cette durée apparente de photo blanchiment est beaucoup plus lente (de l'ordre de plusieurs secondes) par rapport à l'absorption (10-15 s), au temps de vie de l'espèce à l'état excité (10-10 s à 10-7 s), aux phénomènes de "quenching". Par exemple pour le FITC k app = 1s -1, k nr = 1, s -1, k R =10 8 s -1, k a =0,015 s -1, on peut en déduire k bl = 170s -1 << k app, k nr, k R, k a et simplifier les expressions de τ app et I F. k k a bl t k + k R nr k R + knr ka[ D] τ app et I e kak F ( t) k 0 R bl kr + knr Cas où la proportion des phénomènes non-radiatifs augmente : cas du FRET k ' nr = k nr + k FRET k R + k' nr k R + knr Donc τ appda > τ appd kakbl kakbl La cinétique de photo - blanchiment d une molécule transférant son énergie à un accepteur est donc plus lente : ka[ D] 0 ka[ D] 0 De même, I F (0) D k R > I F (0) DA k k R R + knr kr + k' nr

89 E = 1 τ τ b appd b appda = k Expérimentalement, si l'on considère une population hétérogène de Donneurs et d'accepteurs, la vitesse de photo-blanchiment est également dépendante : - des paramètres environnementaux, de l oxygène - de la proportion de Donneurs seuls par rapport à ceux qui transfèrent leur énergie Dans ce cas, l intensité de fluorescence peut s exprimer comme la somme des contributions des émissions des Donneurs seuls et des couples Donneurs-Accepteur. I F ( t) t F k + k F R + k τ appda = I αe + I (1 α) DA où α et 1-α sont respectivement les fractions molaires des couples DA et de D seul Exemple : Donneur AcI re -FITC et Accepteur AcI re -Rhodamine (Patel R.C. et al, Methods. 2002) D nr e t τ appd Acquisition d une série de 20 images toutes les 4s du fluorophore donneur FITC Distribution des temps de relaxation calculés à partir de la série d image, pour chaque pixel (dans une zone définie par un masque) après approximation par une fonction monoexponentielle. Donneur seul : τ b appd moyen = 18s Donneur +Accepteur : τ b appda moyen = 27,6s Evaluation de la qualité de l approximation mono-exponentielle (à partir de la valeur moyenne de l intensité sur une zone d intérêt en fonction du temps).

90 Mesure par photo-blanchiment graduel de l accepteur (et techniques mixtes) (Van Munster, et al., 2005) Il est possible d aborder la stratégie de photo-blanchiment sur un couple Donneur- Accepteur sous plusieurs angles 1) La vitesse de photo blanchiment du Donneur est directement liée au temps de vie de la molécule à l état excité. Photoblanchir le Donneur et observer simultanément le comportement de l Accepteur (à λ exd ) permet de distinguer le processus d émission stimulée de l excitation directe de l accepteur (Fluorescence résiduelle de A après photoblanchiment complet de D). Ceci nécessite que l Accepteur soit plus photo-stable que le Donneur. Par cette mesure il va être possible d accéder au % de Donneurs transférant leur énergie( Clayton AH, et al., 2005). Détection du photo-blanchiment du Donneur I F D(t) = I DA αe t τ appda + I D (1 α)e t τ appd Détection de l Accepteur en simultané : I F A(t) = I A FRET e t τ FRET +αi D + βi A 2) Le suivi du photo-bleaching de l accepteur en réponse à l excitation du Donneur, avec un accepteur plus photo-stable que l Accepteur. 3) Le photoblanchiment direct et (qui doit être) complet de l accepteur en observant la fluorescence du Donneur : supprime le phénomène de FRET et rétablit la fluorescence du Donneur qui était captée par le FRET. Une alternative combinant ces méthodes est de mesurer l intensité du Donneur simultanément au photoblanchiment de l Accepteur.

