PROGRES DANS LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE. Les tests immunologiques (IGRAs et test de cytométrie) Division of Immunology and Allergy

Transcription

1 Division of Immunology and Allergy PROGRES DANS LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE Les tests immunologiques (IGRAs et test de cytométrie) Dr Alexandre Harari, PD

2 PROGRES DANS LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE Les tests immunologiques (IGRAs et test de cytométrie) Dr Alexandre Harari, PD Service d immunologie et allergie

3 Les tests immunologiques (IGRAs et test de cytométrie) Principe des IGRAs, ELISA Vs. ELISpot Tests commerciaux et test CHUV Limites des tests et impératifs logistiques TB-Flow Principe du test Performances du test et valeur seuil Améliorations en cours Logistique

4 Principe des tests TST et IGRAs TST (Mantoux) Mesure de la réaction cutanée après 3 jours IGRA (IFN-γ release assay) Mesure de la production d IFN-γ après 16-24h Lewinsohn DA. Curr Opin Pediatr 2010

5 TST vs. IGRAs False Positives People who have received the BCG vaccine will show up positive People exposed to bacteria in environment will show up positive False Negatives skin reaction is a very crude measure. Small responses not picked up (real problem in immunosuppressed patients) commonly negative in active disease (only 75-90% sensitivity. Worse in immunosuppressed). T-SPOT.TB is very specific: Specificity 99.9% T-SPOT.TB does not give false positive in people with prior BCG vaccination T-SPOT.TB does not cross-react with common non-tuberculous (atypical) mycobacteria T-SPOT.TB is very sensitive: Sensitivity 97.9% picks up infected people missed by the skin test works even in immunosuppressed populations picks up new infection earlier than the skin test works well in children and infants maintains sensitivity even in active TB, including all types of extrapulmonary TB

6 Young DB. Nat Med 2003;9:503-4 ESAT-6/CFP10 Absents chez M. bovis (BCG) mais présents chez M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. marinum...

7 IGRAs are Extremely Specific in Discriminating Mtb Infection from Vaccination Tuberculose complex ESAT-6 CFP 10 M tuberculosis + + M africanum + + Environmental mycobacteria ESAT-6 CFP-10 M kansasii + + M marinum + + M szulgai + + M bovis + + BCG - - M abcessus, M avium, M branderi, M celatum, M chelonae, M fortuitum, M gordonii, M intracellulare, M malmoense, M oenavense, M scrofulaceum, M smegmatis M terrae, M vaccae, M xenopi - - M leprae + + Region of difference (RD)-1 ESAT-6: Early Secreted Antigenic Target (6kDa-95aa) CFP-10: Culture Filtrate Protein (10kDa-100aa) Andersen P et al. Lancet 2000;356:

8 Principe des différents IGRAs Sang complet (ELISA) Antigènes ou Lymphocytes (ELISpot) ESAT-6 et CFP-10 ELISA Dosage de l IFN-γ dans le milieu (pg/ml) incubation (16-20h) Sécrétion d IFN-γ ELISPOT Détermination du nombre de cellules produisant de l IFN-γ ELISA ELISPOT Lalvani A. Br Med Bull 2010

9 IGRAs commerciaux ELISA: QuantiFERON ELISpot: T-Spot

10 Isolation des lymphocytes Comptage des lymphocytes Mise en plaque + antigènes Lavage Révélation spot Comptage des spots

11 Exemples de résultats ELISpot Neg CTRL «Mtb» Pos CTRL

12 Différences entre l ELISpot commercial (T-Spot) et celui du CHUV Paramètres T-Spot Test CHUV Nombre de cellules/puits Nombre de puits/condition (réplicats) 1 3 Contrôle qualité interne oui Critères de positivité 8 spots/ puits de plus que le CTRL négatif > 55 spots/ 10 6 cellules ET >4 fois supérieur au CTRL négatif

13 Différences entre l ELISpot commercial (T-Spot) et celui du CHUV Scénario 1 Scénario 2 Scénario 3 CTRL négatif (non stimulé) ESAT-6 ou CFP- 10 Négatif Positif Positif pour T-Spot Négatif pour CHUV

14 Logistique et limites des tests IGRAs La qualité des résultats des tests IGRAs est affectée si le sang n est pas isolé dans les 6 heures Le sang doit parvenir au labo avant 14h30. Besoin de 2 tubes de sang (EDTA) de 9ml Les résultats sont fourni en 24-36h (sauf vendredi) En cas d urgence un vendredi, faire un prélèvement le lundi suivant permet d obtenir les résultats plus rapidement Les tests IGRAs ne distinguent pas une TB active d une infection latente