91 Avantages : - Possibilité de détecter un photoblanchiment du Donneur par inadvertance - Eviter une incertitude sur le photoblanchiment de l Accepteur. Hypothèses : -Photo-blanchiment identique sur D seul ou D lié à A. -stoechiométrie A :D est 1 :1 au maximum. Dans ce cas l efficacité du FRET est directement proportionnelle à la quantité d Accepteurs. Simulation des conditions sur la courbe cicontre. Bibliographie Bastiaens PI, Majoul IV, Verveer PJ, Soling HD, Jovin TM. Imaging the intracellular trafficking and state of the AB5 quaternary structure of cholera toxin. EMBO J Aug 15;15(16): Bastiaens PI, Jovin TM. Microspectroscopic imaging tracks the intracellular processing of a signal transduction protein: fluorescent-labeled protein kinase C beta I. Proc Natl Acad Sci U S A Aug 6;93(16): Berney C, Danuser G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophys J Jun;84(6): Clayton AH, Klonis N, Cody SH, Nice EC. Dual-channel photobleaching FRET microscopy for improved resolution of protein association states in living cells. Eur Biophys J Feb;34(1): Diaspro A; Handbook of Biological Confocal Microscopy Third Edition,, James B. Pawley editors, p690. Gadella TW Jr, Jovin TM. Oligomerization of epidermal growth factor receptors on A431 cells studied by time-resolved fluorescence imaging microscopy. A stereochemical model for tyrosine kinase receptor activation. J Cell Biol Jun;129(6): Karpova TS, Baumann CT, He L, Wu X, Grammer A, Lipsky P, Hager GL, McNally JG. Fluorescence resonance energy transfer from cyan to yellow fluorescent protein detected by acceptor photobleaching using confocal microscopy and a single laser. J Microsc Jan;209(Pt 1): Kenworthy AK. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods Jul;24(3):

92 Kenworthy AK, Petranova N, Edidin M. High-resolution FRET microscopy of cholera toxin B-subunit and GPI-anchored proteins in cell plasma membranes. Mol Biol Cell May;11(5): Kenworthy AK, Edidin M. Distribution of a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein at the apical surface of MDCK cells examined at a resolution of <100 A using imaging fluorescence resonance energy transfer. J Cell Biol Jul 13;142(1): Kubitscheck U, Kircheis M, Schweitzer-Stenner R, Dreybrodt W, Jovin TM, Pecht I. Fluorescence resonance energy transfer on single living cells. Application to binding of monovalent haptens to cell-bound immunoglobulin E. Biophys J Aug;60(2): Kubitscheck U, Schweitzer-Stenner R, Arndt-Jovin DJ, Jovin TM, Pecht I. Distribution of type I Fc epsilon-receptors on the surface of mast cells probed by fluorescence resonance energy transfer. Biophys J Jan;64(1): Patel RC, Lange DC, Patel YC. Photobleaching fluorescence resonance energy transfer reveals ligand-induced oligomer formation of human somatostatin receptor subtypes. Methods Aug;27(4): Patel RC, Kumar U, Lamb DC, Eid JS, Rocheville M, Grant M, Rani A, Hazlett T, Patel SC, Gratton E, Patel YC. Ligand binding to somatostatin receptors induces receptor-specific oligomer formation in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A Mar 5;99(5): Song L, van Gijlswijk RP, Young IT, Tanke HJ. Influence of fluorochrome labeling density on the photobleaching kinetics of fluorescein in microscopy. Cytometry Mar 1;27(3): Van Munster EB, Kremers GJ, Adjobo-Hermans MJ, Gadella TW Jr. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurement by gradual acceptor photobleaching. J Microsc Jun;218(Pt 3): Wallrabe H, Elangovan M, Burchard A, Periasamy A, Barroso M. Confocal FRET microscopy to measure clustering of ligand-receptor complexes in endocytic membranes. Biophys J Jul;85(1): Wouters FS, Bastiaens PI, Wirtz KW, Jovin TM. FRET microscopy demonstrates molecular association of non-specific lipid transfer protein (nsl-tp) with fatty acid oxidation enzymes in peroxisomes. EMBO J Dec 15;17(24): Young RM, Arnette JK, Roess DA, Barisas BG. Quantitation of fluorescence energy transfer between cell surface proteins via fluorescence donor photobleaching kinetics. Biophys J Aug;67(2): Zimmermann T, Rietdorf J, Girod A, Georget V, Pepperkok R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett Nov 6;531(2):245-9.

93 Formation INSERM FRET avril 2007 HomoFRET par déclin d anisotropie et mesure de FRET par polarisation Marc Tramier Institut Jacques Monod, Paris 1. Anisotropie et photosélection des fluorophores à l excitation définit par La mesure de l anisotropie de fluorescence, r, est illustrée figure II. 13. Elle se r = (I // - I ) / (I // + 2 I ) (II. 3. 1) où I // et I correspondent à l intensité de fluorescence émise dont la polarisation est respectivement parallèle et perpendiculaire à la polarisation de la lumière d excitation. En d autres termes, c est aussi le rapport entre la différence de ces deux intensités caractéristiques de l anisotropie et l intensité totale. En effet, le dénominateur correspond à la somme des intensités suivant les trois axes de l espace, I x, I y et I z (Fig. II. 13). Dans le cas où la lumière d excitation est polarisée suivant I z, on a I x = I y = I. L équation II s écrit aussi r = (I z I x ) / (I x + I y + I z ) = (I z I x ) / I T (II. 3. 2) où I T, l intensité totale, est indépendante des effets de polarisation. Dans le cas d une lumière complètement polarisée, comme la diffraction d une lumière polarisée, I = 0 et r = 1. Cette valeur maximale n est jamais trouvée pour la fluorescence. A cause de la dépendance angulaire de la photosélection à l excitation, les valeurs sont plus petites. z échantillon x y excitation Figure II. 13 : Représentation géomérique de la mesure d anisotropie. I // I détection

94 On peut exprimer r sous une autre forme. La figure II. 14 présente le fluorophore sous la forme d un dipôle oscillant représenté par un vecteur formant un angle θ avec z et un angle φ avec x dans le plan (xy). z Cos θ θ x Sin θ Cos φ φ I // = Cos 2 θ I = Sin 2 θ Cos 2 φ Sin θ y Figure II. 14 : Anisotropie de fluorescence d un dipôle. Le dipôle fait un angle θ avec l axe z et un angle φ avec l axe x dans le plan (x, y). L intensité récoltée suivant l axe x et z correspond au carré de la projection de ce dipôle suivant ces directions. L intensité de la lumière émise par un dipôle est proportionnelle au carré de la projection de son vecteur suivant l axe d observation. On a : I // (θ, φ) = cos 2 θ (II. 3. 3) et I (θ, φ) = sin 2 θ cos 2 φ (II. 3. 4) Dans les expériences d anisotropie, la lumière d excitation est polarisée suivant z. La probabilité d excitation des fluorophores dont l orientation est distribuée aléatoirement dans l espace est indépendante de l angle φ. On a alors : <cos 2 2π φ> = 0 cos 2 2π φ dφ / 0 dφ = 1/2 (II. 3. 5) Les équations II et II deviennent alors : I // (θ) = cos 2 θ (II. 3. 6) I (θ) = 1/2 sin 2 θ (II. 3. 7) En substituant dans l équation II. 3. 1, l anisotropie s écrit sous la forme

95 r = (3 <cos 2 θ> - 1) / 2 (II. 3. 8) avec <cos 2 θ> = 0 π/2 cos 2 θ p(θ) dθ / 0 π/2 p(θ) dθ (II. 3. 9) où p(θ) correspond à la probabilité d émission d un photon par un dipôle faisant un angle θ avec l axe z. En étudiant le cas théorique particulier d une solution diluée de fluorophores parfaitement immobiles, dont l orientation est distribuée aléatoirement dans l espace, et ayant leurs dipôles d excitation et d émission parallèles, on aura des informations sur la compréhension des valeurs d anisotropie de fluorescence et de ses propriétés fondamentales. En effet, dans ce cas, p(θ) correspond simplement à la description de la photosélection à l excitation. C est le cas où la valeur de r est maximale. La probabilité d absorption d une molécule fluorescente excitée par une lumière polarisée suivant z est proportionnelle à cos 2 θ. Pour une distribution aléatoire, le nombre de molécules ayant une orientation dipolaire entre θ et θ + dθ est proportionnel à sin θ dθ. On a alors : p(θ) dθ = cos 2 θ sin θ dθ (II ) et l équation II nous donne r = 2/5 qui est la valeur maximale de l anisotropie de fluorescence, consécutive de la dépendance en cos 2 θ pour la photosélection à l excitation. Dans le cas où le dipôle d absorption fait un angle α avec le dipôle d émission, pour une population de fluorophores immobiles aléatoirement distribués, l anisotropie est le produit de la perte due à la photosélection (2/5) par la perte due au déplacement angulaire de l émission, qui, suivant l équation II. 3. 8, s écrit sous la forme 1/2 (3 cos 2 α - 1). Cette anisotropie, correspondant à une distribution aléatoire de molécules immobiles, s écrit r 0, comme anisotropie maximale ou anisotropie initiale (voir Ch. II. 3. 2) et on a : r 0 = 1/5 (3 cos 2 α - 1) (II )