15 Predictive value of interferon-γ release assays for incident active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis Molebogeng X Rangaka, Katalin A Wilkinson, Judith R Glynn, Daphne Ling, Dick Menzies, Judith Mwansa-Kambafwile, Katherine Fielding, Robert J Wilkinson, Madhukar Pai Summary Background We aimed to assess whether interferon-γ release assays (IGRAs) can predict the development of active tuberculosis and whether the predictive ability of these tests is better than that of the tuberculin skin test (TST). Methods Longitudinal studies of the predictive value for active tuberculosis of in-house or commercial IGRAs were identified through searches of PubMed, Embase, Biosis, and Web of Science and complementary manual searches up to June 30, Eligible studies included adults or children, with or without HIV, who were free of active tuberculosis at study baseline. We summarised incidence rates in forest plots and pooled data with random-effects models when appropriate. We calculated incidence rate ratios (IRR) for rates of disease progression in IGRA-positive versus IGRA- negative individuals. Findings 15 studies had a combined sample size of participants. Incidence of tuberculosis during a median follow-up of 4 years (IQR 2 6), even in IGRA-positive individuals, was 4 48 cases per 1000 person-years. Seven studies with no possibility of incorporation bias and reporting baseline stratification on the basis of IGRA results showed a moderate association between positive results and subsequent tuberculosis (pooled unadjusted IRR 2 10, 95% CI ). Compared with test-negative results, IGRA-positive and TST-positive results were much the same with regard to the risk of tuberculosis (pooled IRR in the five studies that used both was 2 11 [95% CI ] for IGRA vs 1 60 [ ] for TST at the 10 mm cutoff ). However, the proportion of IGRA-positive individuals in seven of 11 studies that assessed both IGRAs and TST was generally lower than TST-positive individuals. Interpretation Neither IGRAs nor the TST have high accuracy for the prediction of active tuberculosis, although use of IGRAs in some populations might reduce the number of people considered for preventive treatment. Until more predictive biomarkers are identified, existing tests for latent tuberculosis infection should be chosen on the basis of relative specificity in different populations, logistics, cost, and patients preferences rather than on predictive ability alone. Funding Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (WHO), Wellcome Trust, Canadian Institutes of Health Research, UK Medical Research Council, and the European and Developing Countries Clinical Trials Partnership. Vol 12 January 2012

16 Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb (ESAT-6 ou CFP-10) + BFA Les cytokines sont produites mais restent intracellulaires L analyse par cytométrie permet de distinguer les lymphocytes T CD4 et CD8 et de mesurer, en plus de l IFN-γ, la production du TNF-α et de l IL-2

17 Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb IFN-γ TNF-α IL-2

18 Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb

19 Cas Clinique N 2 Patiente d origine camerounaise Etat fébrile avec T à 40 Perte de 20 kg de poids Insuffisance rénal chronique terminale Insuffisance hépatocellulaire sur Hépatite C chronique Thrombopénie Syndrome hémophagocitaire Dr Jesica Mazza Stalder

20 Pattern miliaire Dr Jesica Mazza Stalder

21 Dr Jesica Mazza Stalder

22 Dr Jesica Mazza Stalder

23 Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb

24 Analyse du profile fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques à Mtb

25 Schematic Overview Stimulations with Mtb antigens Analysis of the functional profile of Mtb-specific CD4 T cells TNF-α Latent Mtb Infection LT4 TNF-α IFN-γ IL-2 IFN-γ IL-2 Polyfunctional profile (simultaneous production of TNF-α, IL-2 and IFN-γ) LTBI TNF-α Active TB disease TNF-α Dominant single TNF-α production TB disease LT4 IFN-γ IL-2 Rozot V. et al, Med Sci, 2011

26 Analyse Statistique Détermination du seuil de% des Mtb-specific single-tnf-α CD4 T cells Pourcentage de Mtb-specific single-tnf-α CD4 T cells < 37.4% infectionlatente 37.4% TBactive

27 Validation du test avec une nouvelle cohorte

28 Comparison avec la Clinique

29 Comparison avec la clinique

30 Sensitivity: 67% Specificity: 92% Positive predictive value: 80% Negative predictive value: 92.4%

31 Logistique pour le test TB-Flow Le sang doit être isolé dans les 6 heures Le sang doit parvenir au labo avant 14h30. Besoin de 2 tubes de sang (EDTA) de 9ml Les résultats sont fourni en 48-72h (sauf vendredi) En cas d urgence un vendredi, faire un prélèvement le lundi suivant permet d obtenir les résultats plus rapidement

32 Remerciements Service d immunologie et allergie Virginie Rozot Gonzalo Tapia Matthieu Perreau Vincent Aubert Giuseppe Pantaleo Service des maladies infectieuses Matthias Cavassini Thierry Calandra Service de pneumologie Jesica Mazza Stalder Laurent Nicod Institute de microbiologie Katia Jaton Service de médecine du personnel Michael Currat Catherine Lazor Blanchet Center d Epidémiologie Mohamed Faouzi Université de Cape Town Cheryl L. Day Willem A. Hanekom