96 2. Déclins d anisotropie En mesurant les déclins de fluorescence parallèlement et perpendiculairement à une excitation pulsée polarisée, l anisotropie de fluorescence, r(t), s écrit r(t) = (I // (t) - I (t)) / (I // (t) + 2 I (t)) = (I // (t) - I (t)) / I T (t) (II ) où I // (t) et I (t) sont les déclins de fluorescence parallèle et perpendiculaire à l excitation et I T (t) est le déclin total sans effet de polarisation. A ce sujet, lorsque l on mesure les déclins avec une lumière polarisée (par exemple un laser), il est possible de mesurer directement I T (t) en plaçant un analyseur à 54,7 de la polarisation d excitation (angle magique). Dans ce cas, sachant que l intensité est proportionnelle au carré de la projection du dipôle suivant l axe d observation et que 2 cos 2 (54,7) = sin 2 (54,7), l intensité récoltée correspond à I // (t) + 2 I (t). Généralement, r(t) décroît et correspond à la dépolarisation de la lumière dans le temps de la fluorescence. Ce déclin d anisotropie correspond à la perte de mémoire de l orientation initiale du système. Tout événement à l échelle moléculaire qui a pour effet de réorienter le dipôle d émission à l état excité intervient dans cette dépolarisation. L équation II s écrit aussi sous la forme I // (t) = 1/3 I T (t) (1 + 2 r(t)) (II ) et I (t) = 1/3 I T (t) (1 - r(t)) (II ) Au temps t = 0, aucun événement à l échelle moléculaire n a eu lieu, les molécules qui réémettent un photon sont considérées immobiles, et r(0) = r 0 (Eq. II ). Il est important de noter que, pour un mélange de différents fluorophores, la somme des anisotropies ne correspond pas à l anisotropie de la somme. Le déclin d anisotropie n est pas associatif. En d autres termes, pour n espèces moléculaires di férentes, on a r(t) = d i (t) r i (t) / d i (t) (II ) où d i (t) et r i (t) sont le déclin de fluorescence et l anisotropie de l espèce i, respectivement.

97 a. Effet de la diffusion rotationnelle sur l anisotropie La première cause de dépolarisation de la fluorescence est la diffusion rotationnelle des fluorophores. Après le pulse laser, les molécules excitées tournent par mouvements browniens, et la fluorescence émise a perdu la mémoire de l orientation initiale caractéristique de la photosélection à l excitation (Fig. II. 15). Photosélection Rotation Emission Dépolarisation Figure II. 15 : Dépolarisation de la fluorescence par rotation du chromophore. En tournant, le dipôle d émission du chromophore change d orientation et la lumière émise est désorientée par rapport à l excitation. Pour une population de chromophores orientés par photosélection à l excitation, les différents mouvements Browniens induisent une désorientation des dipôles et donc une dépolarisation de la fluorescence. Dans le cas simple d une molécule sphérique, le déclin d anisotropie décline monoexponentiellement suivant l équation : r(t) = r 0 exp (-t / φ) (II ) où r 0, l anisotropie initiale, est définie équation II et φ représente le temps de corrélation rotationnelle. Qualitativement, plus φ est petit et plus la molécule tourne vite, et inversement. φ correspond à l inverse de six fois le coefficient de diffusion rotationnelle. Quantitativement, ce coefficient de diffusion pour une molécule sphérique est décrit par la loi de Stokes-Einstein et dépend de la température, T, de la viscosité du milieu, η, et du volume apparent de la sphère, V. On a : φ = ηv / RT (II ) où R est la constante de Boltzman.

98 Dans le cas plus complexe d une élipsoïde, le déclin d anisotropie devient biexponentiel. En théorie, une molécule asymétrique peut être décrite par plusieurs coefficients de diffusion rotationnelle, ce qui implique un déclin d anisotropie multiexponentiel. En pratique, il devient très difficile de résoudre plus de deux temps de corrélation dans un déclin d anisoptropie. Le modèle choisi devient un simplificateur du volume apparent de la molécule étudiée. Le déclin d anisotropie peut aussi caractériser une rotation restreinte, comme par exemple le mouvement local d une partie de la protéine. Dans ce cas, il demeure une anisotropie résiduelle aux temps longs caractéristique du cône de restriction dans lequel les mouvements ont lieu. On a par exemple : r(t) = (r 0 r ) exp (-t / φ) + r (II ) où r correspond à l anisotropie résiduelle. Il demeure une limitation intrinsèque à cette approche expérimentale de l étude des déclins d anisotropie. Dans le cas où les mouvements sont considérablement longs (grosse molécule ou forte viscosité) par rapport au déclin de la fluorescence (τ << φ), l anisotropie mesurée par fluorescence r(t) r 0 et il est impossible de décrire cette situation. A l inverse, pour des mouvements très rapides par rapport à la durée de vie (φ << τ), r(t) 0. On définit la fenêtre expérimentale de temps, τ/10 < t < 10τ. b. Effet du FRET entre chromophores identiques, l homofret, sur l anisotropie La figure II. 16 schématise la dépolarisation de la fluorescence dans le temps de la durée de vie par homo-fret. Dans le cas de sauts d énergie multiples où l organisation des chromophores est aléatoire, l anisotropie devient nulle aux temps longs, les multiples sauts, appelés migration de l énergie, ont fait perdre la mémoire de l orientation initiale des dipôles excités, conséquence de la photosélection. La vitesse de déclin de l anisotropie dépend de la vitesse de transfert, et donc des distances et orientations respectives des différents donneurs et accepteurs. Dans le cas où les chromophores sont ordonnés, il peut demeurer une anisotropie résiduelle aux temps longs. Même après la migration de l énergie entre les chromophores, l état initial d organisation des chromophores demeure. Chaque cas nécessite un traitement théorique particulier avec des hypothèses sur l organisation spatiale des chromophores étudiés.

99 Photosélection HomoFRET Emission Dépolarisation Figure II. 16 : Dépolarisation de la fluorescence par transfert d énergie. En transférant son énergie à un dipôle dont l orientation est différente, la fluorescence émise est désorientée par rapport à l excitation. Pour une population de chromophores orientés par photosélection à l excitation, les différents sauts d énergie induisent une désorientation des dipôles et donc une dépolarisation de la fluorescence. Comme exemple, le modèle proposé ici consiste en un mécanisme de transfert d énergie au sein d une paire de chromophores. Ce cas plus simple a donné lieu à de multiples traitements théoriques [Tanaka, 1979; Berberan Santos, 1991; Bastiaens, 1992; Karolin, 1998]. Soit i et j la paire de chromophores, le transfert d énergie a lieu entre le dipôle initialement excité i et le dipôle j et inversement entre j et i avec une même vitesse de transfert, ω. La rotation des molécules excitées et le transfert d énergie entre i et j interviennent tous deux dans la dépolarisation de la fluorescence induite. En acceptant le fait que les fonctions de corrélation orientationnelle des molécules i et j, r i (t) et r j (t), i. e. l anisotropie associée à la rotation de ces chromophores, et la probabilité que le fluorophore initiallement excité le soit toujours au temps t, p (t), soient toutes des grandeurs indépendantes, l anisotropie de fluorescence du système peut s écrire r(t) = 1/2[r i (t) + r j (t)]p(t) + 1/2[r ij (t) + r ji (t)][1 p(t)] (II ) où r ij (t) représente la contribution dans l anisotropie du transfert d énergie entre la molécule i et la molécule j, réciproquement pour r ji (t). Dans le modèle présenté ici, qui s applique à l étude de la dimérisation d une protéine fusionnée à la GFP, nous introduisons quelques simplifications :

100 (i) les dimères sont tous identiques (configuration symétrique pour les deux chromophores) et leur orientation est aléatoire; (ii) la rotation du dimère complet dans le temps de la durée de vie est négligeable; (iii) il n y a pas de réorientation des chromophores excités (modèle statique) dans le temps de la durée de vie, i. e. le chromophore de la GFP est immobile par rapport au dimère, l angle entre les dipôles i et j est indépendant du temps. Ainsi, on a : (i) les fonctions de corrélation orientationnelle qui dépendent de la distribution locale des orientations des fluorophores i et j sont constantes, et r i (t) = r j (t) = 1/5(3cos 2 δ 1) (II ) où δ représente l angle entre le moment de transition d absorption et d émission du fluorophore (Eq. II ). (ii) dans le modèle statique, r ij (t) et r ji (t) sont constants et dérivent de θ ij and θ ji, les orientations mutuelles entre le dipôle d absorption du chromophore i et d émission du chromophore j, et entre le dipôle d absorption de j et d émission de i, respectivement : r ij (t) = 1/5(3cos 2 θ ij 1) (II ) r ji (t) = 1/5(3cos 2 θ ji 1) (II ) Pour une paire de chromophores identiques, la probabilité que le chromophore initialement excité le soit au temps t, p(t), est décrite par : p(t) = 1/2[ 1 + e 2ωt ] (II ) où ω est la vitesse de transfert. En substituant les équations II , II , II et II dans II , on a r(t) = 3/20 ( 2cos 2 δ cos 2 θ ij cos 2 θ ji ) e 2ωt + 1/20 ( 6cos 2 δ + 3cos 2 θ ij + 3cos 2 θ ji 4) (II ) comme décrit par Tanaka et Mataga [Tanaka, 1979]. Dans le cas du chromophore GFP, les moments de transitions d absorption et d émission sont parallèles. Ainsi, δ = 0, et θ ij = θ ji = θ. Le déclin d anisotropie devient r(t) = 1/10[(3 3cos 2 θ) e 2ωt + 3cos 2 θ +1] (II ) Dans la limite du modèle statique (pas de réorientation des dipôle électroniques pendant la durée de vie de la fluorescence), la vitesse de transfert dépend de la distance, R, entre les deux chromophores par

101 ω = (R 0 /R) 6 τ 1 (II ) comme décrit chapitre II. 2 (Eq. II. 2. 7). R 0, la distance de Förster est décrite équation II Ici R 0 est calculé avec <κ 2 >, le facteur d orientation qui suivant les hypothèses du modèle est égal à <κ 2 > = (cosθ 3cos 2 β) 2 (II ) où β est l angle que fait le vecteur R avec le dipôle électronique du chromophore. 3. Anisotropie stationnaire et mesure du FRET La mesure de l anisotropie stationnaire correspond à la moyenne de la valeur de r(t) pondéré par l intensité I(t), soit r = I(t) r(t) dt / I(t) dt (II ) Dans le cas caractéristique d une molécule sphérique en rotation avec un temps caractéristique de relaxation d anisotropie φ (Eq. II ) et une durée de vie τ, l équation précédente s écrit r = r 0 / (1 + τ/φ) (II ) Il est intéressant de noter que pour τ << φ (haute viscosité ou très grosse molécule) on a r = r 0, et pour τ >> φ (le contraire) on a r = 0. L équation II peut également s écrire sous la forme τ = φ (r 0 /r 1) et en le remplaçant dans l équation d efficacité de FRET par la mesure de la durée de vie du donneur (E = 1 - τ DA /τ D ) on a alors E = 1 (φ DA r D (r 0 r DA )) / (φ D r DA (r 0 r D )) (II ) avec φ D et r D le temps caractéristique de rotation et l anisotropie du donneur seul et φ DA et r DA le temps caractéristique de rotation et l anisotropie du donneur en présence de l accepteur. En mesurant l anisotropie stationnaire du donneur en présence et en absence d accepteur (par la mesure des intensités stationnaires Ipar et Iper), mesure indépendante de la concentration, et en estimant φ DA /φ D, on est capable de déterminer E.

102 Rappels de microscopie Frédéric Brau

103 Principe du microscope à épi-fluorescence et du microscope confocal Notion de pouvoir séparateur Résolution latérale Un microscope même parfait n a pas des possibilités infinies, il ne peut aller au-delà d une barrière naturelle due à la lumière elle-même. Les possibilités du microscope sont limitées par le phénomène de diffraction. De façons générale : deux points lumineux ne sont vus distincts que si leur distance est grande devant la longueur d onde de la lumière. Objectif A u O A d Image d un point lumineux monochromatique à travers un objectif de microscope assimilé à une lentille = tâche de diffraction (ou tâche d Airy) Diamètre de la tâche de diffraction dans le plan image : 1,22 λ g d = nsinu g : grandissement de l objectif = OA /OA u : angle d ouverture maximales des rayons issus de A n : indice de réfraction du milieu de l objet nsinu : ouverture numérique de l objectif Objectifs

104 Influence de l ouverture numérique de l objectif sur le diamètre de ta tâche de diffraction L image d un objet étendu résultera de la superposition de toutes les tâches de diffraction image de tous les points de l objet. En microscopie à transmission, soit l éclairage est : - incohérent dans ce cas tous les points sources indépendantes : dans le plan image toutes les tâches de diffraction vont s additionner en intensité. - Cohérent, dans ce cas tous les points sources capables d interférer : l image résulte de l interférence de toutes les tâches de diffraction. En pratique l éclairage de Köhler permet d obtenir un éclairage incohérent à condition que l ouverture du condenseur soit maximale. d Critère de Rayleigh : La limite de résolution du microscope correspond donc à la distance minimale permettant de distinguer 2 tâches de diffraction dont le maximum de l une coïncide avec le premier minimum nul de l autre, soit dans le cas d un éclairage incohérent, en transmission : d = 1, 22λ min O.N + O.N condenseur objectif Si l on considère que l ouverture du condenseur est maximale et égale à celle de l objectif (cas de l épi-illumination ou de la microscopie d épi-fluorescence : d min = 0,61λ O.N

105 Résolution axiale La résolution spatiale d un microscope n est pas homogène dans toutes les directions : elle est 2à 4 fois moins précise en profondeur que dans le plan : z = 2λ n min O.N2 Principe du microscope confocal Un diaphragme A (de diamètre équivalent à la tâche de diffraction) est placé devant la source et permet de former une source ponctuelle qui est projetée sur l échantillon. Un second diaphragme placé dans le plan focal image en conjugaison avec le diaphragme d illumination et le plan objet permet d exclure les rayons lumineux qui proviennent de l extérieur du champ de vision. Le système ne tient compte que des photons issus du plan de focalisation Schéma de principe du microscope confocal d après Minsky Afin de réaliser une image point par point de l ensemble du champ d observation il faut soit bouger l échantillon, soit balayer la source. L ajout de ces diaphragmes a pour effet de diminuer le bruit de fond et augmenter la résolution spatiale : 0,46λ 1,44 λ n d = z = O.N min O.N2 Sources d éclairage min Lampes à décharge

106 Lasers Spectres d émission d une source à vapeur de mercure et d une lampe au Xénon Principe Types de lasers Filtres et miroirs dichroïques Types de filtres : Passe bas, Passe haut, Passe bande Photodétecteurs Tubes photomultiplicateurs Principe Un photomultiplicateur est un tube de verre (ou de quartz, pour des applications dans l UV) sous vide composé : - d une surface réceptrice sensible : la photocathode, dont le matériau et la taille vont déterminer la gamme spectrale de détection, la sensibilité, l homogénéité d émission, et la quantité d électrons parasites émis. - d amplificateurs d électrons : les dynodes. Leur nombre va déterminer le gain du détecteur. - d une anode collectrice. Caractéristiques

107 Réponses spectrales caractéristiques de photocathodes en fonction de leur composition (S20 Trialkali : Na-K-Sb-Cs, Bialkali : Sb-K-Cs ou Sb-Rb-Cs, S11 : SbCs, Trialkali hautes températures : Na-K-Sb). Influences de la tension d alimentation et de la température sur le bruit thermique Modes de fonctionnement - Analogique - Comptage de coups Signal anodique Tension de référence (V ref ) Comparateur rapide V ref Monostable +12V -12V Port série PC

108 Détecteurs à semi-conducteur Photodiodes Une photodiode est un semi- conducteur formé par une simple jonction P-N photo réceptrice. Lorsque les photons pénètrent dans le semi conducteur, ils peuvent créer des photoporteurs en excès dans le matériau. Ces photo- porteurs sont des paires d'électrons - trous. Chaque paire créee se traduit par la circulation dans le circuit extérieur d'une charge élémentaire. On observe ainsi une augmentation du courant. Dans l'obscurité elle laisse passer, comme toute diode, un faible courant inverse. Ce courant s'appelle le courant d'obscurité Is. Lorsqu'on éclaire la jonction il y a formation d'un courant photoélectrique qui vient s'ajouter au courant d'obscurité. Ce courant, de l'ordre de quelques µa est pratiquement indépendant de la tension inverse au-delà d'un ou deux volts. CCD (Charge Coupled Device) Un CCD, est une structure MOS ou MIS (Métal Isolant Semiconducteur) qui peut collecter, stocker et transférer des paquets localisés de porteurs de charge le long d'une l'interface semiconducteur - isolant. Le concept du CCD, est basé sur le principe du transfert pas à, pas des charges photo-électroniques créées par la lumière dans chaque pixel, jusqu'en un point de sortie unique. Les différentes architectures : - Full Frame transfert - Frame transfert - Interline transfert Les possibilités offertes par ce composant : "binning" Imagerie de plusieurs flurochromes Modes opératoires en microscopie confocale : - acquisitions simultanées - acquisitions séquentielles : par image, par ligne

109 PMT 3 PMT 2 M 4 M 7 F F M 5 M 6 F D E 2 560LP 2 IN 2 440LP M 3 M 1 M 2 D 1 T 1 488/568/647 UBHS UV/488 B 1 20/80 IN 1 380LP Lasers 351 nm 363 nm 488 nm 514 nm 543 nm 633 nm Microscope PMT 1 Schéma optique de l'optique de détection du confocal MRC1024 Biorad Nouvelles fonctionnalités des microscopes confocaux Modules acousto-optiques Schéma de principe d'un module acousto-optique Détection spectrale : Monochromateurs, détecteurs linéaires. Schéma de principe de l'optique de détection du microscope confocal Leica TCS SP2

110 Choix du couple donneur-accepteur : quelques pistes Aude Jobart-Malfait Plateforme de recherche «Imagerie des processus dynamiques en Biologie Cellulaire et Biologie du Développement» IFR 117 Institut Jacques Monod Tel: jobart@ijm.jussieu.fr Qu est-ce qu un bon couple..? Contraintes spectrales intrinsèques au couple Notion de Ro, J, Contrainte associées à la mise en oeuvre Caractéristiques du fluorophore Résistance au photoblanchiment, Utilisation en cellules vivantes, Oligomérie, Caractéristiques spectrales utilisables, Propriété du déclin de fluorescence, etc.. Mode de couplage Anticorps, protéine de fusion, Molecular Beacons Stœchiométrie 1

111 Efficacité de Transfert et notion de R o E : Efficacité de transfert = proportion de molécules qui reviennent de l état excité à l état fondamental par un phénomène de FRET Ro : distance de Förster = distance entre les chromophores pour laquelle il y a 50 % d efficacité de transfert R : distance entre les fluorophores 24 Å Efficacité transfert % E = 1 / (1+(R/R 0 ) 6 ) R 0 = 40 Å R (Angström) 42 Å d 20 Å Plus R o est grand plus la probabilité d avoir du FRET sera importante! Calcul de la distance de Förster (Ro) Distance entre les chromophores pour laquelle il y a 50 % d efficacité de transfert R o6 = (9.(ln10).κ 2.Q D.J) / (128π.5N.n 4 ) R o = (8, J.Q D.n -4.κ 2 ) 1/6 J : recouvrement des spectres d émission du donneur et d absorption de l accepteur Q D : rendement quantique du donneur n : indice de réfraction du milieu κ 2 : facteur d orientation -> fonction de l orientation entre les dipôles électroniques d émission du donneur et de l accepteur Pas d orientation privilégiée -> κ 2 =2/3 2

112 Calcul du recouvrement spectral (J) recouvrement des spectres d émission du donneur et d absorption de l accepteur Emission Donneur Absorption Accepteur 60 F D (λ).ε A (λ).λ 4.dλ J= F D (λ).dλ λ = longueur d onde F D (λ)= spectre d émission du donneur ε A (λ) = coefficient d extinction molaire de l accepteur à la longueur d onde λ Concrètement Calcul du R o pour le couple Alexa 488-Alexa 568 Avec un peu de chance : Récupération du Ro sur Pour les Alexa Emission Donneur Sinon : Récupérer le spectre d émission de l accepteur, le coefficient d extinction molaire de l accepteur, le spectre d absorption du donneur, le rendement quantique du donneur Absorption Accepteur 60 Q D =0.8 ε (578) = cm -1 M

113 Calcul du R o pour le couple Alexa 488-Alexa J= F D (λ)ε A (λ)λ 4 dλ / F D (λ) dλ Emission Donneur ε (578) = cm -1 M -1 Spectre d absorption normalisé Absorption Accepteur x ε A (λ) ε A (λ)λ 4 ε (578) = cm -1 M -1 x Calcul du Ro pour le couple Alexa 488-Alexa J= F D (λ)ε A (λ)λ 4 dλ / F D (λ) dλ Emission Donneur F D (λ) ε A (λ)λ Emission Donneur 40 6 x X F D (λ)ε A (λ)λ x J= 1, /4970=

114 Calcul du Ro pour le couple Alexa 488-Alexa 568 R o = (8, J.Q D.n -4.κ 2 ) 1/6 R o = 52,85 A A une distance de 53 Å: FRET La probabilité de désexcitation par un phénomène de FRET est de % des molécules à l état excité revient à l état fondamental par un processus de FRET Émission Conversion Quenching d= 53 Å Contraintes associées à la mise en œuvre Macromolécules d intérêt Lipide Protéine ADN Type d échantillon In vitro In vivo Cellules fixées Cellules vivantes Tissu entier Petit animal? Sondes et mode de couplage Molecular beacons Protéines de fusion Couplage chimique Techniques utilisées Immunofluorescence Déclin de fluorescence Photoblanchiment Nanocristaux 5

115 Synthèse des protéines de fusion Expression de la protéine d intérêt fusionnée à une protéine fluorescente : GFP, DsRed, CFP, YFP A Protéine d intérêt Biologie moléculaire Amplification de l ADN de la protéine étudiée Digestion du vecteur par des enzymes Déphosphorylation Liguation Transformation Criblage Transcription EGFP A Biologie cellulaire Transfection Micro-injection GFP Traduction A Structure des protéines de fusion 24 Å La Green Fluorescent Protein 42 Å Méduse Aequorea victoria 27 kda Chromophore = 3 acides aminés Ser65, Tyr66, Gly67 Tonneau (11 feuillets β antiparallèles) entourant une hélice alpha porteuse du chromophore Tendance à dimériser lorsque fortes concentrations Création d une GFP monomérique Zhang et al., Nat. Rev., 2002, 3 :

116 Les variants de la GFP BFP CFP GFP YFP citrine 445 nm 529 nm Développement de protéines - sensibles à leur environnement ( ph) + brillantes + photo-stables Structure des protéines de fusion La DsRed Anémone Discosoma striata Chromophore = Tyr66, Gly67 Importance des acides aminés adjacents Même structure en tonneau que la GFP 11 feuillets β antiparallèles entourant une hélice alpha porteuse du chromophore Tétramère de DsRed De nombreux inconvénients : Protéine tétramérique Agrégats, toxicité Maturation lente Présence d une forme verte 7